大口黑鱸殺魚愛德華氏菌的分離鑒定及耐藥性分析

郭文杰，韓銳，許為鎮(zhèn)，李言偉，但學(xué)明

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，廣東 廣州 510665）

大口黑鱸（Micropterus salmoides）俗名加州鱸魚，肉質(zhì)堅實，味道鮮美，無肌間刺，已被市場廣泛接受，成為了養(yǎng)殖量增長速度最快的水產(chǎn)品之一。2020 年我國大口黑鱸的養(yǎng)殖產(chǎn)量已達16 萬余噸[2]，其中廣東省的養(yǎng)殖量占全國的75%，池塘養(yǎng)殖面積超過2 666.67 hm2，主要集中在佛山市順德區(qū)和南海區(qū)，成為了佛山市水產(chǎn)養(yǎng)殖的支柱種類，形成了苗種、飼料、養(yǎng)殖、加工流通一體化較為完善的產(chǎn)業(yè)鏈。

殺魚愛德華氏菌（Edwardsiella piscicida）是胞內(nèi)寄生的革蘭氏陰性菌，可溶血，靠周生鞭毛運動[3]。它能感染多種海、淡水魚類，包括大菱鲆（Scophthalmus maximus）、牙鲆（Paralichthys olivaceus）和斑點叉尾（Ictalurus punctatus）[4，5]等，是對水產(chǎn)危害巨大的致病菌。

隨著大口黑鱸養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖密度不斷擴增，疾病危害也日趨嚴(yán)重。目前對大口黑鱸養(yǎng)殖造成危害的常見病原菌包括柱狀黃桿菌（Flavobacterium cloumnare）、遲緩愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）、維氏氣單胞菌（Aeromonas veronii）以及嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）等，這些病原菌通常在每年3—4 月份水溫上升到24 ℃以上就開始大量繁殖，如果水環(huán)境惡化或魚體免疫力下降[6]，就會侵染魚體發(fā)病?？股氐倪^度使用以及配伍不合理[7]，不但起不到治療作用，更會引起環(huán)境耐藥性和抗生素殘留等問題[8]。2022 年3 月下旬，廣東珠三角地區(qū)的大口黑鱸大規(guī)模死亡，特別是佛山市南海區(qū)沙頭鎮(zhèn)和九江鎮(zhèn)發(fā)病最嚴(yán)重，死亡率最高可達50%，且有向周圍養(yǎng)殖區(qū)域漫延的趨勢，患病魚主要臨床癥狀表現(xiàn)為腹部膨大，嚴(yán)重腹水和內(nèi)臟缺血。為揭示大口黑鱸死亡原因，本文在佛山市南海區(qū)沙頭鎮(zhèn)9 口魚塘采集瀕死病魚共42 個病樣，進行病理分析、病原分離與鑒定、病原菌毒力和耐藥性檢測等實驗，以期為該病的診斷和防控提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

2022 年3 月16 日—21 日在佛山市南海區(qū)沙頭鎮(zhèn)采集的患病瀕死的大口黑鱸體長25～35 cm，典型的臨床癥狀為腹部膨大和內(nèi)臟缺血。

血平板、BHI 腦心浸液培養(yǎng)基、革蘭氏染色試劑盒和細(xì)菌生化鑒定試劑盒均購于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，藥敏紙片購于杭州微生物試劑有限公司，Taq DNA 聚合酶、dNTP 購自TaKaRa 公司。

1.2 方法

1.2.1 病理組織切片觀察

取具有典型臨床癥狀病魚的肝、脾、腎用波恩氏液固定24 h，然后進行常規(guī)石蠟切片和HE 染色，對病魚組織進行病理學(xué)分析。

1.2.2 細(xì)菌的分離、純化和鑒定

取具有典型臨床癥狀的病魚進行拍照記錄分析。解剖刀在酒精燈外焰燒紅刀口后貼到內(nèi)臟表面，消除表面細(xì)菌，然后用接種環(huán)輕輕插入肝脾腎內(nèi)部，待接種環(huán)表面浸潤內(nèi)臟組織液后拔出，在血平板上按照肝、脾、腎分區(qū)域進行平板劃線。分離完畢后將血平板倒置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱。培養(yǎng)48～72 h，觀察平板生長結(jié)果。挑選形態(tài)一致的菌落至BHI固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)兩代，獲得純化的菌株。將純化后的菌株在液體培養(yǎng)基中擴大培養(yǎng)后，加入40%甘油溶液中-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

以過夜培養(yǎng)的菌液為模板，細(xì)菌16S rDNA 通用擴增序列為引物（27F:5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，1492R: 5-TACGGYTACCTTGTTACGA CTT-3'）進行PCR 擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后,送華大基因公司測序。將目標(biāo)菌株的16S rRNA 基因序列在NCBI 數(shù)據(jù)庫中應(yīng)用BLAST 軟件進行同源性分析，用Clustal W 軟件將NCBI 數(shù)據(jù)庫中獲得的相似度較高的序列和其他種屬的序列進行多序列匹配,采用MEGA 6.0 中的鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，并通過自舉分析檢測置信度，自舉數(shù)據(jù)集為1 000 次。

按照廣東環(huán)凱微生物科技有限公司細(xì)菌生化鑒定試劑盒說明書，將適量新鮮菌液懸液加入20種生化鑒定管中，37 ℃靜置，24 h 內(nèi)觀察生化鑒定管中變化。

1.2.3 動物回歸試驗

試驗魚體長（25±8）cm、體質(zhì)量（400±124）g，每組10 尾魚，每尾魚注射200 μL 菌液。根據(jù)吸光值和平板計數(shù)結(jié)果，制成濃度為108CFU/mL、107CFU/mL、106CFU/mL 的菌懸液進行腹腔注射攻毒，以PBS 為對照組。水溫在26 ℃，持續(xù)充氣，連續(xù)觀察10 d，記錄死亡數(shù)量，并分離死魚肝脾腎的細(xì)菌。

1.2.4 藥敏試驗

選用6 種水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的抗菌藥物：四環(huán)素、多西環(huán)素、氟苯尼考、恩諾沙星、利福平和阿莫西林。純化后的優(yōu)勢菌用無菌水配制成菌懸液后，吸取100 μL 菌懸液（經(jīng)平板計數(shù)CFU 為5.5x108）均勻涂布在BHI 固體培養(yǎng)基上，然后用無菌鑷子將藥敏紙片輕輕貼合在培養(yǎng)基表面，分布均勻，貼合后將平板倒置，在28 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，測量藥敏圈直徑。根據(jù)產(chǎn)品說明書提供的判斷標(biāo)準(zhǔn)，得出各藥物的敏感程度。

2 結(jié)果與分析

2.1 病魚的臨床癥狀

發(fā)病池塘水溫23 ℃，發(fā)病魚多為體長30～40 cm 的一齡魚，其中懷卵的雌魚占比約70%。病魚體表無明顯出血或潰爛，腹部明顯膨大，泄殖孔紅腫。將魚體垂直提起，可見少量腹水從泄殖孔中流出（圖1）。剖檢發(fā)現(xiàn)，鰓缺血，肝臟腫大、呈土黃色，脾臟呈暗黑色，后腎明顯腫脹，腹腔中存在大量腹水，腹水中有雞蛋清樣凝結(jié)物（圖2）。

圖1 患病大口黑鱸體表癥狀（黃色圈為腹部明顯膨大，紅色箭頭為泄殖孔紅腫）Fig.1 Body surface symptoms of diseased largemouth bass [the abdomen is obviously enlarged（yellow circle）and the genital pore is red in color and swollen（red arrows）]

圖2 病魚鰓（紅色箭頭）和肝臟缺血、腫大（黃色箭頭），腹水嚴(yán)重，含雞蛋清樣凝聚物（黃色圈）Fig.2 Gills（red arrows）and liver（yellow arrows）ischemia of the diseased fish,liver enlargement,severe ascites,containing egg white condensates（yellow circle）

2.2 病理變化

病魚肝組織壞死，細(xì)胞質(zhì)中有嗜酸性玻璃樣小滴，部分肝臟細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性和脂肪變性。腎小球增生，毛細(xì)血管擴張，腎小囊腔變窄，腎小管上皮細(xì)胞壞死，腎間組織炎性細(xì)胞浸潤。脾臟細(xì)胞萎縮變性，部分組織壞死（圖3）。

圖3 病理組織切片F(xiàn)ig.3 Pathological tissue section

2.3 細(xì)菌的分離和純化

大口黑鱸的肝、脾、腎組織在血平板劃線培養(yǎng)48 h 后，可見乳白色表面光滑的單菌落，單菌落直徑2～3 mm，γ 溶血。從血平板挑取優(yōu)勢單菌落至BHI 固體培養(yǎng)基中純化培養(yǎng)，36 h 后在平板上形成形態(tài)一致的單菌落（圖4）。純化細(xì)菌經(jīng)革蘭氏染色后呈陰性，短桿狀，其大小約0.5 μm×2 μm，可運動。

圖4 用血平板分離的菌落和用BHI 固體培養(yǎng)基純化的菌落Fig.4 Colonies isolated by blood plate and purified by BHI medium

2.4 分離菌的分子生物學(xué)鑒定

把分離菌16s rRNA 的測序結(jié)果導(dǎo)入NCBI 的GenBank 數(shù)據(jù)庫中進行BLAST 分析，發(fā)現(xiàn)該菌與殺魚愛德華氏菌（Edwardsiella piscicida）有100%的同源性。使用MEGA 6.0 軟件采用鄰接法構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹顯示（圖5），該菌株（S1）與殺魚愛德華氏菌聚為一支。

圖5 基于16S rRNA 基因序列的系統(tǒng)進化發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic development tree based on 16S rRNA gene sequence

2.5 分離菌的生化鑒定

菌株S1 在生化鑒定實驗中，與精氨酸脫羧、鳥氨酸脫羧、葡萄糖發(fā)酵、檸檬酸鹽以及H2S 的反應(yīng)中呈現(xiàn)陽性，其余15 項生化鑒定指標(biāo)均呈現(xiàn)陰性（表1）。結(jié)合分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，證實該菌為殺魚愛德華氏菌。

表1 菌株的理化特性Tab.1 Physicochemical characteristics of the strain

2.6 動物回歸感染試驗

用不同劑量的細(xì)菌腹腔注射健康大口黑鱸72 h 內(nèi)，三個實驗組均出現(xiàn)了死魚，108、107和106CFU/mL 組死亡率分別為90%、60%和20%，PBS 對照組無死亡（圖6）。多數(shù)瀕死魚的臨床癥狀與自然發(fā)病魚一致，且可從發(fā)病魚肝脾腎組織中分離出形態(tài)一致的優(yōu)勢菌，經(jīng)16S rRNA 鑒定，均為殺魚愛德華氏菌。這表明殺魚愛德華氏菌是大口黑鱸死亡的致病菌。

圖6 菌株S1 的回歸感染實驗Fig.6 Regression infection experiment of strain S1

2.7 藥敏試驗

對病魚中分離的殺魚愛德華氏菌（S1、S3、S4、S8）的藥敏試驗結(jié)果顯示，不同魚塘病魚的分離細(xì)菌的藥敏結(jié)果不同。1 號塘菌株S1 和8 號塘菌株S8 對氟苯尼考敏感性最強，阿莫西林次之，對多西環(huán)素和恩諾沙星中等敏感。而3 號塘菌株S3 和4號塘菌株S4 對阿莫西林最敏感，多西環(huán)素次之，對恩諾沙星和氟苯尼考中度敏感。4 株不同塘口的菌株都對利福平和四環(huán)素都耐受（表2）。

表2 菌株藥敏結(jié)果Tab.2 Drug sensitivity results of bacterial strains

3 討論

本研究在3 月開春季節(jié)走訪佛山水產(chǎn)養(yǎng)殖基地，跟蹤調(diào)查加州鱸流行病學(xué)。將患病加州鱸采樣解剖，從內(nèi)臟分離出優(yōu)勢病原菌，并對其進行16S rRNA 序列分析和生理生化鑒定，確定優(yōu)勢菌株為加州鱸殺魚愛德華氏菌。

回歸實驗結(jié)果表明，腹腔注射108CFU/mL 組死亡率為90%，表明分離純化的殺魚愛德華氏菌株S1具有很強的致病力，是引起加州鱸在開春水溫回暖季節(jié)大量死亡的主要病原菌。人工感染菌株S1 的加州鱸出現(xiàn)內(nèi)臟出血和腹部膨大等與自然感染一致的癥狀，表明殺魚愛德華氏菌作為條件性致病菌在適當(dāng)?shù)乃疁丨h(huán)境下容易引起加州鱸的急性敗血癥。但人工感染的加州鱸未出現(xiàn)肝臟脂肪化、缺血、腫大的病癥，原因是肝臟的健康主要與養(yǎng)殖投喂模式及環(huán)境因素有關(guān)，屬于長期積累的病理變化結(jié)果。過量投喂增加了肝臟的負(fù)荷，養(yǎng)殖密度的不斷增加也進一步惡化水質(zhì)環(huán)境，導(dǎo)致加州鱸機體免疫水平下降，在病原菌入侵時容易造成大量死亡。

藥敏實驗中采用了6 種水產(chǎn)動物常用的抗菌藥物。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同塘口分離的殺魚愛德華氏菌菌株，對不同藥物的敏感度有所差別。四株分離株都對利福平和四環(huán)素耐受，1 號和8 號池分離株對氟苯尼考的敏感程度最高，但3、4 號池分離株對阿莫西林藥敏度最高。造成這種差異現(xiàn)象主要和不同塘口的用藥史有關(guān)[9,10]。用藥記錄顯示，3、4 號池存在過量使用氟苯尼考連續(xù)拌料投喂的現(xiàn)象。由于抗生素的選擇缺乏針對性、種類單一、配伍不合理甚至出現(xiàn)禁忌，不但增加環(huán)境中細(xì)菌對廣譜抗生素的耐藥性[11]，也會出現(xiàn)用藥效果不佳、抗生素殘留[12]等問題。因此，在養(yǎng)殖發(fā)病過程中，應(yīng)先對患病魚體解剖檢查，綜合分析近期養(yǎng)殖環(huán)境變化、攝食和發(fā)病情況，找出疾病根源，結(jié)合池塘養(yǎng)殖過程中的用藥史，在藥敏實驗結(jié)果的指導(dǎo)下，選出合適的藥物及搭配方式，提高用藥準(zhǔn)確率和成功率，對藥物的選擇和治療療程有明確的規(guī)劃，做到科學(xué)合理用藥。

殺魚愛德華氏菌是在開春水溫上升季節(jié)引起死亡的最主要病原菌，每年給加州鱸養(yǎng)殖業(yè)造成了較大的損失。本研究從患病加州鱸分離出的殺魚愛德華氏菌毒力也很高，應(yīng)當(dāng)引起足夠重視。本研究為該病的分離鑒定、藥物治療提供了科學(xué)依據(jù)，為加州鱸養(yǎng)殖提供了參考。