梅鹵的抗氧化活性研究

吳志亮，謝建華*

（1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品工程學(xué)院，福建漳州 363000；2.漳州市食品產(chǎn)業(yè)技術(shù)研究院，福建漳州 363000)

青梅(Prunus mumeSieb.et Zucc.)又稱酸梅或梅果，為薔薇科植物，原產(chǎn)于中國，主要分布于長江流域及華南、西南地區(qū)一帶[1]。福建省漳州市詔安縣是目前全國最大的青梅主產(chǎn)區(qū)，有“中國青梅之鄉(xiāng)”之稱[2]。青梅具有豐富的營養(yǎng)價值和醫(yī)療保健作用，在《本草綱目》和《神農(nóng)本草》均有記載[3-4]。有研究表明青梅能治療骨質(zhì)疏松癥、肥胖癥和咳嗽等疾病[5-6]。

因青梅含酸量高，且含有澀味，不宜鮮食，主要用于加工，其中基于鹽腌梅胚原料的傳統(tǒng)加工占90%以上[7-8]。新鮮青梅通過食鹽腌制加工，產(chǎn)生大量高鹽、高酸的腌制溶液，即為梅鹵[9]。盡管梅鹵可以作為食品的調(diào)味劑和腸胃的調(diào)理劑，但大部分被直接排放到環(huán)境中造成污染[10-11]。目前，國內(nèi)外學(xué)者對梅鹵的研究主要集中在化學(xué)組成，抗氧化物質(zhì)含量及抗氧化指標(biāo)等指標(biāo)鮮見報道[8,12-13]。通過對梅鹵的抗氧化物質(zhì)和抗氧化能力進(jìn)行研究，旨在提高青梅加工副產(chǎn)物的綜合利用，為產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1.材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

梅鹵：漳州詔安金川果蔬有限公司提供。

鄰苯三酚、鹽酸、水楊酸、硫酸亞鐵、過氧化氫、沒食子酸、碳酸鈉、蘆丁、乙醇、硝酸鋁、氫氧化鈉、pH8.2Tris-HCL 緩沖液、鄰苯三酚、亞硝酸鈉、鹽酸萘乙二胺、pH3.0 檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液、氨基苯磺酸、福林酚試劑等試劑均為分析純。

WF722 型可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）、HH-2 恒溫水浴鍋（金壇區(qū)新航儀器廠）、Quintix224-1CN 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 梅鹵的總酚含量測定

采用Folin-Ciocaheu 法。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取沒食子酸0.100 g，用蒸餾水溶解后定容至100.00 mL，得到濃度為1.00 mg·mL-1標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別精密移取上述溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL，用蒸餾水定容至100.00 mL。分別精確移取以上6 種不同濃度的沒食子酸溶液各1.00 mL，加入10%福林酚試劑5.00 mL，混勻后反應(yīng)5 min，加入4.00 mL 20% 碳酸鈉溶液，混勻后于室溫下避光反應(yīng)2 h，于765 nm 波長處測量吸光度。以沒食子酸質(zhì)量濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1）。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線

精確移取1 mL 經(jīng)稀釋的樣品溶液，以相同方法測定吸光度，并根據(jù)回歸方程計算總酚含量。結(jié)果以梅鹵原液所含沒食子酸的質(zhì)量濃度表示。其公式為：

C1=C2×N 式中：C1為梅鹵總酚的質(zhì)量濃度，mg·mL-1；C2為經(jīng)稀釋的梅鹵溶液質(zhì)量濃度，mg·mL-1；N為稀釋倍數(shù)。

1.2.2 梅鹵的黃酮含量測定

采用亞硝酸鈉-硝酸鋁比色法：精確稱取60.00 mg 蘆丁，用30%乙醇定容至200.00 mL，即為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液。精確吸取0、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50 mL 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液于10.00 mL 比色管中，加入5%亞硝酸鈉溶液0.30 mL，混勻，放置5 min 后加入10%硝酸鋁溶液0.30 mL，混勻，放置5 min 后加入4%氫氧化鈉4.00 mL，最后用30%乙醇定容至10.00 mL，混勻，放置10 min 后于510 nm 波長處測量吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度(mg·mL-1)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2）。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖3 梅鹵對O2-·的清除率

圖4 Vc 對O2-·的清除率

精確移取1.00 mL 經(jīng)稀釋的樣品溶液，以相同方法測定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算黃酮含量。結(jié)果以梅鹵原液所含蘆丁含量表示。其公式為：

C1=C2×N 式中：C1為梅鹵黃酮的含量，mg·mL-1；C2為經(jīng)稀釋的梅鹵黃酮含量，mg·mL-1；N為稀釋倍數(shù)。

采用鄰苯三酚自氧化法。取0.05 mol·L-1、pH8.2 Tris-HCL 緩沖液4.50 mL，加入1 mL 待測溶液，25℃水浴10 min，加入25 mmol·L-1鄰苯三酚溶液0.40 mL，混勻后于25℃水浴5 min，加入8 mmol·L-1鹽酸1.00 mL 以終止反應(yīng)，于420 nm 測定吸光度。以蒸餾水為空白對照，測得吸光度為A0；以不同濃度的梅鹵和Vc 溶液為測試溶液，測得吸光度為Ai。其公式為：

式中：A0為加入蒸餾水的吸光度；Ai為加入待測溶液后的吸光度。

1.2.4 梅鹵對羥基自由基（·OH）的清除率

利用芬頓（Fenton）反應(yīng)測定不同濃度下的梅鹵對羥基自由基(·OH)的清除率。在10 mL 具塞試管中加入9 mmol·L-1水楊酸0.5 mL、9 mmol·L-1硫酸亞鐵溶液0.5 mL 和1 mmol·L-1過氧化氫3mL，加入1 mL 待測溶液，混勻后于37℃水浴1 h，于波長510 nm 處測量吸光度。以甲醛為空白對照，測得吸光度為A0；以不同濃度的梅鹵和Vc 溶液為測試溶液，測得吸光度為Ai。其公式為：

式中：A0為加入甲醛的吸光度，Ai為加入待測溶液的吸光度。

1.2.5 梅鹵對亞硝酸鹽(·NO2-)的清除率

采用鹽酸萘乙二胺法測定梅鹵對亞硝酸鹽（·NO2-）的清除率。于25 mL 容量瓶中依次加入pH3.0檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液2.0 mL，樣品溶液1.00 mL，5 μg·mL-1亞硝酸鈉溶液2.00 mL，混勻后在37℃下水浴1 h，取出后加入2.00 mL 0.4%對氨基苯磺酸混勻，放置5 min，加入1.00 mL 0.2%鹽酸萘乙二胺溶液，再加去離子水至刻度，混勻，放置15 min 后，于538 nm 波長處測定吸光度Ai。以蒸餾水為空白對照，測得吸光度為A0；以不同濃度的梅鹵和Vc 溶液為測試溶液，測得吸光度為Ai。其公式為：

式中：A0為加入蒸餾水的吸光度，Ai為加入梅鹵和Vc 溶液的吸光度。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗做3 次平行測定，采用Execl 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。

2.結(jié)果與分析

2.1 梅鹵抗氧化物質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)

青梅含有豐富的酚類物質(zhì)和黃酮類物質(zhì)[1,14]。如表1 所示，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，測得梅鹵總酚含量為0.92 mg·mL-1，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品測得黃酮質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.86 mg·mL-1。

表1 梅鹵抗氧化物質(zhì)含量

2.2 梅鹵抗氧化活性研究

O2·-不但對細(xì)胞能產(chǎn)生危害，同時其自身也具有毒害作用，會損壞細(xì)胞中的DNA，從而破壞人體的各項機(jī)體功能[15]。梅鹵和Vc 對O2·-的清除率如圖所示，梅鹵和Vc 均具有清除鄰苯三酚自身氧化產(chǎn)生的O2·-的能力，隨著濃度升高而升高，在一定范圍內(nèi)具有量效關(guān)系。當(dāng)梅鹵質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～10%之間時，其清除O2·-的能力增長較快，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在10%時達(dá)到75.07%；當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%～40%時，清除率維持在94.91%～95.02%之間，差異不明顯。參照陳智毅等[13]的方法，梅鹵質(zhì)量分?jǐn)?shù)在2～10%時，與斜率呈顯著的相關(guān)性（y=7.603 4x-1.469 1，r2=0.998 5）,計算半抑制濃度ⅠC50為6.77%。Vc含量在0.10～0.80 mg·mL-1時，與斜率呈顯著的相關(guān)性（y=98.495x+7.919 7，r2=0.994 4）,計算半抑制濃度ⅠC50為0.43 mg·mL-1。

2.2.2 梅鹵對·OH 的清除率

·OH 是氧化性最強(qiáng)、毒性最大的活性氧自由基，可導(dǎo)致細(xì)胞加快氧化，還能促使組織細(xì)胞的各項機(jī)能發(fā)生變化，引發(fā)各種疾病發(fā)生，對機(jī)體健康造成極大的威脅[16]。梅鹵和Vc 對·OH 清除率分別如圖5 和圖6 所示，梅鹵和Vc 對·OH 清除率隨著濃度的提高而增加。當(dāng)梅鹵質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～1.5%之間時，其·OH 清除率快速提升，當(dāng)濃度在1.5%時已達(dá)到82.10%；當(dāng)濃度為5%～10%時，清除率維持在96.65%～98.04%之間，差異不明顯。梅鹵質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～1.5%時，梅鹵與清除率呈正比例線性關(guān)系（y=55.8x+2.29，r2=0.987 1）,計算半抑制濃度ⅠC50為0.86%。Vc 質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～1.60 mg·mL-1時，與斜率呈顯著的相關(guān)性（y=50.136x+0.272，r2=0.999 9）,計算半抑制濃度ⅠC50為0.99 mg·mL-1。2.2.3 梅鹵對·NO2-的清除率

圖5 梅鹵對·OH 的清除率

圖6 Vc 對·OH 的清除率

圖7 梅鹵對·NO2-的清除率

·NO2-是兩性物質(zhì)，既有氧化性又有還原性。在酸性介質(zhì)中，表現(xiàn)出極強(qiáng)的氧化能力[17]。以Vc 為對照，測定梅鹵對·NO2-的清除率。如圖所示，梅鹵和Vc 對·NO2-的清除率隨著濃度升高而升高，Vc 的清除率比較平穩(wěn)。當(dāng)梅鹵質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～20%之間時，其清除·NO2-的能力增長較快，當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)在20%時達(dá)到82.65%；當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%～60%時，清除率維持在90.82%～94.08%之間，差異不明顯。

梅鹵質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～10%時，與其對·NO2-的清除率呈顯著的相關(guān)性（y=6.622x+3.25，r2=0.9719）,計算半抑制濃度ⅠC50為7.06%。Vc 質(zhì)量分?jǐn)?shù)在0～0.60 mg·mL-1時，與斜率呈顯著的相關(guān)性（y=100.9x+13.44，r2=0.993）,計算半抑制濃度ⅠC50為0.36 mg·mL-1。

Vc質(zhì)量濃度/mg·mL-1圖8 Vc 對·NO2-的清除率

3.討論

梅鹵是青梅傳統(tǒng)加工成鹽腌梅胚產(chǎn)生的副產(chǎn)物，具有高鹽、高酸的特點(diǎn)，大部分被直接排放到環(huán)境中造成環(huán)境污染。研究結(jié)果表明梅鹵總酚質(zhì)量濃度為0.92 mg·mL-1，黃酮質(zhì)量濃度為2.86 mg·mL-1。姜峰等[18]探究了青梅發(fā)酵過程中的黃酮和總酚變化，總酚和黃酮質(zhì)量濃度在發(fā)酵過程中不斷上升，最終達(dá)到3.24 mg·mL-1和4.11 mg·mL-1。陳銘中等[19]以4 種不同酵母發(fā)酵青梅酒，其黃酮質(zhì)量濃度均在0.6 mg·mL-1。結(jié)果表明，梅鹵具有一定的總酚和黃酮質(zhì)量濃度，有較高的利用價值，其含量在加工貯藏過程的變化有待進(jìn)一步研究。

梅鹵對O2-·、·OH、·NO2-的半抑制濃度ⅠC50分別為6.77%、0.86%、7.06%，1.00 mL 梅鹵相當(dāng)于6.35 mgVc 對O2-·的清除能力、115.12 mgVc 對·OH 的清除能力、5.10 mgVc 對·NO2-的清除能力。在金玉熊[12]的研究中，梅鹵對O2-·的ⅠC50達(dá)到13.16%，對DPPH 自由基ⅠC50為0.81%。而陳智毅等[13]研究表明，梅鹵對DPPH 自由基ⅠC50為0.022 mL，1.00 mL 梅鹵相當(dāng)于0.69 mg TBHQ 對DPPH 自由基的清除能力。這可能是因為梅鹵濃度或?qū)嶒灧椒ú煌瑢?dǎo)致的。

綜上所述，梅鹵含有較高的抗氧化物質(zhì)含量和抗氧化活性，是一種潛在的天然抗氧化劑，為青梅加工副產(chǎn)物綜合利用與產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供了基礎(chǔ)依據(jù)與參考。