藍(lán)刺頭對(duì)去卵巢大鼠血清P1NP、β-CTX及TNF-α、IL-1β、IL-6的影響

方 婷, 董重陽,任存霞

(1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)學(xué)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010059;2.呼和浩特市中醫(yī)蒙醫(yī)醫(yī)院,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010010)

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥(Postmenopausal osteoporosis,PMOP)常發(fā)病于女性絕經(jīng)后5～10年內(nèi),以骨皮質(zhì)變薄及骨密度減低為主要病理改變,以雌激素水平下降為主要病因,中晚期出現(xiàn)疼痛、骨折為主要癥狀的代謝性骨病[1]。本病嚴(yán)重地影響老年人的身體健康和生活質(zhì)量。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的很多藥物都是來自于天然,如果能從這些傳統(tǒng)民族藥物中發(fā)現(xiàn)能夠防治PMOP的藥材,對(duì)其不斷研究,相信PMOP給患者帶來的痛苦一定會(huì)得到減輕,且防治同時(shí)不會(huì)引起機(jī)體其他病變。諸多文獻(xiàn)表明蒙藥亦能夠有效的提高PMOP患者的骨密度、改善全身疼痛等癥狀,且具備資源豐富、療效顯著、不良反應(yīng)少等優(yōu)勢(shì),治療 PMOP方面值得推廣。蒙藥藍(lán)刺頭(Echinops latifolius)首次記載于蒙醫(yī)醫(yī)典《智慧文鑒》中,其藥性涼,味苦,功效為接骨、愈傷、固骨質(zhì)、清熱和止痛。臨床中常用于骨傷熱、筋骨折傷、金創(chuàng)及疼痛等病癥的治療[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)其在防治PMOP方面療效確切,且靶點(diǎn)豐富,機(jī)制清楚。骨代謝標(biāo)志物Ⅰ型前膠原N端前肽(P1NP)和Ⅰ型膠原羧基端肽 β 特殊序列 (β-CTX)是監(jiān)測(cè)骨轉(zhuǎn)換的重要指標(biāo),具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn),近年來應(yīng)用日趨廣泛。炎癥反應(yīng)已被證實(shí)可以導(dǎo)致過度的骨吸收進(jìn)而破壞骨平衡[3]?；谝酝芯?本文研究了蒙藥藍(lán)刺頭對(duì)去卵巢大鼠血清骨代謝標(biāo)志物P1NP和β-CTX以及炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的影響,主要目的為闡明其抗骨質(zhì)疏松作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 主要儀器：本研究所用主要儀器包括臺(tái)式離心機(jī)(TGL-16c上海安亭科學(xué)儀器廠),酶標(biāo)分析儀(AMR-100 杭州奧盛儀器有限公司),正置顯微鏡(NIKON ECLIPSE CI日本尼康公司)等。

1.1.2 主要藥品與試劑：蒙藥藍(lán)刺頭煎湯按 4∶2∶1 的比例制備為高、中、低劑量組;淫羊藿(Herb epimedii)顆粒,由廣東一方制藥有限公司生產(chǎn),產(chǎn)品批號(hào)：A2025881。大鼠P1NP ELISA試劑盒(MM-20710R1酶免生物),大鼠β-CTX ELISA試劑盒(MM-20172R1酶免生物),大鼠TNF-α試劑盒(MM-0180R1酶免生物),大鼠IL-6試劑盒(MM-0190R1酶免生物),大鼠IL-1β試劑盒(MM-0047R1酶免生物)等。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：4月齡清潔級(jí)健康雌性SD系未孕大鼠72只,重量為(250±20)g,購(gòu)買于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SYXK(蒙)2020-0003。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組、造模與給藥：將72只大鼠常規(guī)飼養(yǎng)7 d后按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、藍(lán)刺頭高劑量組、藍(lán)刺頭中劑量組、藍(lán)刺頭低劑量組、淫羊藿組,共六組,每組12只。選取大鼠卵巢摘除法(去勢(shì))制備絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠模型[4]。異氟烷吸入麻醉后,開腹找到卵巢,進(jìn)行切除、結(jié)扎止血,最后將腹腔內(nèi)容物復(fù)位,逐層縫合,消毒處理。假手術(shù)組只切除卵巢周圍少量脂肪組織。參照人鼠體重比例及人鼠代謝比率計(jì)算：藍(lán)刺頭高中低劑量組分別為：13、6.5、3.25 mg/ml。其中藍(lán)刺頭低劑量組為臨床等效劑量。淫羊藿組給藥劑量為成人的有效劑量：23.4375 mg/ml。除外模型組和假手術(shù)組給予0.9%氯化鈉溶液灌胃。其余組灌胃體積以大鼠體重每100 g/2 ml計(jì)算得出,每天1次,連續(xù)3個(gè)月。

1.2.2 大鼠造模成功的判定：觀察陰道脫落細(xì)胞是用于判斷嚙齒動(dòng)物的動(dòng)情周期的一種可靠方法[5],實(shí)驗(yàn)大鼠在造模后4 d內(nèi)行陰道涂片以判斷造模是否成功。

1.2.3 大鼠股骨近端骨密度的檢測(cè)：末次灌胃1 d后,各組大鼠予以腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉,采血取骨,應(yīng)用Micro-CT檢測(cè)大鼠處理后的右側(cè)股骨近端骨密度(BMD)。

1.2.4 血清P1NP、β-CTX檢測(cè)：用酶聯(lián)免疫法(ELISA法)測(cè)定血清P1NP、β-CTX的含量。于腹主動(dòng)脈采血約6 ml,4 ℃冰箱靜置2 h后進(jìn)行離心(3000 r/min),20 min后收集血清,按照試劑盒說明書操作。

1.2.5 血清TNF-α、IL-1β、IL-6檢測(cè)：采用酶聯(lián)免疫法(ELISA法)測(cè)定血清TNF-α、IL-1β、IL-6的含量。于腹主動(dòng)脈采血約6 ml,4 ℃冰箱靜置2 h后進(jìn)行離心(3000 r/min),20 min后收集血清,按照試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 25.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)先進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn),符合正態(tài)分布和方差齊條件時(shí)兩組間比較應(yīng)用t檢驗(yàn),不符合正態(tài)分布和方差不齊時(shí)采用校正的t檢驗(yàn);α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 陰道脫落細(xì)胞觀察 結(jié)果顯示：大鼠正常的動(dòng)情周期包括動(dòng)情前期、動(dòng)情期、動(dòng)情后期、動(dòng)情間期,持續(xù)4～5 d。本次研究中假手術(shù)組可見動(dòng)情周期規(guī)律交替,持續(xù)4 d;模型組4 d之內(nèi)未出現(xiàn)動(dòng)情周期規(guī)律性變化,提示PMOP大鼠模型造模成功[6](圖1)。

圖1 大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片(HE染色,×100)

2.2 各組大鼠BMD測(cè)定結(jié)果 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠股骨近端的BMD明顯下降(P<0.05);與模型組相比,藍(lán)刺頭高劑量組、藍(lán)刺頭中劑量組、藍(lán)刺頭低劑量組、淫羊藿組的BMD均有升高(P<0.05)。見圖2、3、表1。

表1 各組大鼠股骨近端BMD(mg/cm3)

圖2 假手術(shù)組股骨近端Micro-CT顯示圖

圖3 模型組股骨近端Micro-CT顯示圖

2.3 各組大鼠血清P1NP和β-CTX測(cè)定結(jié)果 與假手術(shù)組相比,模型組的P1NP和β-CTX顯著升高(P<0.01)。與模型組比較,藍(lán)刺頭高劑量組、藍(lán)刺頭中劑量組、藍(lán)刺頭低劑量組和淫羊藿組P1NP和β-CTX均下降(P<0.05),但以藍(lán)刺頭高劑量組下降最明顯。說明蒙藥藍(lán)刺頭對(duì)于P1NP和β-CTX的影響趨勢(shì)為劑量依賴型。見表2。

表2 各組大鼠血清P1NP、β-CTX含量比較

2.4 各組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α測(cè)定結(jié)果 與假手術(shù)組相比,模型組大鼠血清IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度均明顯升高(P<0.01)。與模型組相比,各組IL-1β、IL-6、TNF-α的濃度均降低(P<0.05)。藍(lán)刺頭高劑量組與中劑量組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。藍(lán)刺頭低劑量組與淫羊藿組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。高、中劑量組藍(lán)刺頭降低PMOP模型大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β濃度的藥效強(qiáng)于淫羊藿。見表3。

表3 各組大鼠血清中IL-1β、IL-6、TNF-α濃度比較(ng/L)

3 討 論

蒙醫(yī)學(xué)在治療PMOP方面有其獨(dú)特的自身優(yōu)勢(shì),具有療效與安全兼?zhèn)涞奶攸c(diǎn),其發(fā)展前景廣闊。傳統(tǒng)蒙醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis,OP)的發(fā)病原因主要在于腎虛則骨濡養(yǎng)不及而出現(xiàn)骨枯,治療原則宜以“補(bǔ)暖補(bǔ)精、抑赫依過剩、固骨質(zhì)”為主。經(jīng)過眾多醫(yī)家多年以來針對(duì)蒙藥藍(lán)刺頭的臨床運(yùn)用探索,發(fā)現(xiàn)其對(duì)PMOP的防治不僅效果明顯,而且安全、不良反應(yīng)少,作用機(jī)制豐富獨(dú)特,主要包括抗炎、抗氧化應(yīng)激、增加骨量、減少骨丟失和雌激素樣作用[7]。

骨代謝平衡是成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞之間的一種動(dòng)態(tài)狀態(tài),當(dāng)這種狀態(tài)被破壞后就會(huì)致使骨重建及代謝失衡,誘發(fā)多種骨病[8]。P1NP及β-CTX是兩種具有高度敏感性的骨代謝標(biāo)志物[9],是衡量骨轉(zhuǎn)換的敏感指標(biāo),可以反映骨代謝過程[10-11]。而BMD一般要在治療6個(gè)月后才能用以評(píng)判療效[12-13],因此在監(jiān)測(cè)療效方面,骨代謝標(biāo)志物有著重要意義。可以通過檢測(cè)血清中這些指標(biāo)的變化來早期判斷骨重塑的情況。P1NP 是由活化的成骨細(xì)胞釋放,其在血清中的含量可以反映成骨細(xì)胞合成骨膠原的能力[14],是骨形成的敏感指標(biāo);而β-CTX 是在骨吸收過程中Ⅰ型膠原分解后釋放入血的一種片段,可以用以判斷破骨細(xì)胞的活性,是骨吸收的特異指標(biāo)[15]。研究顯示與非骨質(zhì)疏松患者相比,骨質(zhì)疏松患者的P1NP和β-CTX明顯升高[16]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與假手術(shù)組相比,模型組大鼠P1NP和β-CTX均升高。這也與趙和平[17]研究結(jié)果一致：PMOP患者血清P1NP、β-CTX水平高于正常者。而經(jīng)蒙藥藍(lán)刺頭治療90 d后,其各劑量組血清P1NP、β-CTX水平均有下降,且為劑量依賴型。表明蒙藥藍(lán)刺頭可以抑制骨吸收,增加骨量,有助于維持骨代謝平衡,進(jìn)而防治PMOP。

PMOP 發(fā)病涉及系統(tǒng)性炎癥激活[18]。而炎癥反應(yīng)已被證實(shí)可以導(dǎo)致過度的骨吸收進(jìn)而破壞骨平衡[19]。IL-6和TNF-α是強(qiáng)烈的骨吸收刺激因子,TNF-α在破骨細(xì)胞生成中起著正向作用,可以促進(jìn)骨吸收,引起骨量減少[20]。IL-6 可直接作用于成骨細(xì)胞,抑制其活性,減少骨形成;也可以促進(jìn)破骨細(xì)胞生成,加強(qiáng)骨吸收,加重骨量流失,誘發(fā)骨質(zhì)疏松[21]。有學(xué)者指出,IL-6、TNF-α對(duì)骨吸收具有增益效應(yīng)[22]。IL-1β也是PMOP的誘因之一,當(dāng)絕經(jīng)后體內(nèi)雌激素水平下降時(shí),一方面IL-1β降低骨保護(hù)素的表達(dá),進(jìn)而抑制骨形成;另一方面IL-1β 也可直接通過RANKL誘導(dǎo)破骨細(xì)胞的分化成熟,促進(jìn)骨吸收。研究發(fā)現(xiàn)：經(jīng)雌激素治療后的PMOP患者體內(nèi)IL-1水平低于未經(jīng)治療的PMOP患者[23]。在本實(shí)驗(yàn)中,研究結(jié)果顯示：摘除卵巢后的大鼠模型體內(nèi)的TNF-α、IL-6、IL-1β的含量高于假手術(shù)組,這正與袁顯群[24]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果吻合。而經(jīng)過蒙藥藍(lán)刺頭治療后的大鼠血清中的TNF-α、IL-6、IL-1β明顯下降,并且低劑量的蒙藥藍(lán)刺頭與淫羊藿在降低PMOP模型大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β的藥效相當(dāng)。高小明等[25]通過實(shí)驗(yàn)也證明蒙藥藍(lán)刺頭可以降低去勢(shì)模型大鼠的炎癥因子含量。而本實(shí)驗(yàn)研究說明：蒙藥藍(lán)刺頭各劑量組可以通過降低PMOP患者血清炎性因子的含量,進(jìn)而減少骨吸收,促進(jìn)骨形成,增加骨量,達(dá)到防治PMOP的作用。