HILIC-HPLC法檢測三乙烯四胺銅的含量

廖欣怡,曹 雅,楊雅楠,仇麗穎

(西南民族大學(xué)藥學(xué)院,四川 成都 610225)

三乙烯四胺銅(Triethylenetetramine copper,TETA-Cu)是一種由三乙烯四胺(triethylenetetramine,TETA)與二價銅經(jīng)絡(luò)合反應(yīng)形成的金屬絡(luò)合物[1],化合物能通過自身的整體轉(zhuǎn)運(yùn)增加心肌細(xì)胞中銅的積累.很多動物及臨床實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),病理性心肌肥大和心梗發(fā)生時存在銅從心臟流失的現(xiàn)象,補(bǔ)充銅后可逆轉(zhuǎn)心肌肥大,也可部分恢復(fù)因心梗導(dǎo)致的心臟功能下降問題[12-13].TETA-Cu能促進(jìn)心臟梗死區(qū)和邊緣區(qū)的銅的積累,修復(fù)受損心肌細(xì)胞中銅的失衡狀態(tài)[14].因此TETA-Cu對治療心肌梗死等缺血性心臟疾病具有較大的潛力.

目前,該化合物正處于新藥研發(fā)初始階段,尚沒有質(zhì)量控制方法的相關(guān)報道.無論是原料藥合成、制劑開發(fā),還是藥代動力學(xué)研究均需要一種對TETA-Cu準(zhǔn)確定量的分析方法.截至目前,僅有一篇文獻(xiàn)報道了TETA-Cu的檢測方法[2].在這項(xiàng)研究中,采用超高分辨率飛行時間質(zhì)譜法對TETA-Cu進(jìn)行定性檢測,卻沒有提到有關(guān)TETA-Cu的定量檢測方法.該方法雖然靈敏度極高,但儀器價格昂貴,操作復(fù)雜且通常需要專人操作,因此不適用于藥物的常規(guī)定量分析.

TETA-Cu在260 nm的紫外波長下有最大吸收,可采用紫外檢測器以高效液相色譜法檢測.此外,TETA-Cu是一種極性很強(qiáng)的水溶性化合物,難以通過RP-HPLC保留和分離,因此本文開發(fā)了一種HILIC-HPLC方法用于TETA-Cu的檢測分析.HILIC全稱親水作用色譜(Hydrophilic interaction chromatography),是一種能將強(qiáng)極性物質(zhì)保留下來的分離手段.它通過采用強(qiáng)極性的固定相,并利用水及與水互溶的有機(jī)相,如甲醇、乙腈等有機(jī)溶劑作為流動相實(shí)現(xiàn)對強(qiáng)極性物質(zhì)的保留和分離.因?yàn)檫@一特性,HILIC色譜柱在有機(jī)酸、組胺、水溶性維生素等極性物質(zhì)的分離有著廣泛的應(yīng)用.這一色譜技術(shù)的出現(xiàn)彌補(bǔ)了反相色譜對極性物質(zhì)保留作用弱、保留時間短的現(xiàn)象.本文采用HILIC-HPLC法測定TETA-Cu的含量,方法簡便,快速,準(zhǔn)確,為今后TETA-Cu的新藥研發(fā)提供有價值的質(zhì)量控制方法.

1 實(shí)驗(yàn)與方法

1.1 試劑與儀器

實(shí)驗(yàn)試劑:乙腈(色譜純,諾爾施科技有限責(zé)任公司)、甲醇(色譜純,諾爾施科技有限責(zé)任公司)、戊烷磺酸鈉(純度99%,上海阿拉丁公司)、氫氧化鈉(純度95%,科隆化學(xué)試劑有限公司)、鹽酸(分析純,科隆化學(xué)試劑有限公司)、TETA-Cu供試品(自制)、TETA-Cu對照品(自制,含量大于99%),實(shí)驗(yàn)用水為超純水.

實(shí)驗(yàn)儀器:高效液相色譜儀(島津Essentia LC-16,配紫外檢測器SPD-16,溶液輸送單元LC-16);色譜柱Agilent ZORBAX RR HILIC Plus(4.6 × 100 mm,3.5 μm)(安捷倫科技有限公司);Agilent Polaris NH2HPLC column(4.6 × 250mm,5 μm)(安捷倫科技有限公司);Chromplus C18(4.6 × 150 mm,5 μm)(成都思為科學(xué)儀器有限公司);KQ5200DB超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司);ME 55型電子分析天平(梅特勒托利多科技有限公司).

1.2 溶液的制備

對照品溶液:精密稱定TETA-Cu對照品適量,用水溶解并稀釋成不同濃度梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液(0.05、0.1、0.2、0.5、1 mg/mL).

供試品溶液:精密稱取TETA-Cu供試品0.012 5 g,置于25 mL容量瓶中用水溶解并稀釋至刻度,搖勻,得到濃度為0.5 mg/mL的供試品溶液,用于供試品溶液穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn);取不同批次的TETA-Cu,分別精密量取0.007 5 g,置于25 mL容量瓶中用水溶解并定容至刻度,搖勻,得到濃度為0.3 mg/mL的溶液,用于含量測定.

1.3 色譜條件

色譜柱為;以乙腈-水為流動相,梯度洗脫程序?yàn)?0～10 min乙腈5 %～100 %,10～15 min乙腈;紫外檢測波長為260 nm;進(jìn)樣量10 μL;流速為1 mL/min;柱溫為室溫;理論塔板數(shù)按TETA-Cu峰計應(yīng)不低于5 000,外標(biāo)法定量.

1.4 線性、范圍、檢測限和定量限

取“1.2”項(xiàng)下不同濃度梯度的對照品溶液,按照“1.3”項(xiàng)下的條件、按照低濃度至高濃度的順序進(jìn)行測定.以TETA-Cu的濃度為橫坐標(biāo)x,色譜峰面積為縱坐標(biāo)y,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,計算回歸方程及相關(guān)系數(shù);將對照品溶液稀釋,以信噪比為10∶1時對應(yīng)的濃度確定為定量限;信噪比為3∶1時對應(yīng)的濃度確定為檢測限.

1.5 加樣回收試驗(yàn)

在已知濃度為0.3 mg/mL的TETA-Cu供試品溶液中,分別精密加入對照品適量,配制成低、中、高濃度為0.54、0.60、0.66 mg/mL的溶液,每個濃度平行制備三份,用“1.3”項(xiàng)下的條件進(jìn)樣檢測,記錄峰面積,計算回收率和RSD.

1.6 精密度考察

1.6.1 重復(fù)性

精密稱取TETA-Cu對照品0.002 5、0.012 5、0.020 0 g,置于25 mL容量瓶中,用水溶解并稀釋至刻度,搖勻,得到低、中、高濃度為0.1、0.5、0.8 mg/mL的對照品溶液.每個濃度平行制備三份,按照“1.3”項(xiàng)下的條件連續(xù)進(jìn)樣,記錄色譜圖和峰面積,計算峰面積的RSD來考察方法的重復(fù)性.

1.6.2 中間精密度

按照“1.6.1”項(xiàng)下方法連續(xù)五天配制低、中、高濃度的對照品溶液三份,按照“1.3”項(xiàng)下的條件進(jìn)樣,記錄色譜圖和峰面積,計算峰面積的RSD來考察方法的中間精密度.

1.7 專屬性考察

1.7.1 酸水解試驗(yàn)

精密稱取TETA-Cu供試品0.1 g,加入5 mL 0.1 mol/L鹽酸溶解.室溫放置15 min后,用稀氫氧化鈉中和pH至中性,最后以水稀釋至濃度約為1 mg/mL的溶液.按照“1.3”項(xiàng)下的條件進(jìn)樣,記錄色譜圖和峰面積.

1.7.2 堿水解試驗(yàn)

精密稱取TETA-Cu供試品0.1 g,加入5 mL 0.1 mol/L氫氧化鈉溶解.室溫放置15 min后,用稀鹽酸中和pH至中性,最后以水稀釋至濃度約為1 mg/mL的溶液.按照“1.3”項(xiàng)下的條件進(jìn)樣,記錄色譜圖和峰面積.

1.7.3 高溫、高濕、強(qiáng)光照射試驗(yàn)

分別將同一批次的TETA-Cu供試品,放置于高溫(60 ℃)、高濕(環(huán)境濕度為95%)、強(qiáng)光(照射度4500±500lx)條件下3 d,稱取適量,用水溶解并稀釋至濃度為1 mg/mL的溶液.按照“1.3”項(xiàng)下的條件進(jìn)樣,記錄色譜圖和峰面積.

1.8 穩(wěn)定性考察

1.8.1 供試品溶液的穩(wěn)定性考察

按照“1.2”項(xiàng)下的方法,將新配制的濃度為0.5 mg/mL的供試品溶液置于室溫下,分別于0、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8 h取樣,用“1.3”項(xiàng)下的條件進(jìn)樣檢測,記錄不同時間下供試品溶液的峰面積并計算RSD.

1.8.2 對照品溶液穩(wěn)定性考察

按照“1.2”項(xiàng)下的方法,將新配制的濃度為0.5 mg/mL的對照品溶液置于4 ℃的環(huán)境中,分別在0.5、1、2、3、4 d取樣,用“1.3”項(xiàng)下的條件進(jìn)樣檢測,記錄不同時間對照品溶液的峰面積并計算RSD.

1.9 TETA-Cu的含量測定

取三份不同批次的TETA-Cu供試品,按照“1.2”項(xiàng)下的方法分別配制成0.3 mg/mL的溶液進(jìn)行含量測定.按照“1.3”項(xiàng)下的條件進(jìn)樣,記錄峰面積帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算TETA-Cu含量.

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

TETA-Cu絡(luò)合物具有高極性和強(qiáng)水溶性的特點(diǎn).本實(shí)驗(yàn)采用3種不同類型的色譜柱對TETA-Cu的洗脫情況進(jìn)行了篩選(見表1).首先采用C18柱,以甲醇-水為流動相,無論怎么改變流動相強(qiáng)度,TETA-Cu在色譜柱上均無保留;采用離子對色譜法在水相中添加離子配體(戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉),并對離子配體的濃度、流動相的pH以及強(qiáng)度進(jìn)行篩選,TETA-Cu雖然在色譜柱上有保留,但分離度差,如圖1a、圖1b所示,因此不適用于定量分析.

其次,在氨基柱上分別采用甲醇-水、乙腈-水體系時,無論怎么改變流動相強(qiáng)度TETA-Cu的保留時間均在2 min左右,如圖1e所示,說明氨基柱也不能用于TETA-Cu的保留和分離.

HILIC色譜柱對于極性強(qiáng)的物質(zhì)有較好的保留性.本文參考谷胱甘肽的HPLC檢測條件[15],以甲醇-0.05 mM甲酸銨水溶液(用甲酸調(diào)節(jié)pH至4.0),按照梯度0～10 min 5 %～100 %甲醇洗脫,結(jié)果如圖1d所示.此條件下的TETA-Cu峰保留時間適中,但色譜峰很寬,調(diào)整梯度洗脫程序,仍不能改善峰型.以乙腈-水為流動相,洗脫程序?yàn)?～10 min 5 %～100 %乙腈進(jìn)行洗脫,結(jié)果如圖1c所示,在此條件下,TETA-Cu色譜峰保留時間為3.8 min,峰型尖銳,與雜質(zhì)峰能有效分離,因此確定為TETA-Cu的色譜檢測條件.

表1 色譜柱的選擇Table 1 Selection of columns

圖1 TETA-Cu在不同色譜柱上的分離情況Fig.1 Chromatograms of TETA-Cu using different columns

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性范圍、定量限及檢測限

TETA-Cu的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示,回歸方程為y=6×106x-34901,r為0.999 2.實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明TETA-Cu在0.05～1 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好;測得定量限為0.05 mg(S/N=10);檢測限為0.007 5 mg(S/N=3).

圖2 TETA-Cu線性范圍考察Fig.2 Calibration curves of TETA-Cu

2.2.2 加樣回收試驗(yàn)

加樣回收試驗(yàn)結(jié)果如表2所示,低、中、高三個水平的平均加樣回收率為99.0%,RSD為1.43%,說明該方法準(zhǔn)確度較好,能滿足定量分析要求.

表2 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果Table 2 The recovery test of TETA-Cu

2.2.3 精密度考察

(1)重復(fù)性試驗(yàn)

低、中、高濃度的對照品溶液的峰面積及RSD結(jié)果見表3,在低、中、高濃度下峰面積的RSD均不高于2.5%,說明該方法的重復(fù)性良好.

(2)中間精密度

連續(xù)5 d對低、中、高濃度對照品溶液進(jìn)行測量,各濃度下峰面積的RSD均低于3%(見表4),說明該方法中間精密度良好.

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果Table 3 The repeatability test of quantifying TETA-Cu

2.2.4 專屬性考察

由圖3的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,各種降解實(shí)驗(yàn)中分解產(chǎn)物的存在,不影響TETA-Cu的檢測.因此,本方法的專屬性良好.

圖3 專屬性考察色譜圖Fig.3 Chromatograms of specificity tests

2.2.5 穩(wěn)定性考察

(1)供試品溶液的穩(wěn)定性考察

供試品溶液在室溫下穩(wěn)定性考察結(jié)果如表5所示.室溫下0～5 h,TETA-Cu供試品峰面積差異不大,RSD值為2.47%,溶液基本能保持穩(wěn)定.在室溫下放置超過6 h后,峰面積開始發(fā)生變化并且隨著時間推移峰面積逐漸變得不穩(wěn)定,6～8 h峰面積的RSD值為15.87%.

表5 供試品溶液室溫下的穩(wěn)定性試驗(yàn)Table 5 The stability test of TETA-Cu at room temperature

(2)對照品溶液穩(wěn)定性考察

對照品溶液在4 ℃下穩(wěn)定性考察結(jié)果如表6所示.對照品溶液在4 ℃環(huán)境下4 d內(nèi)能保持穩(wěn)定.

表6 對照品溶液在4 ℃下穩(wěn)定性試驗(yàn)數(shù)據(jù)Table 6 The stability test of TETA-Cu at 4 ℃

2.2.6 TETA-Cu含量測定結(jié)果

選取不同批次合成的TETA-Cu按照上述方法進(jìn)行含量測定,結(jié)果如表7所示.

表7 三個批次的TETA-Cu含量測定結(jié)果Table 7 Contents of three different batches of TETA-Cu

3 結(jié)論

TETA-Cu是一種極性很強(qiáng)的化合物,本文采用不同類別的色譜柱對其進(jìn)行分離,發(fā)現(xiàn)TETA-Cu在C18柱和氨基柱上基本無保留,采用離子對色譜雖然有保留,但峰型展寬嚴(yán)重,也不適于TETA-Cu的定量分析.在本實(shí)驗(yàn)中,HILIC柱對TETA-Cu具有較合適的保留和分離作用,在使用乙腈-水作為流動相對化合物進(jìn)行梯度洗脫后,保留時間約4 min,與雜質(zhì)峰分離度良好,適用于TETA-Cu的分析檢測.

因此,本文建立了一種采用HILIC-HPLC測定TETA-Cu含量的新方法,該方法采用乙腈-水的體系進(jìn)行梯度洗脫,TETA-Cu保留時間適中,操作簡單方便,不僅適用于常規(guī)檢驗(yàn),也具有與MS聯(lián)合使用的潛力,為生物樣品中針對該化合物的分析檢測提供了參考并為今后該藥物研發(fā)與臨床應(yīng)用提供一種可靠的定量分析方法.