HPLC對(duì)檳榔鹵水原料飴糖中葡萄糖和麥芽糖的測(cè)定

陳升，劉朝來 ，龔卓，羅秋鵬，尹興筍，周春

1.湖南伍子醉實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司（湘潭 411228）；2.常德市自來水有限責(zé)任公司（常德 415001）

飴糖，性溫、味甘，為藥食同源之品，應(yīng)用較廣泛，具有非常重要的研究價(jià)值[1]。在我國早期飴糖的生產(chǎn)主要是人們利用發(fā)了芽的小麥、大麥或其他谷物，經(jīng)發(fā)酵、蒸煮、熬制而成[2]，現(xiàn)在工藝主要是用酶法生產(chǎn)飴糖[3]。飴糖有補(bǔ)中緩急的功效，可以緩解腹中冷痛、食少嘔吐的癥狀。飴糖和石灰粉是食用檳榔鹵水[4]體系中最重要的組成部分，能直接賦予食用檳榔鹵水最基礎(chǔ)的組織結(jié)構(gòu)及特殊口感[5]。其在食用檳榔鹵水中的主要起到調(diào)味和中和石灰降低其堿性，減少燒口現(xiàn)象使其適口性變好，能保護(hù)咀嚼者口腔黏膜，其中與石灰發(fā)生反應(yīng)的主要為還原糖，而飴糖中的還原糖基本是葡萄糖和麥芽糖，因此控制好葡萄糖和麥芽糖的比例能對(duì)檳榔鹵水改良技術(shù)提供支持[6]。

國內(nèi)檢測(cè)葡萄糖和麥芽糖的方法有多種，主要分三大類，分別是光譜法、色譜法和滴定法。其中，光譜法和滴定法都是將還原糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖作為最終產(chǎn)物來測(cè)定含量的，過去常采用的色譜法是氣相色譜法和薄層色譜法，氣相色譜法中由于糖本身沒有足夠的揮發(fā)性，需將其轉(zhuǎn)化為揮發(fā)性衍生物進(jìn)行分析，制備過程操作繁瑣，耗時(shí)長，易產(chǎn)生多種衍生物的異構(gòu)體[7]。薄層色譜法的優(yōu)點(diǎn)是操作快捷有效、無需衍生化處理，但多種單糖的分離效果差，微量成分顯色不明顯而且重現(xiàn)性不好，適合簡單樣品的定性分析而不能滿足復(fù)雜的樣品的定性定量。而液相色譜法則可直接對(duì)葡萄糖和麥芽糖進(jìn)行定性定量分析[8-9]。其中，GB 5009.8—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測(cè)定》[10]和GB/T 20883—2017《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品理化檢測(cè)》[11]都對(duì)糖類含量分析提供液相色譜分析的方法。

試驗(yàn)采用液相色譜儀法對(duì)同時(shí)測(cè)定飴糖樣品中葡萄糖和麥芽糖進(jìn)行研究，改進(jìn)色譜分離條件，以提高檢測(cè)靈敏度并延長色譜柱的使用壽命。

1 材料與方法

1.1 主要儀器、試劑與材料

Agilent 1260高效液相色譜儀（配示差折光檢測(cè)器，美國Agilent公司）；ME-204分析天平、MS105DU半微量天平（梅特勒儀器有限公司）；超純水機(jī)（湖南中沃水務(wù)環(huán)?？梢杂邢薰荆?；16D033超聲波清洗機(jī)（寧波新芝科技有限公司）。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度≥99.9%，北京壇墨質(zhì)檢有限公司）；麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（純度≥94.5%，德國Dr.Ehrenstorfer公司）；乙腈（色譜純，TEDIA）；氨水（色譜純，上海安譜科技有限公司）；超純水為實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 色譜條件

色譜柱Waters XBridge-Amide（3.5 μm×4.6 mm×150 mm）；流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為0.1%氨水（體積比），流動(dòng)相A與B按75∶25（V/V）預(yù)混合（約pH 9.5）后經(jīng)0.45 μm有機(jī)系濾膜過濾。流速0.5 mL/min；柱溫60 ℃；檢測(cè)器溫度40 ℃；進(jìn)樣量5 μL；檢測(cè)器RID（示差折光檢測(cè)器）。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

用半微量天平精確稱取0.200 20 g葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，溶解后定容至100 mL容量瓶中，配制成2.00 mg/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中；用半微量天平精確稱取0.211 64 g麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，溶解后定容至50 mL容量瓶中，配制成4.00 mg/L的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中。

將葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用超純水逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為2.00，1.50，1.00，0.50和0.25 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液；將麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用超純水逐級(jí)稀釋成質(zhì)量濃度為4.00，3.00，2.00，1.00和0.50 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.4 樣品的處理方法

準(zhǔn)確稱取0.5 g（精確至0.000 1 g）飴糖，溶解后定容至100 mL容量瓶中，混勻，取2 mL經(jīng)0.45 μm水系濾膜過濾后上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

試驗(yàn)初期分離柱選擇的是Hypersil NH2糖分析柱[12]，以乙腈-水75∶25（V/V）作為流動(dòng)相。雖然也能得到較好的分離度和線性關(guān)系，但由于飴糖呈弱酸性，酸性物質(zhì)的存在意味著質(zhì)子的存在，會(huì)使略帶負(fù)電荷的氨基官能團(tuán)質(zhì)子化，因此導(dǎo)致致使用一段時(shí)間后柱效下降較快，使用壽命短。

在選擇Waters XBridge-Amide（3.5 μm×4.6 mm×150 mm）分離柱后此現(xiàn)象有所改觀，但沒過段時(shí)間仍需對(duì)分離柱進(jìn)行清洗或再生，對(duì)流動(dòng)相的pH進(jìn)行調(diào)節(jié)，將流動(dòng)相改為乙腈-0.1%氨水75∶25（V/V）后此現(xiàn)象大為改觀。分離柱的使用壽命也大幅延長。

2.2 線性范圍

按2.1中色譜條件設(shè)置高效液相色譜儀參數(shù)，注入葡萄糖和麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)使用液，分別測(cè)定其峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)使用液質(zhì)量濃度X（mg/L）為橫坐標(biāo)、相應(yīng)峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性擬合，得：葡萄糖線性回歸方程Y=88 327.9X+484.8，r=0.999 8；麥芽糖線性回歸方程Y=87 719.3X-362.2，r=0.999 8。結(jié)果表明，葡萄糖在0.25～2.00 mg/mL、麥芽糖在0.5～4.00 mg/mL的范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。飴糖葡萄糖、麥芽糖色譜分析圖見圖1，葡萄糖校正曲線圖見圖2，麥芽糖校正曲線圖見圖3。

圖1 飴糖葡萄糖、麥芽糖色譜分析圖

圖2 葡萄糖校正曲線圖

圖3 麥芽糖校正曲線圖

2.3 精密度與檢出限

按2.1中色譜條件設(shè)置高效液相色譜儀參數(shù)，將質(zhì)量濃度0.25 mg/L和2.00 mg/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)使用液和1個(gè)飴糖樣品連續(xù)進(jìn)樣6針，測(cè)得葡萄糖低、中、高三水平的SRSD，見表1。

表1 葡萄糖三水平的SRSD結(jié)果

將質(zhì)量濃度0.50 mg/L和4.00 mg/L的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)使用液和1個(gè)飴糖樣品連續(xù)進(jìn)樣6針測(cè)得麥芽糖低、中、高三水平的RSD見表2。

表2 麥芽糖三水平的SRSD結(jié)果

由表1、表2可知，葡萄糖和麥芽糖的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為葡萄糖0.55%和0.40%，結(jié)果符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》（GB/T 27404—2008）[11]附錄F中實(shí)驗(yàn)室內(nèi)變異系數(shù)≤2.0%，表明方法精密度良好。參考《合格評(píng)定 化學(xué)分析方法確認(rèn)和驗(yàn)證指南》[13]，考慮到分析物中的目標(biāo)物含量遠(yuǎn)超過檢出限（LOQ），因此并未對(duì)該方法的檢出限和定量限做過多的考慮，僅以低水平的3倍SD計(jì)算該方法檢出限，得該方法葡萄糖的檢出限為0.04 mg/mL；麥芽糖檢出限為0.015 mg/mL，已能滿足日常檢測(cè)需求。

2.4 回收率

參考GB/T 27404—2008《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》附錄F中的方法對(duì)飴糖進(jìn)行加標(biāo)回收率的測(cè)定，準(zhǔn)確稱取15份同一個(gè)飴糖樣品，每份0.500 0 g，分別對(duì)其1～15號(hào)進(jìn)行編號(hào)，1～3號(hào)樣品用超純水溶解并定容至100 mL，根據(jù)葡萄糖和麥芽糖的檢出限對(duì)第1組4～6號(hào)樣品加標(biāo)為：樣品用超純水溶解后分別加入2 mL的2.00 mg/mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和1 mL的4.00 mg/mL麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液并用超純水定容至100 mL。第2組7～9號(hào)樣品的加標(biāo)為：樣品用超純水溶解后分別加入25 mL的2.00 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液和25 mL的4.00 mg/mL的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液并用超純水定容至100 mL。第3組10～12號(hào)樣品的加標(biāo)為：樣品用超純水溶解后加入50 mL的2.00 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液并用超純水定容至100 mL。第4組13～15號(hào)樣品的加標(biāo)為：樣品用超純水溶解后加入50 mL的4.00 mg/mL的麥芽糖標(biāo)準(zhǔn)溶液并用超純水定容至100 mL的方法進(jìn)行回收率測(cè)定試驗(yàn)，計(jì)算回收率及SRSD值，具體結(jié)果見表3～表5。

表3 飴糖樣品的葡萄糖和麥芽糖含量結(jié)果（n=3）

由表3可知，作為底物的飴糖中葡萄糖含量和麥芽糖含量分別為17.2%和39.2%。由表4可知，在方法檢出限水平、常規(guī)樣品水平和方法曲線最高限度這三水平葡萄糖的加標(biāo)回收率分別為99.4%，100.0%和100.2%，SRSD為0.40%。由表5可知，在方法檢出限水平、常規(guī)樣品水平和方法曲線最高限度這三水平麥芽糖的加標(biāo)回收率分別為97.8%，98.3%和99.5%，SRSD為0.90%。所有加標(biāo)結(jié)果回收率均在95%～105%之間，符合GB/T 27404—2008所要求的加標(biāo)回收率的范圍，因此說明該方法的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性均為優(yōu)秀。

表4 葡萄糖三水平回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

表5 麥芽糖三水平回收率試驗(yàn)結(jié)果（n=3）

2.5 樣品分析

在鹵水房隨機(jī)抽取6桶飴糖，每桶取6個(gè)樣品，將其按1.4的樣品處理方法處理后注入高效液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表6。

表6 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n=6）單位：%

3 結(jié)論

建立高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定檳榔鹵水一種重要原料——飴糖中葡萄糖和麥芽糖含量的方法，該法簡便快捷，靈敏度高，重現(xiàn)性好，檢出限低適用于食用檳榔鹵水的原料——飴糖中的葡萄糖和麥芽糖含量的測(cè)定，既可為廣大檳榔生產(chǎn)企業(yè)提供原料進(jìn)廠檢驗(yàn)的依據(jù)，也可作為控制鹵水反應(yīng)程度的指標(biāo)，該方法對(duì)食用檳榔鹵水的改良提供技術(shù)支持。