患“紅斑綜合征”的海膽體腔液中菌群結(jié)構(gòu)特征

高闖，劉家洋，韓泠姝，國超，張向磊，王犖，張偉杰，常亞青，丁君

（大連海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧 大連 116023）

海膽是常見海洋無脊椎動物世界范圍內(nèi)重要的經(jīng)濟物種之一。可食用的經(jīng)濟海膽種類約10 種,主要集中在正形目（Cenyrchinoida）[1,2]，如中間球海膽（Strongylocentrotus intermedius）、光棘球海膽（Stron gylocentrotus nudus）、海刺猬（Glyptocidaris crenularis）和南方紫海膽（Anthocidaris crassispina）等。中間球海膽自1989 年由大連海洋大學(xué)引進國內(nèi)后每年苗種生產(chǎn)量達億枚以上，年產(chǎn)量超過200 t，已成為我國最主要的海膽?zhàn)B殖種類[3,4]。馬糞海膽（Hemicentrotus pulcherrimus）屬黃渤海海域典型的常見海膽，與中間球海膽親緣關(guān)系較為接近，也常被用作海洋環(huán)境監(jiān)測的生物指示種[5,6]。光棘球海膽性腺營養(yǎng)豐富、品質(zhì)優(yōu)良，體內(nèi)含有的大量多不飽和脂肪酸是我國主要可食用和藥用的海膽種類之一，同時也是我國北方沿海主要的出口海產(chǎn)品[7,8]。海刺猬是現(xiàn)存的唯一疣海膽科（Phymosomatidae）的種類，屬疣海膽目（Phymosomatoida），體內(nèi)含有豐富的微量元素，部分元素超過海參中的元素含量，是很好的微量元素補充膳食食品[9]。

近年來，持續(xù)高溫，海膽?zhàn)B殖規(guī)模逐漸擴大，養(yǎng)殖種類不斷增加，病害日益顯著，細菌性疾病已成為威脅海膽?zhàn)B殖產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素[10]。“紅斑綜合征”是危害海膽?zhàn)B殖的細菌性疾病之一[11]。該病起病急、傳播快，短時間內(nèi)即可造成大量死亡，2002—2003 年夏，大連沿海養(yǎng)殖的蝦夷馬糞海膽在2～3 d 內(nèi)死亡率高達90%[12,13]。棘皮動物只有非特異性免疫系統(tǒng)，由體腔細胞和體液免疫因子組成[14]，病害發(fā)生時，體腔液的菌群調(diào)節(jié)模式及其內(nèi)部含有的調(diào)理素樣分子在對抗外界病原的過程中發(fā)揮重要作用[15]。Al-Sharif 等[16]發(fā)現(xiàn)，紫球海膽（Strongylocentrotus purpuratus）體腔細胞中存在補體C3 的同系物，可以顯著增強海膽的體液免疫機能。Canicatti等[17]已從海參（Holothuria polii）中發(fā)現(xiàn)一種與調(diào)理素功能相似的體液因子，可以加速促進體腔細胞的吞噬功能。因此，研究患病海膽體腔內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)特征，探索如何有效防控疾病以及海膽的健康養(yǎng)殖模式成為海膽?zhàn)B殖業(yè)關(guān)注的焦點。

目前對海膽“紅斑綜合征”研究多在中間球海膽進行，發(fā)現(xiàn)有多種病原菌可引發(fā)海膽“紅斑綜合征”。王斌等[11]從患“紅斑綜合征”的蝦夷馬糞海膽病灶處分離出一種可疑病原菌，鑒定為弧菌屬。Li等[18]分離了海膽中與“紅斑綜合征”相關(guān)的致病菌，鑒定為溶珊瑚弧菌（Vibrio coralliilyticus）。Sun 等[19]從患“紅斑綜合征”海膽體內(nèi)分離并鑒定了兩株新的弧菌（Vibrio），命名為HD-1 和HD-2。然而目前對馬糞海膽“紅斑綜合征”病原的研究以及不同種海膽間是否存在潛在傳播的可能性尚無報道。

鑒于此，2021 年收集大連自然海區(qū)患“紅斑綜合征”馬糞海膽，觀察其外部形態(tài)變化及內(nèi)部結(jié)構(gòu)，分離鑒定病原菌及人工回歸感染。挑取病征明顯的馬糞海膽，模擬自然海域環(huán)境條件，將從患病馬糞海膽體腔內(nèi)分離出的燦爛弧菌制成菌懸液，從圍口膜注入健康光棘球海膽、中間球海膽、海刺猬體腔內(nèi)，分析了3 種海膽感染“紅斑綜合征”后體腔液內(nèi)的菌群結(jié)構(gòu)，為海膽“紅斑綜合征”的防治提供基礎(chǔ)參考資料，為海膽的健康養(yǎng)殖模式提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

自遼寧大連旅順（38°43N，120°58E）自然養(yǎng)殖海域采集患“紅斑綜合征”馬糞海膽，置于冰盒中運回至大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室暫養(yǎng)。養(yǎng)殖期間每日換水一次，換水量約40%。一周以后隨機選取6 只病癥明顯、尚未死亡的“紅斑綜合征”馬糞海膽，殼徑（46.60±5.40）mm、殼高（29.29±3.70）mm、體質(zhì)量（38.31±4.50）g。健康光棘球海膽殼徑（40.25±4.63）mm，殼高（26.76±4.05）mm，體質(zhì)量（35.63±4.61）g。健康中間球海膽殼徑（48.34±4.87）mm，殼高（31.15±3.24）mm，體質(zhì)量（42.16±3.98）g。健康海刺猬殼徑（45.44±4.86）mm，殼高（28.31±4.21）mm，體質(zhì)量（36.94±4.98）g，由大連海洋大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室提供。

1.2 方法

1.2.1 病原分離純化方法

取6 只病癥明顯的馬糞海膽用紫外線消毒海水沖洗，注射器從圍口膜處吸取海膽體腔液，接種環(huán)在病灶處沾取少量黏液分別于2% NA Nacl 培養(yǎng)基平板上劃線進行分離，置于27 ℃培養(yǎng)24 h 后，觀察菌落外觀形態(tài)；挑取表觀形態(tài)一致的優(yōu)勢菌落進一步劃線分離純化培養(yǎng)，劃線培養(yǎng)3～4 次，直至獲得純培養(yǎng)優(yōu)勢菌株。對純化菌株進行甘油保種，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 病原鑒定

DNA 的提取均按照SK8255（細菌）試劑盒操作。高通量測序文庫的構(gòu)建和Miseq 高通量測序工作由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。擴增引物為：F（5’-CAGAGTTTGATCCTGGCTAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3’）和R（5’-AGTTTGATCMT GGCTCAGGGTTACCTTGTTACGACTT-3’）。所得引物按如下步驟進行PCR：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30 個循環(huán)；72 ℃重新延伸10 min。

1.2.3 馬糞海膽回歸感染實驗

將分離得到的該菌株接種于含有2% Nacl 的NA 培養(yǎng)基平板上，于27 ℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；然后挑選單菌落接種于2% NaCl NB 液體培養(yǎng)基中；27 ℃搖床過夜，3 000 r/min 離心10 min，離心后棄上清，取沉淀用適量生理鹽水進行稀釋，移液槍抽取1 000 μL 無菌水至離心管中，同時將沉淀移入離心管，采用血細胞計數(shù)板計算細胞數(shù)。配制濃度為1×105CFU/mL、1×106CFU/mL、1×107CFU/mL、1×108CFU/mL 和109CFU/mL 的燦爛弧菌菌懸液，每個細菌濃度取15 只海膽，注射相應(yīng)濃度的溶液0.1 mL 于體腔中，對照組注射同等劑量的0.9%生理鹽水，每天觀察并記錄病癥。

1.2.4 16S rRNA 測序

取上述菌懸液0.1 mL，濃度為1×107CFU/mL，從圍口膜分別注進入光棘球海膽、中間球海膽和海刺猬體腔內(nèi)，每種海膽分別注射6 只，對照組注射同等劑量的生理鹽水，7 d 后每種海膽實驗組和對照組各隨機挑選3 只，取其體腔液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行16S rRNA 擴增和測序。

1.2.5 數(shù)據(jù)分析

使用Flash（Version 1.2.11）軟件，對序列的reads 進行拼接、過濾，得到完整序列；采用RDPclassifier 軟件，閾值為0.8，進行物種分類，統(tǒng)計樣品的菌群相對豐度；使用PICRUSt 軟件，預(yù)測微生物基因功能。

2 結(jié)果與分析

2.1 病原菌的分離純化與鑒定結(jié)果

患“紅斑綜合征”馬糞海膽體壁出現(xiàn)紅色、黑色、紫色斑點狀（圖1）；棘刺脫落，活動乏力，管足吸附能力下降。解剖后發(fā)現(xiàn)，海膽體腔液顏色為紫黑色，內(nèi)部結(jié)構(gòu)并無明顯病變，性腺顏色與健康海膽對比無差別（圖2）?；疾『Ｄ戵w腔液和病灶處黏液病原菌分離培養(yǎng)24 h 后，菌落呈圓形、黃色、表面光滑,邊緣整齊（圖3）。革蘭氏染色顯示桿狀、略顯弧形，為革蘭氏陰性菌（圖4）。PCR 擴增獲得菌株的16S rDNA 序列片段為1 508 bp，通過NCBI Blast 進行同源性檢索，檢索出的序列為燦爛弧菌（Vibrio splendidus），相似度99%，覆蓋率100%。

圖1 患“紅斑病”馬糞海膽Fig.1 Hemicentrotus pulcherrimusn with "red spotting disease"

圖2 健康馬糞海膽（左）與“紅斑綜合征”馬糞海膽（右）解剖圖Fig.2 Anatomy of a healthy（left）and a "red spotting disease"（right）sea urchin Hemicentrotus pulcherrimusn

圖3 菌株分離Fig.3 Strain isolation

圖4 革蘭氏染色Fig.4 Gram staining

2.2 人工回歸感染實驗結(jié)果

實驗期間，對照組馬糞海膽存活，無“紅斑”病征。實驗組的馬糞海膽在攻毒后的7 d 內(nèi)陸續(xù)死亡，且隨著濃度的提高，死亡速率明顯加快。人工感染的馬糞海膽表現(xiàn)出與自然患病的馬糞海膽相似的癥狀：體壁出現(xiàn)明顯紅斑，棘刺嚴重脫落。結(jié)果表明，在106CFU/mL 和107CFU/mL 攻毒濃度下，健康馬糞海膽有明顯的“紅斑”癥狀。而濃度為108CFU/mL 和109CFU/mL 菌液可引起健康馬糞海膽急性死亡，接種后4 d 內(nèi)死亡率達到100%（表1）。取病征明顯馬糞海膽的體腔液及病灶處黏液，劃線培養(yǎng)于2216E 瓊脂培養(yǎng)基平板上，進行病原分離，結(jié)果顯示，在人工感染后的患病馬糞海膽體內(nèi)再次分離并鑒定出燦爛弧菌。

表1 人工回歸感染實驗結(jié)果Tab.1 Results of artificial infection tests

2.3 海膽種間“感染”實驗結(jié)果

注射燦爛弧菌菌懸液3 d 后，光棘球海膽、海刺猬陸續(xù)死亡。感染患病中間球海膽體壁有黑紫色斑塊，管足吸附能力明顯下降，棘刺嚴重脫落，而海刺猬和光棘球海膽在體表面并未出現(xiàn)“紅斑病”病征（圖5），但死亡速度遠快于中間球海膽，中間球海膽、光棘球海膽體腔液均為黑紫色，海刺猬體腔液顏色為正常透明狀，對照組海膽全部存活，健康，活力良好。

2.4 不同種間海膽感染“紅斑病”后菌群結(jié)構(gòu)分析

2.4.1 門水平上的菌群結(jié)構(gòu)與聚類分析

分析門水平上的菌群結(jié)構(gòu)得到各組樣品的優(yōu)勢與次優(yōu)勢菌門（圖6）。結(jié)果顯示：在對照組中，光棘球海膽和中間球海膽體腔內(nèi)優(yōu)勢菌門均為擬桿菌門（Bacteroidetes），分別為95.61%和45.57%，變形菌門（Proteobacteria）次之，分別占3.39%和82.84%；海刺猬體腔內(nèi)優(yōu)勢菌門為變形菌門，占55.18%，桿菌門次之，占20.83%。注射燦爛弧菌懸液后，光棘球海膽、中間球海膽、海刺猬體腔內(nèi)勢菌門均為變形菌門，豐度顯著上升，占比分別達99.94%、60.18%和92.38%；光棘球海膽和中間球海膽體腔內(nèi)次優(yōu)勢菌門均為擬桿菌門和厚壁菌門（Firmicutes），海刺猬體腔內(nèi)次優(yōu)勢菌門為梭桿菌門（Fusobacteria）和擬桿菌門。

圖6 光棘球海膽、中間球海膽、海刺猬基于門水平上的菌群結(jié)構(gòu)與聚類分析Fig.6 Microflora structure and cluster analysis of Strongylocentrotus nudus，S.intermedius and Glyptocidaris crenularis at phylum level

2.4.2 屬水平上的菌群結(jié)構(gòu)與聚類分析

根據(jù)屬水平上的菌群結(jié)構(gòu)分析得到各海膽體腔內(nèi)菌群的優(yōu)勢與次優(yōu)勢菌屬（圖7）。結(jié)果顯示：在感染“紅斑病”前，光棘球海膽可被鑒別的優(yōu)勢菌屬為弧菌屬，占2.10%；中間球海膽可鑒別的優(yōu)勢菌屬為Lutibacter，占17.30%，次優(yōu)勢菌屬為弧菌屬，占9.32%；海刺猬可鑒別的優(yōu)勢菌屬為不動桿菌屬（Acinetobacter），占13.59%，次優(yōu)勢菌屬為葡萄球菌屬，占3.53%。注射燦爛弧菌菌懸液后，3 種海膽體腔內(nèi)優(yōu)勢均屬均為弧菌屬，豐度均明顯升高，光棘球海膽體腔內(nèi)的弧菌屬占比上升到99.90%，中間球海膽體腔內(nèi)弧菌屬占比上升到48.96%，次優(yōu)勢菌屬葡萄球菌屬（Staphylococcus）占比上升到3.03%，海刺猬體腔內(nèi)弧菌屬所占比例達到97.47%，次優(yōu)勢菌屬嗜冷桿菌屬（Psychrilyobacter）比例上升到1.52%。

圖7 光棘球海膽、中間球海膽、海刺猬基于屬水平上的菌群結(jié)構(gòu)分析Fig.7 Microflora structure and cluster analysis of Strongylocentrots nudus，S intermedius and Glyptocidaris crenularis at genus level

2.4.3 COG 功能注釋分析

從圖8 基于COG 的二級功能豐度熱圖可以得出，3 種海膽體腔液菌群樣品中Unig-nes 可劃分為25 個二級功能組，大部分功能均為可知。3 種海膽均有共同的reads 注釋到[E]氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝，[K]轉(zhuǎn)錄，[T]信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制，[C]能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換，[M]細胞壁/膜/包膜生物發(fā)生。光棘球海膽在注射燦爛弧菌懸液后體腔內(nèi)編碼[A]和[B]的功能蛋白豐度均增強，編碼[C]、[E]、[K]的功能蛋白豐度均降低，具體表現(xiàn)在RNA 加工和修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動力學(xué)等功能顯著增強；能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換、氨基酸轉(zhuǎn)運與代謝、翻譯等功能顯著下降。中間球海膽注射燦爛弧菌懸液后體腔內(nèi)編碼[A]、[B]、[C]、[V]的功能性蛋白豐度均顯著上調(diào)，如RNA 加工和修飾、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)與動力學(xué)、能源生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換、防御機制、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制相關(guān)功能蛋白顯著增強。海刺猬注射燦爛弧菌懸液后體腔內(nèi)編碼[J]、[K]、[O]、[U]的功能性蛋白豐度顯著上調(diào)，如翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生、轉(zhuǎn)錄、細胞內(nèi)運輸、翻譯后修飾、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)和伴侶、分泌和囊泡轉(zhuǎn)運相關(guān)功能增強。

圖8 基于COG 菌群功能注釋Fig.8 Functional annotation based on COG microflora

2.4.4 KEGG 功能注釋分析

由基于KEGG 的功能豐度熱圖（圖9）得出，注射馬糞海膽紅斑病抗原后，不同種海膽體腔菌群樣品注釋到通路的相關(guān)基因豐度差異不明顯，3 種海膽均有注釋到膜運輸（Membrane Transport）、氨基酸的運輸和代謝（Amino acid transport and metabolism）、轉(zhuǎn)錄（Transcription）、信號傳導(dǎo)機制（Signal transduction mechanisms）、細胞壁/膜/包膜生物發(fā)生（Cell wall/membrane/envelope biogenesis）、碳水化合物代謝（Carbohydrate Metabolism）、復(fù)制和修復(fù)（Replication and Repair）、能量代謝（Energy Metabolism）等功能。實驗組與對照組相比，中間球海膽關(guān)于維生素代謝以及氨基酸和碳水化合物代謝相關(guān)功能蛋白等顯著增強，海刺猬體現(xiàn)在運輸和分解代謝、信號分子間相互作用、翻譯等相關(guān)功能蛋白顯著增強，光棘球海膽關(guān)于其他次級代謝產(chǎn)物的生物合成、其他氨基酸的代謝、細胞運動等相關(guān)功能蛋白有所下降。

3 討論

3.1 “紅斑綜合征”海膽病原的分離鑒定

近年來，細菌性疾病給海膽?zhàn)B殖業(yè)造成了巨大的損失，其中“紅斑綜合征”是最嚴重的疾病之一[18]，2005 年研究發(fā)現(xiàn)一種弧菌新種可以引起海膽“紅斑綜合征”[12]；Li 等[18]從患“紅斑病”海膽體內(nèi)分離并鑒定出了溶珊瑚弧菌（Vibrio coralliilyticus）。人工回歸感染實驗表明，該菌株可以引起海膽“紅斑病”的典型癥狀；Sun 等[19]在患“紅斑病”中間球海膽體內(nèi)分離、鑒定出歐文氏弧菌菌株（命名為HD-1）和一個新的弧菌物種（命名為HD-2）。本實驗從自然海域患“紅斑病”馬糞海膽體內(nèi)分離并鑒定出一株優(yōu)勢菌株，可在馬糞海膽中人工回歸感染成功，將該菌懸液接種到光棘球海膽、中間球海膽和海刺猬體內(nèi)，3 種海膽出現(xiàn)棘刺脫落，體壁出現(xiàn)黑色、紫色斑塊、體腔液變?yōu)楹谧仙蛑苯又滤赖劝Y狀，綜合16S rDNA 序列分析，最終鑒定該菌株為燦爛弧菌屬。據(jù)此，本文認為有多種病原可以引起海膽“紅斑綜合征”，大多為弧菌屬。通常它們在氧化酶活性測試中呈陽性，不形成孢子[20]。大多數(shù)弧菌的毒力主要歸因于分泌對宿主細胞有毒性的胞外產(chǎn)物，包括蛋白酶、磷脂酶和溶血素等[21-23]。

弧菌在魚類[24]、蝦類[25]、貝類[26]、參類[27]等多種海洋水產(chǎn)動物體內(nèi)均可感染致病。燦爛弧菌是世界范圍內(nèi)河口及沿海海洋生態(tài)系統(tǒng)中普遍存在的條件致病菌之一，也可以感染海洋環(huán)境中的多種宿主，包括魚類、貝類、棘皮類等[28-30]。燦爛弧菌在刺參疾病方面有很多報道，表明它是導(dǎo)致刺參腐皮綜合征的主要病原菌之一。燦爛弧菌的黏附因子和胞外產(chǎn)物等過程均與其毒力相關(guān)[31]。中國養(yǎng)殖的海膽中普遍存在的“紅斑綜合征”是一種由多種弧菌引起海膽體表出現(xiàn)紫黑色斑狀、體腔液為黑紫色甚至死亡的一種細菌性疾病。本研究挑選的患病海膽來自大連人工自然養(yǎng)殖海區(qū)，隨著養(yǎng)殖種類的增多，養(yǎng)殖海域環(huán)境逐漸惡化，海膽的生存環(huán)境受到一定影響，因此，在人工養(yǎng)殖中更應(yīng)注意水質(zhì)及養(yǎng)殖密度，防止因操作不當造成海膽機體損傷使病原侵入導(dǎo)致病害發(fā)生。

3.2 光棘球海膽、中間球海膽、海刺猬感染“紅斑綜合征”后菌群結(jié)構(gòu)特征分析

聚類結(jié)果分析表明，在門水平上，光棘球海膽、中間球海膽、海刺猬在注射燦爛弧菌菌懸液前后體腔內(nèi)優(yōu)勢菌門均為變形菌門、擬桿菌門，這與Wang等[18]對患“紅斑綜合征”海膽與健康海膽體壁的高通量測序和分類序列分析所檢測的菌群結(jié)果一致。棘皮動物只存在非特異性免疫，其免疫應(yīng)答是由體腔細胞和多種體液免疫因子共同介導(dǎo)，主要是對進入體內(nèi)的異物進行識別、降解、排除及修復(fù)傷口創(chuàng)面，體腔液中的菌群互作模式在此過程中則發(fā)揮重要作用[32]。由此可見，伴隨著病原菌的繁殖,海膽體腔液的菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，機體內(nèi)環(huán)境菌群紊亂，免疫系統(tǒng)受損，病害發(fā)生[33,34]。王軼南等[33]研究表明，隨著病原菌的侵染和增殖，患病中間球海膽體內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化,體腔液菌群中會有部分細菌消亡或者含量明顯下降。本實驗中，海膽被燦爛弧菌菌液刺激感染“紅斑綜合征”后，體腔內(nèi)的厭氧環(huán)境被破壞，兼性厭氧菌大量增殖（主要為變形菌門）[35]，變形菌門豐度顯著提高，極易破壞菌群的穩(wěn)態(tài)，增加機體患病的可能[36]。Shin 等[37]研究發(fā)現(xiàn)，變形菌門豐度的增加是微生物群落不穩(wěn)定（生態(tài)失調(diào)）的標志，也是疾病的潛在診斷標準，這與本實驗結(jié)果相符。在本研究中擬桿菌門作為海膽的次優(yōu)勢菌門同樣也是海洋浮游細菌的重要組成部分，可在海水中營浮游生活，具有豐富的遺傳和代謝多樣性，可通過發(fā)酵作用分解多糖，產(chǎn)生胞外水解酶來降解生物大分子，如幾丁質(zhì)、瓊脂、DNA 等，是碳循環(huán)中的重要功能類群[38,39]。擬桿菌門在一定程度上具有抗菌多樣性，在對抗病原過程中可以發(fā)揮關(guān)鍵作用[40]。擬桿菌門主要為黃桿菌綱（Flavobacteriia），該綱大量存在于水生環(huán)境中[41]，在感染“紅斑綜合征”后，水體致病菌的數(shù)量大幅提升，可能導(dǎo)致黃桿菌綱豐度下降，這也在一定程度上解釋了注射燦爛弧菌菌懸液后海膽體腔內(nèi)擬桿菌門豐度會出現(xiàn)下降的趨勢。

從屬水平上來看，3 種海膽在感染“紅斑綜合征”后體腔內(nèi)弧菌屬豐度顯著提高，其中光棘球海膽與海刺猬體腔內(nèi)弧菌屬豐度可達95%以上。中間球海膽體腔內(nèi)弧菌屬豐度則為48.96%。Liu 等[42]研究發(fā)現(xiàn)，弧菌主要通過分泌蛋白酶、磷脂酶和溶血素等攻擊宿主細胞，損傷動物機體。此前有研究表明，弧菌可以粘附在海膽病灶體壁處，分泌細胞外酶，創(chuàng)傷面不斷增大，弧菌屬大量繁殖，影響機體健康[43]。本實驗中，中間球海膽在感染“紅斑綜合征”后，體腔內(nèi)可鑒別的次優(yōu)勢菌屬為葡萄球菌屬（Staphylococcus），其細胞壁含有大量的葡萄球菌蛋白A（SPA）[44]。SPA 可與多種動物免疫球蛋白（IgG）結(jié)合[45]，抑制IgG 與吞噬細胞的結(jié)合，干擾吞噬細胞的吞噬作用，減弱宿主對細菌的免疫反應(yīng)[46]。據(jù)此推測注射燦爛弧菌懸液后3 種海膽體腔內(nèi)不同菌屬的細菌會隨著外界環(huán)境的變化及時做出調(diào)整[47]，以至于菌群結(jié)構(gòu)整體發(fā)生了變化，機體免疫力下降，病害發(fā)生。目前已知正海膽（Echinus esculentus）體腔液細菌組成主要為弧菌、假單胞菌和交替單胞菌[48]。Wang 等[23]采用16S rDNA 測序分析鑒定，致病菌（Psychrobacter）（62.89%）、弧菌（Vibrio）（32.47%）和葡萄球菌（Staphylococcus）（2.87%）是中間球海膽“紅斑病”的優(yōu)勢菌屬，與本研究結(jié)果相符。在本研究中，一種新的“紅斑綜合征”致病菌被確認為燦爛弧菌。實驗結(jié)果顯示，中間球海膽被感染后，體壁與圍口膜處可明顯觀察到紅斑癥狀，體壁腐爛處釋放大量的能量，胞外產(chǎn)物也可以為弧菌提供營養(yǎng)，有助于弧菌的生長[49]。結(jié)合Sun 等[14]、Li等[13]前期研究進展與本實驗結(jié)果來看，弧菌在組織破壞過程中起著重要作用，是致病的主要病原體之一。

COG、KEGG 數(shù)據(jù)庫比對發(fā)現(xiàn)，注射燦爛弧菌菌懸液后，不同種海膽體腔內(nèi)菌群功能都有集中在信號傳導(dǎo)機制、轉(zhuǎn)錄、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運與代謝、碳水化合物運輸和代謝、無機離子運輸與代謝、防御機制、細胞壁/膜/包膜生物發(fā)生。實際上，這些功能與微生物生存所必需的功能吻合，如參與碳水化合物、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝[50]。中間球海膽受到了病原的刺激，觸發(fā)了自身非特異性免疫，加強了其防御機制功能豐度；同時由于病原的復(fù)制增多，其轉(zhuǎn)錄水平會提高，增強了其轉(zhuǎn)錄功能豐度，提高了對應(yīng)RNA 的處理和修飾功能豐度。中間球海膽感染“紅斑綜合征”后，出現(xiàn)“紅斑”病征，體壁存在微小的腐爛，潰瘍的發(fā)生伴隨著脂質(zhì)和蛋白質(zhì)成分的分解，能量的生產(chǎn)與轉(zhuǎn)換功能豐度得到了提高[23]。免疫細胞對氨基酸有特定的需求，而生長因子刺激和T 細胞激活可誘導(dǎo)其快速增殖，增加氨基酸轉(zhuǎn)運蛋白的表達，表明該過程需要增強氨基酸的攝取[51]。在本研究中，光棘球海膽在感染“紅斑綜合征”后，氨基酸代謝等相關(guān)功能顯著下降，而海刺猬在感染“紅斑綜合征”死亡后，也同樣沒有表現(xiàn)出“紅斑”病征，在染病后其細胞外結(jié)構(gòu)、細胞骨架、細胞運動相關(guān)功能蛋白顯著下降，因此，二者死亡速度遠快于中間球海膽。本研究中，光棘球海膽和海刺猬在感染“紅斑綜合征”后體腔內(nèi)變形菌門細菌數(shù)量顯著增加，細菌群落多樣性提高后，可以加速蛋白質(zhì)代謝功能[52]，促使蛋白翻譯速度增強，引起信息存儲與處理相關(guān)功能蛋白上調(diào)。然而目前對于光棘球海膽和海刺猬體腔內(nèi)菌群功能特征研究資料較少，有待于進一步探究。

3.3 水產(chǎn)動物疾病種間傳播的潛在可能

近年來，我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)穩(wěn)健發(fā)展，養(yǎng)殖產(chǎn)量持續(xù)增長，水產(chǎn)養(yǎng)殖動物種類穩(wěn)健增多，養(yǎng)殖密度逐步擴大，養(yǎng)殖模式也日漸豐富[54,55]，但現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)都是以集約化管理和高密度養(yǎng)殖來實現(xiàn)最大利潤，大多數(shù)養(yǎng)殖戶一味地追求產(chǎn)量，養(yǎng)殖環(huán)境日趨惡化，病害頻繁發(fā)生，疾病傳播的機會大幅增加，養(yǎng)殖動物受損十分嚴重[56,57]。

目前關(guān)于疾病在魚類、蝦類等水產(chǎn)養(yǎng)殖動物中的傳播研究較為廣泛。如愛德華氏菌的感染可以在尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）和尖齒胡鯰（Clarias gariepinus）間傳播[58]。由副溶血弧菌導(dǎo)致的急性肝胰腺壞死病（AHPND）作為對蝦中傳染性極強的細菌性疾病之一，能夠感染多種對蝦，2013 年墨西哥西北部養(yǎng)殖場出現(xiàn)大范圍地域傳播，導(dǎo)致凡納濱對蝦大面積死亡[59]。細菌病原體多年來一直影響著海洋軟體動物，在貝類中也是屢見不鮮，弧菌屬可以感染幼蟲、幼年和成年軟體動物，包括牡蠣、貽貝、鮑、蛤蜊和扇貝，傳播速度極快[60,61]。

本實驗分離鑒定了“紅斑綜合征”馬糞海膽病原菌，并制作菌懸液注射到健康光棘球海膽、中間球海膽、海刺猬體內(nèi)。結(jié)果3 種海膽均表現(xiàn)出“紅斑”病征或死亡。推測海膽“紅斑綜合征”也有種間傳播的潛在威脅，為此在同種水產(chǎn)動物種間混養(yǎng)以及不同種水產(chǎn)動物混養(yǎng)時對于水體環(huán)境以及物種狀態(tài)都應(yīng)及時檢查，嚴防疾病的傳播。