• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    LC-MS法對畜禽肉中四環(huán)素類藥物含量的測定與分析

    2024-01-09 11:59:02張永芳李曉
    食品工業(yè) 2023年12期
    關(guān)鍵詞:金霉素鴨肉土霉素

    張永芳,李曉

    1.鄭州科技學院食品科學與工程學院(鄭州 450000);2.鄭州科技學院鄭州市食品安全快速檢測重點實驗室(鄭州 450000)

    四環(huán)素類藥物是由金黃色鏈霉菌所形成的一類抗菌化合物,能夠抑制細菌蛋白質(zhì)合成,主要包括四環(huán)素、土霉素、金霉素和強力霉素等,畜牧業(yè)中多用于治療畜禽疾病和改善飼料利用率[1]。但四環(huán)素類藥物的過度使用,不僅會使畜禽動物產(chǎn)生耐藥性,導致疾病的突然爆發(fā),對畜牧業(yè)的發(fā)展造成一定威脅;而且畜禽肉制品中藥物殘留還會通過食物鏈富集作用進入人體,從而產(chǎn)生中毒、過敏反應、三致作用(致癌、致畸、致突變作用)、病原菌耐藥性及對影響胃腸道菌群等,危害人體健康[2]。我國相關(guān)法律規(guī)定,四環(huán)素類藥物的最大殘留限量在食品動物肌肉組織中為100~600 μg/kg[3]。四環(huán)素類藥物檢測技術(shù)主要免疫分析法(放射免疫分析、熒光免疫分析等)[4]、理化分析法(薄層色譜法、高效液相色譜法、液相色-譜質(zhì)譜法)[5-8]。其中液相色譜-質(zhì)譜法(LC-MS)將液相色譜和質(zhì)譜優(yōu)點結(jié)合起來,其分離能力強、高選擇性、高靈敏度,被廣泛地應用在食品分析領域中[9]。此次研究依據(jù)GB/T 21317—2007《動物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測方式 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法與高效液相色譜法》,對畜禽類樣品的前處理、質(zhì)譜和色譜條件進行優(yōu)化,以建立一個更便捷、高效的LC-MS快速檢測方法,為四環(huán)素類藥物的檢測提供快速、有效的檢測方法。

    1 材料與方法

    1.1 材料與試劑

    試驗材料選自鄭州市銀合農(nóng)貿(mào)市場隨機選擇的豬肉、雞肉和鴨肉。

    無水硫酸鈉:分析純,福晨(天津)化學試劑有限公司;乙二胺四乙酸二鈉(分析純,天津致遠化學試劑有限公司);乙酸乙酯(分析純,天津致遠化學試劑有限公司;檸檬酸(分析純,天津致遠化學試劑有限公司);磷酸氫二鈉(分析純,天津市永大化學試劑有限公司);乙酸(色譜純,天津致遠化學試劑有限公司);乙腈:色譜純,福晨(天津)化學試劑有限公司,天津致遠化學試劑有限公司;甲醛(色譜純,天津致遠化學試劑有限公司);甲酸(色譜純,天津致遠化學試劑有限公司);標準物質(zhì):土霉素、四環(huán)素、金霉素、強力霉素,德國Dr.Ehrenstorfer GmbH(純度均大于95%);純凈水(一級,杭州娃哈哈集團有限公司)。

    1.2 儀器與設備

    賽默飛TSQ Quantis Plus三重四極桿質(zhì)譜儀(美國);電子分析天平(TXB622L,日本島津);電子分析天平(AUX120,日本島津);氮吹儀(HSC-24B,天津恒奧科技有限公司);旋渦混勻器(IKA/艾卡MS3,德國);多管旋渦混合儀(E0AAHM-01,上海安譜實驗科技股份有限公司);超聲波清洗機(SB25-12DTD,寧波新芝);高速冷凍離心機(3K15,北京五洲東方科技發(fā)展有限公司);50 mL尖底離心管(北京蘭杰科技有限公司);15 mL尖底離心管(北京蘭杰科技有限公司);HLB固相萃取柱(60 mg/3 mL,江蘇杰島高新材料科技有限公司);攪碎機;試驗所用一次性吸管、一次性使用無菌注射器及0.22 μm有機濾膜,皆由河南省安必諾檢測技術(shù)有限公司實驗室提供。

    1.3 溶液配制

    1.3.1 四環(huán)素標準儲備液的配制

    依據(jù)純度折算為100%質(zhì)量的四環(huán)素、土霉素、強力霉素、金霉素各稱取10.0 mg,分別通過用甲醇溶解將其定容至100 mL容量瓶內(nèi),所獲得的質(zhì)量濃度為100 mg/L,在-18 ℃以下保存,儲備液放入棕色瓶中,可儲存1年以上。

    1.3.2 混合標準工作溶液的配制

    根據(jù)需要,將0.1%甲酸+5%甲醇水溶液稀釋至所用濃度,制備混合標準工作溶液以便立即使用。

    1.3.3 其他溶液的配制

    1.3.31 0.1 mol/L檸檬酸溶液

    準確稱取21.01 g檸檬酸,用水定容至1 000 mL,搖勻,使其溶解。

    1.3.32 0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液

    準確稱取28.41 g磷酸氫二鈉,用水定容至1 000 mL,搖勻,使其溶解。

    1.3.33 Mcllvaine緩沖溶液

    將1 000 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液與625 mL 0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液混合。

    1.3.34 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvine緩沖溶液

    稱取60.5 g乙二胺四乙酸二鈉放入1 625 mL Mcllvaine緩沖溶液中,并旋渦1 min,使其完全溶解。

    1.3.35 甲醇+水

    準確量取5 mL甲醇和95 mL水將其混合。

    1.3.36 甲醇+乙酸乙酯

    量取10 mL甲醇與90 mL乙酸乙酯混合。

    1.3.37 OasisHLB固相萃取柱

    規(guī)格為60 mg/30 mL,使用前用5 mL甲醇和5 mL水進行預處理,保持柱體濕潤。

    1.3.38 0.1%甲酸

    量取1 mL甲酸,用水定容至1 000 mL。

    1.3.39 5%甲醇

    量取5 mL甲醇,用水定容至100 mL。

    1.3.3.10 0.1%甲酸-5%甲醇

    1 000 mL 0.1%甲酸與100 mL 5%甲醇混合。

    1.3.3.11 1%乙酸乙腈溶液

    準確量取10 mL乙酸與990 mL乙腈,將其混勻。

    1.4 試驗方法

    1.4.1 樣品制備及貯存

    為防止(豬肉、雞肉、鴨肉)在空氣中受到污染或殘留物量發(fā)生改變,在所有樣品中分別取800 g,通過機器高速攪拌均勻攪碎,均分成2份,1份為備樣,1份用做分析,裝入干凈自封袋中,密封過后貼標簽做標記,2份別用于留樣和分析,將標記的樣品在-18℃以下的溫度下冷凍儲存。

    1.4.2 測定步驟

    1.4.21 國標方法的樣品前處理[10]

    稱取2.0 g(精確到0.01 g)待測樣品,分別放入50 mL尖底離心管中,依次加入20,20和10 mL的0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvainc緩沖液,并在冰水中進行超聲波處理,進行3次提取,每次旋渦1 min,超聲波處理10 min,離心速度3 000 r/min,離心5 min(溫度控制在15 ℃),合并上清液,定容至50.0 mL,渦旋5 000 r/min,冷凍離心10 min(溫度控制為15 ℃),并用濾紙過濾,耐心等待凈化。

    用移液槍精準吸取10 mL提取液,以1滴/s的速度過HLB固相萃取柱,使用前用5 mL甲醇和5 mL水進行活化。等待液體全部流完,依次用5 mL水和5 mL甲醇-水淋洗HLB固相萃取柱,全部倒掉流出液,抽干5 min,用10 mL甲醇+乙酸乙酯進行洗脫,將洗脫液用氮氣吹至近干(溫度控制40 ℃以下),加入1 mL 0.1%甲酸5%甲醇水溶解雜質(zhì),過0.22 μm濾膜,用LC-MS法測定。

    1.4.22 優(yōu)化后的樣品前處理

    準確稱取2.0 g(精確到0.01 g)樣品已被攪碎后的試樣放入50 mL尖底離心管中,在離心管中添加4 g無水硫酸鈉和4 g乙二胺四乙酸二鈉,加入10 mL 1%乙酸乙腈,對其進行渦旋提取5min,利用超聲波10 min,按6 000 r/min離心5 min。用一次性5 mL吸管,吸取5 mL上清液放入15 mL離心管中,收集溶液在40 ℃內(nèi)水浴,直到氮氣吹至近干,加1 mL 0.1%甲酸5%甲醇水溶液溶解雜質(zhì),上振蕩器渦旋1 min,超聲波3 min,按9 000 r/min離心3 min,離心完后,棄去上層油脂,立即用注射器吸出,并通過0.22 μm有機濾膜上機,供LC-MS法測定。

    1.4.3 色譜條件與質(zhì)譜條件

    1.4.31 色譜條件

    色譜柱Accucore C18(150 mm×2.1 mm,2.6 μm);柱溫30 ℃;流速0.3 mL/min;進樣量10 μL;流動相A2為0.1%甲酸水,B1相為甲醇。

    表1 梯度洗脫條件

    1.4.32 質(zhì)譜條件

    離子源,采用電噴霧離子;掃描方式,采用正離子掃描;檢測方式,采用多重反應監(jiān)測(SRM);噴霧電壓3 500 V;鞘氣壓力35 Arb;輔助氣壓力5 Arb;尾吹氣壓力0 Arb;離子傳輸管溫度350 ℃;霧化溫度350 ℃。

    表2 化合物檢測離子對

    1.5 方法驗證

    1.5.1 線性范圍

    選取空白樣品,加入標準系列標準溶液,按照優(yōu)化后的前處理步驟進行操作,上機檢測,縱坐標(y)表示峰值面積,橫坐標(x)表示溶液濃度,繪制標準曲線,得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)R2值,判斷線性關(guān)系是否良好。

    1.5.2 標準曲線和加標回收率試驗

    1.5.21 標準曲線

    配制系列的標準溶液,用0.1%甲酸5%甲醇水溶液配制5,10,25,50和100 μg/mL的系列工作液,分別從低濃度到高濃度進樣,縱坐標表示峰面積,橫坐標表示溶液濃度,制作標準曲線。

    1.5.22 加標回收率試驗

    準確稱取2.0 g(精確到0.01 g)樣品,將樣品(豬肉、雞肉、鴨肉)分別做3次平行樣品,將樣品在不同濃度下制備3個50 mL尖底離心管,分別為20,50和100 μg/kg質(zhì)量分數(shù)添加4種藥物混合標液。運用式(1)計算[11],并進行3次平行試驗,計算平均回收率。

    1.5.3 檢測限和定量限的確定

    檢出限的定義為添加較低含量目標物進行添加回收試驗時可產(chǎn)生3倍信噪比(rSN≥3)的化合物的質(zhì)量濃度,而定量限是指通過添加法經(jīng)測定方法的全過程測定可以可靠地確定樣品中化學污染物的最低濃度,一般也認為是至少產(chǎn)生10倍信噪比(rSN≥10)的化合物的質(zhì)量濃度[12]。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 儀器方法優(yōu)化結(jié)果

    四環(huán)素類藥物(四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素)混合標準溶液、豬肉空白樣品、雞肉空白樣、鴨肉空白樣品添加藥物。樣品加標濃度為100 μg/mL,將國標方法與該方法平均回收率進行比較見表3,該方法采用1%乙酸乙腈提取溶劑,回收率優(yōu)于國標法,該方法準確度高、操作過程簡便快捷、成本低。

    表3 國標法和試驗方法平均回收率

    由表3的檢測結(jié)果可知,優(yōu)化后的試驗方案中采用1%乙酸乙腈,提取效果好,樣品中四環(huán)素類藥物(四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素)的加標回收率均比優(yōu)化前要高。國標法試驗方法的豬肉加標的平均回收率為48.3%~109.6%,雞肉加標的平均回收率49.7%~115.6%,鴨肉加標的平均回收率50.9%~60.6%;SRSD為2%~11%。優(yōu)化后的試驗方法測得豬肉加標的平均回收率82.8%~119.5%,雞肉加標的平均回收率83.2%~120.4%,鴨肉加標的平均回收率86.9%~94.6%,SRSD為0.7%~3.6%。

    試驗比較1%乙酸乙腈和0.1 mol/L Na2EDTAMcllvainc緩沖液提取效果,但0.1 mol/L Na2EDTAMcllvaine緩沖溶液提取液,渾濁且黏稠,雜質(zhì)多,濾紙過濾時間長,容易堵塞HLB柱。針對HLB柱堵塞問題,在緩沖溶液中加入乙腈,有利于促進沉淀蛋白,提取液變清透,當乙腈含量增加,沉淀蛋白效果更佳,但使用HLB柱凈化時,為降低乙腈含量需要稀釋提取液,過程繁瑣。試驗中優(yōu)化乙酸含量,發(fā)現(xiàn)加入1%乙酸時,提取效果更優(yōu),可獲得很高的待測物的加標回收率。因此,采用1%乙酸乙腈進行提取。另外,動物源性食品中脂肪含量較高,對回收率和檢測結(jié)果造成一定程度影響,提取溶液用乙腈時,大量干擾物質(zhì)會被抽離出來,大部分干擾物是油脂,為將樣品中的油脂類的干擾物抽離出去,采用高速冷凍離心去除油脂,該方法在低溫情況下會將油脂類的干擾物從溶液中分離出來,以達到最佳的凈化分離效果。復溶后,高速冷凍離心能很好地去除樣品中的油脂類干擾物。

    2.2 四環(huán)素類藥物(四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素)標準曲線線性關(guān)系

    配制一系列的標準溶液,按照低濃度到高濃度依次進樣,質(zhì)量濃度為5,10,25,50和100 μg/mL的系列工作液,以峰面積為縱坐標,對應濃度為橫坐標,繪制標準曲線。

    2.2.1 四環(huán)素標準工作曲線

    四環(huán)素在不同濃度不同樣品經(jīng)過檢測后,求得的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表4,由有相關(guān)系數(shù)(R2>0.999)可知,四環(huán)素在5~100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系較好,適合用于樣品的檢測。

    表4 檢測豬肉、雞肉、鴨肉中四環(huán)素工作曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

    2.2.2 土霉素標準工作曲線

    土霉素在不同濃度不同樣品經(jīng)過檢測后,求得的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表5,由相關(guān)系數(shù)(R2>0.999)可知,土霉素在質(zhì)量濃度范圍5~100 μg/mL時,線性關(guān)系較好,適合用于樣品的檢測。

    表5 檢測豬肉、雞肉、鴨肉中土霉素工作曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

    2.2.3 金霉素的標準工作曲線

    金霉素不同濃度不同樣品經(jīng)過檢測后,求得的回歸方程及相關(guān)系數(shù),見表6。由相關(guān)系數(shù)(R2>0.999)可知,金霉素在質(zhì)量濃度范圍5~100 μg/mL時,線性關(guān)系比較好,適合用于樣品的檢測。

    表6 檢測豬肉、雞肉、鴨肉中金霉素工作曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

    2.2.4 測定強力霉素的標準工作曲線

    配制的強力霉素不同濃度不同樣品進過檢測后,求得的回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表7。由相關(guān)系數(shù)(R2>0.999)可知,強力霉素在5~100 μg/mL質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系較好,適合用于樣品的檢測。

    表7 檢測豬肉、雞肉、鴨肉中強力霉素工作曲線的回歸方程及相關(guān)系數(shù)

    四環(huán)素類藥物在質(zhì)量濃度范圍5~100 μg/mL之間,不同濃度與響應值(峰值面積)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系,R2值在0.999~1之間,均大于0.999。

    2.3 回收率和相對標準偏差

    2.3.1 豬肉樣品

    檢測時用豬肉樣品在20,50和100 μg/mL這3個水平質(zhì)量濃度上分別進行添加回收率試驗,并且進行3次平行試驗。四環(huán)素類藥物(四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素)在不同樣品中準確度結(jié)果見表8。

    表8 測定豬肉中四環(huán)素類藥物(四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素)回收率

    由表8可知,測定豬肉中四環(huán)素類藥物(土霉素、金霉素、四環(huán)素、強力霉素)的回收率在20,50和100 μg/kg這3個質(zhì)量分數(shù)水平:豬肉中加標質(zhì)量分數(shù)20 μg/kg時,四環(huán)素、土霉素、強力霉素、金霉素平均回收率分別為85.5%,86%,137.2%和126.1%。加標質(zhì)量分數(shù)50 μg/kg時,四環(huán)素、土霉素、強力霉素、金霉素平均回收率分別為108.9%,115%,113.2%和107.8%。加標質(zhì)量分數(shù)100 μg/kg時,四環(huán)素、土霉素、強力霉素、金霉素平均回收率分別為86%,82.8%,119.5%和85.8%。

    2.3.2 雞肉樣品

    檢測時用雞肉樣品在20,50和100 μg/kg這3個水平質(zhì)量分數(shù)上分別進行添加回收率試驗,并且進行3次平行試驗。四環(huán)素類藥物(土霉素、金霉素、四環(huán)素、強力霉素)在不同樣品中準確度結(jié)果見表9。

    由表9可知,測定雞肉中四環(huán)素類藥物(土霉素、金霉素、四環(huán)素、強力霉素)的回收率在20,50和100 μg/kg這3個質(zhì)量分數(shù)水平:雞肉中加標質(zhì)量分數(shù)20 μg/kg時,四環(huán)素、土霉素、強力霉素、金霉素平均回收率分別為128.6%,96.6%,211.6%和158.3%;加標質(zhì)量分數(shù)50 μg/kg時,四環(huán)素、土霉素、強力霉素、金霉素平均回收率分別為149.6%,106.9%,136.1%和109.2%;加標質(zhì)量分數(shù)100 μg/kg時,四環(huán)素、土霉素、強力霉素、金霉素平均回收率分別為83.2%,90.6%,120.4%和95.9%。

    表9 測定雞肉中四環(huán)素類藥物(四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素)回收率

    2.3.3 鴨肉樣品

    檢測時用鴨肉樣品在20,50和100 μg/kg這3個水平質(zhì)量分數(shù)上分別進行添加回收率試驗,并且進行3次平行試驗。四環(huán)素類藥物(土霉素、金霉素、四環(huán)素、強力霉素)在不同樣品中準確度結(jié)果見表10。

    表10 測定鴨肉中四環(huán)素類藥物(四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素)的回收率

    由表10可知,測定鴨肉中四環(huán)素類藥物(土霉素、金霉素、四環(huán)素、強力霉素)的回收率在20,50和100 μg/kg這3個質(zhì)量分數(shù)水平:鴨肉中加標質(zhì)量分數(shù)20 μg/kg時,四環(huán)素、土霉素、強力霉素、金霉素平均回收率分別為183.4%,164.1%,163.3%和118.5%;加標質(zhì)量分數(shù)50 μg/kg時,四環(huán)素、土霉素、強力霉素、金霉素平均回收率分別為144.7%,169.8%,190.5%和129.6%;加標質(zhì)量分數(shù)100 μg/kg時,四環(huán)素、土霉素、強力霉素、金霉素平均回收率分別為86.9%,87.5%,94.6%和88.6%。

    綜上,試驗方法檢測豬肉、雞肉、鴨肉中四環(huán)素類藥物殘留,準確稱取2.0 g(精確到0.01 g)樣品,樣品中添加混合標準工作液,加標質(zhì)量分數(shù)分別為20,50和100 μg/kg,按照優(yōu)化后的前處理進行操作,四環(huán)素平均回收率為83.2%~183.4%,土霉素平均回收率為82.8%~169.8%,強力霉素為94.6%~211.6%,金霉素為85.8%~158.3%,SRSD在0.7%~9.0%之間,SRSD均小于10%,均符合獸藥殘留分析的要求。

    2.4 檢測限和定量限的確定

    加標水平5 μg/kg情況下,測得四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素的rSN≥3,加標水平25 μg/kg情況下,測得四環(huán)素、土霉素、金霉素、強力霉素的rSN≥10。因此,樣品中的檢出限為5 μg/kg,定量限為25 μg/kg。

    3 結(jié)語

    試驗采用LC-MS法對四環(huán)素類藥物進行檢測與研究,通過對樣品前處理的優(yōu)化,使用1%乙酸乙腈溶液提取,提取效果好,樣品的回收率高。LC-MS法測定四環(huán)素類藥物素殘留,對豬肉、雞肉、鴨肉進行回收率試驗,測得四環(huán)素平均回收率83.2%~183.4%,土霉素平均回收率82.8%~169.8%,強力霉素平均回收率94.6%~211.6%,金霉素平均回收率85.8%~158.3%。通過對4種四環(huán)素類藥物質(zhì)量濃度5~100 μg/mL內(nèi)范圍進行考察,不同濃度與響應值(峰值面積)都有良好的線性關(guān)系,R2≥0.999,準確度較高。優(yōu)化后的方法檢出限為5 μg/kg,而定量限為25 μg/kg,優(yōu)化后的方法靈敏度較好,因此更符合四環(huán)素獸藥殘留的定量分析。過試驗數(shù)據(jù)與研究,試驗方法簡便快捷、提取回收率高、準確度和靈敏度高,適合廣泛應用于動物源性食品中檢測四環(huán)素類藥物,HLB固相萃取柱市場價1支最低在6元左右,優(yōu)化后的前處理降低了成本。

    猜你喜歡
    金霉素鴨肉土霉素
    鹽酸金霉素和超級鹽酸金霉素在肉雞體內(nèi)的藥代動力學和組織殘留量測定
    抱怨
    抱 怨
    高效液相色譜法對畜禽肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素的殘留檢測研究
    不同金霉素預混劑對斷奶仔豬生產(chǎn)性能及血液中金霉素濃度的影響
    中國飼料(2020年7期)2020-06-23 03:02:26
    吃鴨肉的宜與忌
    飲食保健(2018年19期)2018-01-27 19:01:44
    間接競爭酶聯(lián)適配體檢測食品中土霉素
    金霉素在畜牧業(yè)中的應用概述
    土霉素高產(chǎn)菌株N56育種及工業(yè)發(fā)酵條件優(yōu)化
    生物質(zhì)碳點的合成及初步用于鹽酸土霉素的測定
    精品福利观看| 国产亚洲精品久久久com| 国产一区二区在线观看日韩| 两个人的视频大全免费| 不卡视频在线观看欧美| 国产大屁股一区二区在线视频| 色av中文字幕| 国内精品久久久久久久电影| www.www免费av| 91在线精品国自产拍蜜月| 久久久久久大精品| 久久中文看片网| 他把我摸到了高潮在线观看| 久久久午夜欧美精品| 一个人看的www免费观看视频| 国产精品野战在线观看| 欧美一级a爱片免费观看看| 日本一本二区三区精品| 最近在线观看免费完整版| 日韩强制内射视频| 五月玫瑰六月丁香| 国产精品免费一区二区三区在线| 在线观看一区二区三区| 男人舔女人下体高潮全视频| 欧美日本亚洲视频在线播放| 中文字幕av成人在线电影| 婷婷精品国产亚洲av| 免费看光身美女| 中文字幕av在线有码专区| av黄色大香蕉| 老司机午夜福利在线观看视频| 非洲黑人性xxxx精品又粗又长| 日韩亚洲欧美综合| 性插视频无遮挡在线免费观看| 综合色av麻豆| 十八禁网站免费在线| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 亚洲综合色惰| 国内揄拍国产精品人妻在线| 精华霜和精华液先用哪个| 搡老岳熟女国产| 久久国产乱子免费精品| 久久国产乱子免费精品| 日韩欧美精品v在线| 国产精品无大码| 2021天堂中文幕一二区在线观| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国产精品美女特级片免费视频播放器| 亚洲va在线va天堂va国产| 久久久久国内视频| 日本a在线网址| 日日干狠狠操夜夜爽| 69人妻影院| av在线天堂中文字幕| 久久久久久大精品| 日韩强制内射视频| 成人特级av手机在线观看| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产精品无大码| 日韩人妻高清精品专区| 动漫黄色视频在线观看| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 欧美xxxx性猛交bbbb| 久久九九热精品免费| 欧美黑人巨大hd| 69人妻影院| 日本免费a在线| 欧美性感艳星| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 国产一区二区激情短视频| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 国产精品av视频在线免费观看| 久久这里只有精品中国| 亚洲精品成人久久久久久| 国产精品久久久久久亚洲av鲁大| av中文乱码字幕在线| 亚洲精品在线观看二区| 此物有八面人人有两片| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 国内精品美女久久久久久| 欧美一区二区精品小视频在线| 欧美一区二区精品小视频在线| 国产爱豆传媒在线观看| 国内精品美女久久久久久| 在线观看免费视频日本深夜| 国产精品亚洲一级av第二区| 亚洲国产高清在线一区二区三| h日本视频在线播放| 国产精品久久久久久久电影| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 成年版毛片免费区| 波野结衣二区三区在线| 国内精品一区二区在线观看| 又黄又爽又免费观看的视频| 黄色一级大片看看| 特级一级黄色大片| 中国美白少妇内射xxxbb| 色5月婷婷丁香| 成年版毛片免费区| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 亚洲av二区三区四区| 在线播放无遮挡| 国产伦精品一区二区三区四那| 日韩欧美在线乱码| 老熟妇乱子伦视频在线观看| 免费在线观看影片大全网站| 男人舔奶头视频| 日韩一本色道免费dvd| 日日啪夜夜撸| 一区二区三区高清视频在线| av在线蜜桃| 欧美一区二区精品小视频在线| 波多野结衣高清无吗| 亚洲乱码一区二区免费版| 亚洲成人中文字幕在线播放| 男人舔女人下体高潮全视频| 久久婷婷人人爽人人干人人爱| 国产欧美日韩精品亚洲av| 日韩强制内射视频| 两个人视频免费观看高清| 成人午夜高清在线视频| 成人午夜高清在线视频| 禁无遮挡网站| 俺也久久电影网| 成人性生交大片免费视频hd| 女人被狂操c到高潮| 亚洲久久久久久中文字幕| 中文在线观看免费www的网站| netflix在线观看网站| 欧美日韩国产亚洲二区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 亚洲专区中文字幕在线| 18禁黄网站禁片免费观看直播| 日本精品一区二区三区蜜桃| 舔av片在线| 亚洲黑人精品在线| 成人性生交大片免费视频hd| 91精品国产九色| 亚洲国产精品久久男人天堂| 国内精品久久久久精免费| 亚洲成av人片在线播放无| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 波野结衣二区三区在线| 12—13女人毛片做爰片一| 无遮挡黄片免费观看| 久久久久久久久大av| 黄色视频,在线免费观看| 中国美女看黄片| bbb黄色大片| 老司机午夜福利在线观看视频| 日本在线视频免费播放| 精品一区二区三区av网在线观看| 国产在线男女| 国产精品国产高清国产av| 22中文网久久字幕| eeuss影院久久| 噜噜噜噜噜久久久久久91| 成人性生交大片免费视频hd| 乱码一卡2卡4卡精品| 伦理电影大哥的女人| 久久久午夜欧美精品| 一进一出好大好爽视频| 国产一区二区在线av高清观看| 免费看美女性在线毛片视频| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国内精品一区二区在线观看| 成人av一区二区三区在线看| 国产精品福利在线免费观看| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 99热只有精品国产| 听说在线观看完整版免费高清| 亚洲va在线va天堂va国产| 最新在线观看一区二区三区| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产午夜精品论理片| 动漫黄色视频在线观看| 亚洲精品成人久久久久久| 亚洲国产欧美人成| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲va在线va天堂va国产| 特大巨黑吊av在线直播| a级一级毛片免费在线观看| 伦精品一区二区三区| 国产女主播在线喷水免费视频网站 | 国产蜜桃级精品一区二区三区| 欧美性猛交黑人性爽| 国产精品久久视频播放| 亚洲成a人片在线一区二区| av在线老鸭窝| 久久久久免费精品人妻一区二区| 免费av不卡在线播放| 日本五十路高清| 日本 av在线| 欧美又色又爽又黄视频| 亚洲美女视频黄频| 日本a在线网址| 成人av在线播放网站| 别揉我奶头 嗯啊视频| 少妇的逼水好多| 看免费成人av毛片| 成人av一区二区三区在线看| 国产不卡一卡二| 乱人视频在线观看| 男人的好看免费观看在线视频| 美女高潮的动态| 精品国内亚洲2022精品成人| 国产熟女欧美一区二区| 他把我摸到了高潮在线观看| 毛片女人毛片| 99久国产av精品| 99久久精品一区二区三区| 白带黄色成豆腐渣| ponron亚洲| 日韩中字成人| 亚洲最大成人av| 简卡轻食公司| 黄色丝袜av网址大全| 久久久久久久久久成人| 国产乱人视频| 国产精品国产三级国产av玫瑰| 亚洲最大成人av| 精品欧美国产一区二区三| 久久久久精品国产欧美久久久| 久久精品国产亚洲av涩爱 | 国产黄a三级三级三级人| 狠狠狠狠99中文字幕| 狂野欧美白嫩少妇大欣赏| 观看免费一级毛片| 少妇高潮的动态图| 亚洲精品一区av在线观看| 久久人人爽人人爽人人片va| 成人午夜高清在线视频| 国产淫片久久久久久久久| av黄色大香蕉| 又黄又爽又免费观看的视频| 最好的美女福利视频网| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 欧美成人a在线观看| 性欧美人与动物交配| netflix在线观看网站| 国产爱豆传媒在线观看| 在线免费观看的www视频| 免费搜索国产男女视频| 成年免费大片在线观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 在线天堂最新版资源| 色噜噜av男人的天堂激情| a级毛片免费高清观看在线播放| 在线观看午夜福利视频| 如何舔出高潮| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 99久久无色码亚洲精品果冻| 亚洲成a人片在线一区二区| 亚洲人成网站高清观看| 免费观看在线日韩| 欧美日韩精品成人综合77777| 国产精品女同一区二区软件 | 黄色配什么色好看| 精品久久久久久,| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 99热6这里只有精品| 波多野结衣巨乳人妻| 人妻夜夜爽99麻豆av| 国产高清视频在线观看网站| 日本一二三区视频观看| 别揉我奶头 嗯啊视频| 亚洲经典国产精华液单| 久久精品国产自在天天线| av在线天堂中文字幕| 亚洲av电影不卡..在线观看| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 国产黄a三级三级三级人| 嫁个100分男人电影在线观看| 国产精品永久免费网站| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 日本免费一区二区三区高清不卡| or卡值多少钱| 成人亚洲精品av一区二区| 成人国产综合亚洲| 免费电影在线观看免费观看| 麻豆国产av国片精品| 淫妇啪啪啪对白视频| h日本视频在线播放| 黄片wwwwww| 亚洲国产精品成人综合色| 干丝袜人妻中文字幕| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 嫩草影视91久久| 综合色av麻豆| a在线观看视频网站| 淫妇啪啪啪对白视频| 日本黄大片高清| 99久久中文字幕三级久久日本| 国模一区二区三区四区视频| 中文在线观看免费www的网站| 久久香蕉精品热| 色吧在线观看| 亚洲最大成人手机在线| 亚洲人成网站高清观看| 国产午夜福利久久久久久| 久久久久久久久大av| 男人和女人高潮做爰伦理| 99热这里只有是精品50| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 国产成年人精品一区二区| 一本一本综合久久| 乱码一卡2卡4卡精品| 99视频精品全部免费 在线| 久久99热这里只有精品18| av视频在线观看入口| 精品99又大又爽又粗少妇毛片 | 免费大片18禁| 免费看日本二区| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 久久国产乱子免费精品| 亚洲av第一区精品v没综合| 久久99热6这里只有精品| 在线播放无遮挡| 亚洲自拍偷在线| 亚洲五月天丁香| 久久国产精品人妻蜜桃| 人妻夜夜爽99麻豆av| 最近视频中文字幕2019在线8| 老司机午夜福利在线观看视频| 少妇熟女aⅴ在线视频| 午夜福利欧美成人| 亚洲五月天丁香| 久久国产精品人妻蜜桃| 悠悠久久av| 麻豆国产97在线/欧美| 国产成人aa在线观看| 尾随美女入室| 97人妻精品一区二区三区麻豆| 日日干狠狠操夜夜爽| 成人鲁丝片一二三区免费| 国产精品99久久久久久久久| 日韩中字成人| 午夜精品久久久久久毛片777| 人人妻人人看人人澡| 男女啪啪激烈高潮av片| 极品教师在线免费播放| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 日日摸夜夜添夜夜添小说| 日本一本二区三区精品| 亚洲美女搞黄在线观看 | 日本黄大片高清| 免费一级毛片在线播放高清视频| av在线老鸭窝| 不卡视频在线观看欧美| 最新中文字幕久久久久| 午夜福利在线观看吧| 欧美一级a爱片免费观看看| 久久欧美精品欧美久久欧美| av视频在线观看入口| 午夜久久久久精精品| 国内精品美女久久久久久| 国产一区二区激情短视频| 欧美中文日本在线观看视频| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 国产激情偷乱视频一区二区| 人人妻人人澡欧美一区二区| 久久久久久久精品吃奶| 久久精品国产鲁丝片午夜精品 | 免费观看的影片在线观看| 少妇的逼水好多| 日韩中字成人| 桃红色精品国产亚洲av| 波多野结衣巨乳人妻| 黄片wwwwww| 真人一进一出gif抽搐免费| 国产亚洲精品av在线| 国产主播在线观看一区二区| 久久久国产成人免费| 日日摸夜夜添夜夜添av毛片 | 欧美极品一区二区三区四区| 亚洲成人免费电影在线观看| 我的女老师完整版在线观看| 日韩 亚洲 欧美在线| 免费av观看视频| 3wmmmm亚洲av在线观看| 能在线免费观看的黄片| 精品福利观看| 在线观看美女被高潮喷水网站| 一本精品99久久精品77| 成人av一区二区三区在线看| а√天堂www在线а√下载| 一本精品99久久精品77| 日韩一本色道免费dvd| 久久6这里有精品| 男女那种视频在线观看| 无遮挡黄片免费观看| 日韩高清综合在线| 看黄色毛片网站| 一a级毛片在线观看| av女优亚洲男人天堂| 日本熟妇午夜| 国产免费av片在线观看野外av| 人妻少妇偷人精品九色| 日韩国内少妇激情av| 久久精品国产清高在天天线| 在线免费观看不下载黄p国产 | 免费人成视频x8x8入口观看| 中文字幕久久专区| 美女大奶头视频| 久久九九热精品免费| 欧美+日韩+精品| 99热网站在线观看| 国产成人aa在线观看| 免费观看在线日韩| 最近视频中文字幕2019在线8| 一卡2卡三卡四卡精品乱码亚洲| 色哟哟哟哟哟哟| 亚洲七黄色美女视频| 亚洲在线观看片| 日本与韩国留学比较| 男插女下体视频免费在线播放| 久久久久免费精品人妻一区二区| 草草在线视频免费看| 人妻少妇偷人精品九色| 成人国产综合亚洲| 亚洲熟妇熟女久久| 亚洲欧美精品综合久久99| 成年女人看的毛片在线观看| 99九九线精品视频在线观看视频| 亚洲国产精品久久男人天堂| av天堂在线播放| 亚洲va在线va天堂va国产| 韩国av一区二区三区四区| 久久久成人免费电影| 一级黄片播放器| 小说图片视频综合网站| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 九色国产91popny在线| av在线观看视频网站免费| 亚洲精华国产精华精| 午夜日韩欧美国产| 国产精品久久久久久精品电影| 国产高清三级在线| 看十八女毛片水多多多| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 亚洲久久久久久中文字幕| 日韩欧美 国产精品| 最近中文字幕高清免费大全6 | 伦理电影大哥的女人| 欧美一区二区国产精品久久精品| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 91午夜精品亚洲一区二区三区 | 成人高潮视频无遮挡免费网站| 国产精品,欧美在线| 韩国av在线不卡| 日本黄色视频三级网站网址| 一个人免费在线观看电影| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 最新中文字幕久久久久| x7x7x7水蜜桃| 精品一区二区三区人妻视频| 嫩草影院入口| 欧美人与善性xxx| 波多野结衣高清作品| 亚洲男人的天堂狠狠| 嫩草影视91久久| 一本一本综合久久| 亚洲av二区三区四区| 久久久精品欧美日韩精品| 日韩大尺度精品在线看网址| 久久亚洲精品不卡| 97超级碰碰碰精品色视频在线观看| 亚洲国产高清在线一区二区三| 99国产精品一区二区蜜桃av| 成人欧美大片| 国产伦精品一区二区三区视频9| 国产精品一区www在线观看 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 在线播放无遮挡| 长腿黑丝高跟| 精品久久久久久久久久久久久| 男女啪啪激烈高潮av片| 国内精品宾馆在线| h日本视频在线播放| 日本免费a在线| 成人一区二区视频在线观看| 国产精品免费一区二区三区在线| 天堂影院成人在线观看| 香蕉av资源在线| 色尼玛亚洲综合影院| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 在线免费十八禁| 亚洲一区二区三区色噜噜| 男插女下体视频免费在线播放| 国产老妇女一区| 亚洲va在线va天堂va国产| 国产精品亚洲一级av第二区| a在线观看视频网站| 亚洲精品一卡2卡三卡4卡5卡| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 黄色欧美视频在线观看| 久久精品国产清高在天天线| 国产精品久久电影中文字幕| 午夜免费成人在线视频| 国产美女午夜福利| 一区二区三区激情视频| 亚洲精品影视一区二区三区av| 国产免费男女视频| 色综合站精品国产| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 久久久成人免费电影| 中出人妻视频一区二区| 亚洲乱码一区二区免费版| 免费在线观看成人毛片| 久久精品人妻少妇| 国内精品宾馆在线| 全区人妻精品视频| 欧美激情在线99| 久久久久久久久久成人| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 高清在线国产一区| 婷婷色综合大香蕉| 啦啦啦啦在线视频资源| 99国产极品粉嫩在线观看| 亚洲av免费高清在线观看| 欧美三级亚洲精品| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 网址你懂的国产日韩在线| 一区二区三区四区激情视频 | а√天堂www在线а√下载| 韩国av一区二区三区四区| 床上黄色一级片| 日韩一区二区视频免费看| 床上黄色一级片| 啦啦啦韩国在线观看视频| 我的女老师完整版在线观看| 一本精品99久久精品77| 久久中文看片网| 观看免费一级毛片| 亚洲av免费在线观看| 国产在视频线在精品| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 啪啪无遮挡十八禁网站| 精品福利观看| 最近最新免费中文字幕在线| 免费av不卡在线播放| 嫩草影院入口| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 91久久精品国产一区二区成人| 亚洲欧美日韩东京热| 国产一区二区三区在线臀色熟女| 看黄色毛片网站| 丰满乱子伦码专区| 日韩一区二区视频免费看| 99热只有精品国产| 国产精品一区二区免费欧美| 美女黄网站色视频| 久久久久精品国产欧美久久久| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 亚洲av.av天堂| 真实男女啪啪啪动态图| 国产男人的电影天堂91| 窝窝影院91人妻| 有码 亚洲区| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 欧美一区二区亚洲| 国产在线精品亚洲第一网站| 国产伦精品一区二区三区视频9| 亚洲男人的天堂狠狠| 一进一出好大好爽视频| 国产成人a区在线观看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看 | 国产免费一级a男人的天堂| 国产真实乱freesex| 老熟妇仑乱视频hdxx| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 神马国产精品三级电影在线观看| 久久久久性生活片| 午夜影院日韩av| 91精品国产九色| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 欧美国产日韩亚洲一区| 久久久成人免费电影| 亚洲在线观看片| 亚洲精品粉嫩美女一区| 日韩欧美在线乱码| 免费观看人在逋| 婷婷亚洲欧美| 一区二区三区免费毛片| 亚洲国产高清在线一区二区三| 国产淫片久久久久久久久| 午夜福利在线在线| 亚洲精品456在线播放app | 男人狂女人下面高潮的视频| 亚洲自拍偷在线| 亚洲美女搞黄在线观看 | 五月玫瑰六月丁香| 午夜视频国产福利| 日韩欧美免费精品| 国产白丝娇喘喷水9色精品| 久久久久九九精品影院| 国产精品综合久久久久久久免费| 在线看三级毛片| 日韩中字成人| 天堂影院成人在线观看| 天堂动漫精品| 亚洲成av人片在线播放无| 观看美女的网站| av福利片在线观看| 国产欧美日韩一区二区精品| 男人舔奶头视频| 91麻豆av在线| 国产私拍福利视频在线观看| 九色国产91popny在线| 麻豆国产97在线/欧美| av在线亚洲专区|