熱處理對(duì)杏仁分離蛋白結(jié)構(gòu)及熱穩(wěn)定性的影響

王彥惠，吳清濁，孫瑜彤，劉星雨，陳振家

山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（太谷 030800）

杏仁屬薔薇科植物[1]，可藥食兩用，富含44%～61%的脂肪、16%～26%的蛋白質(zhì)、較低含量的碳水化合物[2]及多種礦物元素和維生素[3]，具有豐富的營養(yǎng)價(jià)值和藥用作用[1-4]。杏仁蛋白富含人體必需的8種氨基酸[5]，與總氨基酸的比值（EA/TAA）接近于國際參考模式（FAO/WHO）[4-6]，是良好的食用蛋白資源。近年來，隨著現(xiàn)代社會(huì)對(duì)健康飲食需求的增加，消費(fèi)者對(duì)以“健康、天然、營養(yǎng)”為品類特征的植物蛋白飲品表現(xiàn)出極大興趣。杏仁中含有18%～24%的水溶性蛋白，在植物蛋白飲品方面具有較大的發(fā)展空間。

杏仁乳經(jīng)過熱處理后，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生變化，進(jìn)而影響到其熱穩(wěn)定性和消化性。Devnani等[7]研究熱處理（45～90 ℃，30 min）對(duì)杏仁奶蛋白結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果表明，55～75 ℃的中等溫度處理會(huì)導(dǎo)致杏仁蛋白發(fā)生變性和部分聚集，85～95 ℃的較高溫度則會(huì)引起更廣泛的變性和凝膠化，并形成自支撐的弱絮狀顆粒凝膠結(jié)構(gòu)。繼續(xù)研究pH和加熱程度對(duì)杏仁蛋白結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的影響[8]，結(jié)果表明在不同pH條件下，加熱處理會(huì)使得杏仁蛋白產(chǎn)生不同的微觀結(jié)構(gòu)凝膠強(qiáng)度。

國內(nèi)關(guān)于熱處理對(duì)API結(jié)構(gòu)和特性的影響研究鮮有報(bào)道。試驗(yàn)分析不同熱處理對(duì)API結(jié)構(gòu)變化和聚集特性規(guī)律的影響，以確保高品質(zhì)杏仁乳的生產(chǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

杏仁（市售）。

1.2 試劑

電泳試劑（AMRESCO分裝）；考馬斯亮藍(lán)G-250、牛血清蛋白（上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司）；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（上海生物化學(xué)研究所）。

1.3 主要儀器與設(shè)備

T18-basic高速剪切儀（德國艾卡設(shè)備有限公司）；FD-1冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康技術(shù)公司）；YS-04A小型高速粉碎機(jī)（北京燕山正德機(jī)械設(shè)備有限公司）；UV-1200紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司）；RF5301PC熒光分光光度計(jì)（日本島津公司）；Cary 60紫外可見分光光度計(jì)（美國安捷倫科技公司）；ZS90納米激光粒度儀（英國馬爾文帕納科公司）。

1.4 方法

1.4.1 API制備

將新鮮杏仁高速粉碎5 min，料液比1︰5（g/mL）加入石油醚，室溫下攪拌4 h，待石油醚揮發(fā)干凈后得脫脂杏仁粉。采用堿提酸沉法制備API，在50 ℃恒溫水浴下調(diào)節(jié)pH 9.0溶出分離蛋白，取上清液，調(diào)節(jié)pH 4.5使杏仁蛋白沉淀，中和溶液pH后經(jīng)真空冷凍干燥得到API[9]。參考GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》對(duì)API進(jìn)行測定，杏仁蛋白質(zhì)含量=總氮含量×5.18，經(jīng)檢驗(yàn)，制備的API含量為57.766 9%，符合國標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)[10-11]。

1.4.2 API熱處理

配制3%的API溶液，室溫下攪拌1 h后離心（4 000 r/min、15 min），取上清液完成后續(xù)試驗(yàn)。未經(jīng)熱處理的作為對(duì)照組，試驗(yàn)組分別放于水浴鍋（65 ℃、30 min，90 ℃、15 min）和油浴鍋（121 ℃、3 min）進(jìn)行熱處理，將熱處理后的樣品進(jìn)行離心操作（10 000 r/min、15 min）并進(jìn)行理化指標(biāo)的測定。

1.4.3 API溶解度測定

參照Bradford法[12]測定上清液蛋白溶解度。

1.4.4 聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝膠電泳的測定

參考Laemmli[13]的SDS-PAGE法對(duì)API進(jìn)行分析。取上述不同處理蛋白樣品中的上清液和底部沉淀制備電泳樣品，上清液和沉淀的添加量不超過1 mg/mL（m蛋白︰m電泳液）。制得的濃縮膠濃度5%、分離膠濃度12%、樣品上樣量6 μL。電泳前設(shè)置恒壓進(jìn)行電泳[14-15]。電泳結(jié)束后，電泳膠片先固定3 h后用考馬斯亮藍(lán)G-250染色2.5 h，過夜脫色后掃描成像，此為非還原SDS-PAGE。還原SDS-PAGE需添加2%β-巰基乙醇做還原處理進(jìn)行對(duì)比[16]。

1.4.5 游離巰基和總巰基測定

游離巰基的測定：定量API加入反應(yīng)緩沖液A（0.1 mol/L pH 8.0磷酸鈉緩沖液，含1 mmol/L EDTA），室溫下攪拌2 h，10 000×g離心10 min，取5.5 mL上清液加入0.1 mL Ellman’s試劑溶液，混合均勻后室溫避光放置15 min，在波長412 nm下測量吸光度；空白加5.5 mL反應(yīng)緩沖液A；根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線換算表面巰基含量?？値€基測定與游離巰基的測定類似，只需將反應(yīng)緩沖液換為緩沖液B（0.1 mol/L、pH 8.0磷酸鈉緩沖液，含1 mmol/L EDTA，8 mol/L尿素），其他步驟同游離巰基的測定[17]。

1.4.6 熒光光譜分析

對(duì)熱處理后的API上清液進(jìn)行測定。設(shè)置熒光光譜激發(fā)波長295 nm，發(fā)射光譜掃描范圍為300～400 nm，激發(fā)狹縫和發(fā)射狹縫寬均為3 nm[18]。

1.4.7 紅外光譜分析

參考Qi等[19]的方法，對(duì)熱處理離心后的白色沉淀凍干物進(jìn)行紅外測定。取5 mg凍干樣品與500 mg溴化鉀混合研磨（1︰100），壓片機(jī)壓成薄片。設(shè)置紅外光譜儀的分辨率4 cm-1，波數(shù)范圍400～4 000 cm-1，掃描次數(shù)32次。采用Peakfit 4.12（Systat Software，Inc.，San Jose，USA）軟件對(duì)酰胺Ⅰ區(qū)進(jìn)行擬合分析，用高斯解卷積方法對(duì)峰進(jìn)行處理并進(jìn)行2階導(dǎo)數(shù)擬合。

1.4.8 粒徑、電位測定

用Zetasizer Nano ZS90 instrument對(duì)熱處理離心后的API上清液進(jìn)行測定[20]。測定前用0.45 μm水系微孔濾膜過濾。

1.4.9 紫外分析

在近紫外光區(qū)對(duì)熱處理離心后的API上清液進(jìn)行掃描測試，掃描速度210 nm/min，對(duì)吸收曲線求2階倒數(shù)，得到相應(yīng)導(dǎo)數(shù)光譜[21]。

1.4.10 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均設(shè)3次重復(fù)，數(shù)據(jù)進(jìn)行均值與方差分析并以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。通過單因素方差分析對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。所使用的分析軟件為SPSS 18.0，作圖軟件為Origin 8.0。

2 結(jié)果與分析

2.1 杏仁分離蛋白溶解度

圖1是不同熱處理?xiàng)l件下的API溶解度的變化情況。65 ℃、30 min處理的杏仁蛋白溶解度顯著上升，而121 ℃、6 min處理的蛋白溶解度顯著下降（P＜0.05），這是因?yàn)榧訜釡囟瘸^變性溫度，蛋白發(fā)生變性聚集[22]，同時(shí)蛋白亞基在熱作用下發(fā)生解離并選擇性進(jìn)行疏水締合，導(dǎo)致蛋白聚集沉淀，從而導(dǎo)致溶解度下降[17,23]。

圖1 不同熱處理?xiàng)l件下API溶解度

2.2 SDS-PAGE凝膠電泳分析

由圖2和圖3可知，熱處理API上清液和沉淀的非還原和還原電泳圖譜有明顯差異，這說明API亞基結(jié)構(gòu)中存在分子間二硫鍵，還原劑β-巰基乙醇的加入致使二硫鍵被打斷進(jìn)而造成亞基分布的差異。由圖2（a）可知，90 ℃、15 min和121 ℃、3 min處理使得亞基間同時(shí)發(fā)生解離和締合，其中65.3，62.8和36.6 kDa條帶顏色變淺，部分消失并形成數(shù)條新的電泳條帶（97.4，41.2和66.2 kDa）。這說明部分亞基間二硫鍵斷裂的同時(shí)又形成新的分子間二硫鍵。由圖2（b）可知，還原電泳條帶基本相似，這說明熱處理雖然改變亞基間二硫鍵的形成方式和模式，但并未改變亞基組成也未造成亞基間的共價(jià)結(jié)合。圖3（a）則表明雖然熱處理同樣改變聚集并發(fā)生沉淀的杏仁蛋白亞基間的二硫鍵作用，但其影響程度小于可溶蛋白，這說明蛋白的聚集沉淀減弱了熱處理效應(yīng)。對(duì)比圖2（b）和圖3（b）可知，熱處理造成API沉淀的亞基組成相似，但亞基比例含量有較大差異且溫度呈正相關(guān)。其中，38.9 kDa和41.2 kDa這2個(gè)條帶在上清液中較寬且顏色很深，而在圖3（b）中變細(xì)，且隨溫度升高逐漸變淺。62.8 kDa和65.3 kDa這2個(gè)條帶在121 ℃、3 min時(shí)甚至全部消失。這說明API亞基受熱處理的影響不同，相比22 kDa亞基，38.9，41.2，62.8和65.3 kDa在熱處理過程中更易發(fā)生聚集沉淀。同時(shí)隨溫度上升，所造成亞基參與數(shù)量越多且聚集程度越高。

某公路在2002年開始通車，運(yùn)營了16年，現(xiàn)階段，已經(jīng)完全進(jìn)入到大修時(shí)期，在這16年期間，該公路總共經(jīng)歷數(shù)次保小修與中修，路面狀況比較差，使得養(yǎng)護(hù)維修難度不斷增強(qiáng)，再加上該公路路面寬度大，養(yǎng)護(hù)過程之中，需要耗費(fèi)許多人力與物力。為了保證該公路大中修工程養(yǎng)護(hù)效率得到全面提升，養(yǎng)護(hù)單位需要仔細(xì)分析公路路面基礎(chǔ)信息數(shù)據(jù)，并且結(jié)合公路施工技術(shù)指標(biāo)，包括公路路面結(jié)構(gòu)特性與以往的養(yǎng)護(hù)情況等，對(duì)需要養(yǎng)護(hù)的路段進(jìn)行全面勘察，結(jié)合公路大中修養(yǎng)護(hù)管理單位提供的意見，了解公路養(yǎng)護(hù)需求，組織專業(yè)的養(yǎng)護(hù)人員實(shí)施養(yǎng)護(hù)。

圖2 不同熱處理?xiàng)l件下上清液API非還原（N）和還原（R）SDS-PAGE

圖3 不同熱處理?xiàng)l件下沉淀API非還原（N）和還原（R）SDS-PAGE

2.3 總巰基和游離巰基測定

總巰基包括游離巰基和埋藏在蛋白質(zhì)內(nèi)部的巰基[24]，巰基是形成二硫鍵的官能團(tuán)，而二硫鍵是維持蛋白質(zhì)分子三級(jí)結(jié)構(gòu)的重要作用力[25]。由圖4可知，65 ℃、30 min處理下API游離巰基含量最高，且隨著熱處理組別溫度的升高，API游離巰基含量顯著下降（P＜0.05）。這可能是因?yàn)榈蜏丶訜釋?dǎo)致原本存在的二硫鍵斷裂或嵌入分子中的巰基被釋放，蛋白質(zhì)分子發(fā)生重鏈解折疊[26-27]?？値€基在65 ℃、30 min處理下含量最低。游離巰基與總巰基的比值能夠反映蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的解折疊程度，比值越大，蛋白的解折疊程度越強(qiáng)[28-29]。圖4表明65 ℃、30 min處理下，API三級(jí)結(jié)構(gòu)的解折疊程度最大，分子舒展。隨著溫度的升高，總巰基含量明顯增加，維系蛋白質(zhì)亞基間的二硫鍵斷裂，這本應(yīng)同時(shí)增加游離巰基的數(shù)量，但變性后的蛋白亞基在疏水作用的推動(dòng)下發(fā)生大量聚集，使得已暴露的游離巰基重新被包埋，API的解折疊程度降低。熱處理導(dǎo)致二硫鍵形成的游離巰基大多會(huì)形成新的二硫鍵以推動(dòng)聚集體的形成[17]。

圖4 不同熱處理?xiàng)l件下API總巰基和游離巰基的含量和比例

2.4 內(nèi)源性熒光光譜分析

內(nèi)源性熒光光譜主要用于檢測蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)變化[30]。由圖5可知，隨著熱處理溫度的升高，API內(nèi)源性最大熒光峰位從波長347 nm紅移到波長353 nm，這說明65 ℃、15 min和90 ℃、3 min的熱處理導(dǎo)致杏仁蛋白質(zhì)分子在溶液中的暴露程度增加，芳香殘基從蛋白質(zhì)內(nèi)部的疏水環(huán)境轉(zhuǎn)移到分子表面極性較強(qiáng)的環(huán)境中[17,31]。121 ℃、3 min時(shí)最大熒光峰位藍(lán)移，說明API中色氨酸殘基微環(huán)境非極性增強(qiáng)[32-33]，這可能與高溫?zé)崽幚碚T導(dǎo)色氨酸殘基通過疏水側(cè)鏈的蛋白質(zhì)聚集有關(guān)[34]。

圖5 不同熱處理?xiàng)l件下API的內(nèi)源熒光發(fā)射圖譜

2.5 紅外光譜分析

酰胺Ⅰ區(qū)常被用于分析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化。參考Long等[35]的研究方法對(duì)酰胺Ⅰ帶進(jìn)行各峰歸屬，1 600～1 625 cm-1為分子間β-折疊，1 626～1 640 cm-1為分子內(nèi)β-折疊，1 641～1 650 cm-1為無規(guī)則卷曲，1 651～1 660 cm-1為α-螺旋，1 661～1 685 cm-1為β-轉(zhuǎn)角，1 686～1 700 cm-1為反向平行β-折疊[36-37]。

由圖6可知，不同熱處理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)的吸收光不同，有波數(shù)的變化也有波峰的偏移，說明API的二級(jí)結(jié)構(gòu)確實(shí)發(fā)生相應(yīng)的變化。從圖7可知，PI的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為β-折疊和β-轉(zhuǎn)角。65 ℃、30 min，90 ℃、15 min和121 ℃、3 min的熱處理導(dǎo)致API出現(xiàn)無規(guī)則卷曲，這表明熱處理?xiàng)l件下API的二級(jí)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性下降，β-折疊等結(jié)構(gòu)被破壞[38]，蛋白質(zhì)從有序結(jié)構(gòu)向無序轉(zhuǎn)變[39]。且β-折疊結(jié)構(gòu)變化較為復(fù)雜，包括分子內(nèi)、分子間和方向平行等多種形式。結(jié)合圖7可知，對(duì)照組中的β-折疊主要以反向平行β-折疊為主。隨著處理組別溫度的升高，反向平行β-折疊顯著減少并轉(zhuǎn)化為分子間和分子內(nèi)的平行β-折疊?？傊?，熱處理使得維持APIβ-折疊結(jié)構(gòu)中氫鍵斷裂，由相對(duì)有序的β-折疊結(jié)構(gòu)逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)闊o序的β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)，API變性。

圖6 不同熱處理后API的酰胺I帶曲線擬合圖譜

圖7 不同熱處理后API二級(jí)結(jié)構(gòu)的含量變化

2.6 Zeta電位分析

Zeta電位的絕對(duì)值大小直接關(guān)系靜電排斥相互作用的強(qiáng)弱及溶液中顆粒之間的空間大小[40]。Zeta電位的絕對(duì)值越高，溶液體系越均勻穩(wěn)定[41-42]。絕對(duì)值越低則表明懸浮顆粒易于凝結(jié)或絮凝[43]。由圖8可知，熱處理?xiàng)l件為90 ℃、30 min和121 ℃、3 min時(shí)，Zeta電位絕對(duì)值小于30 mV，蛋白表面所帶的同性電荷較少，分子間存在聚集沉淀趨勢[44]，這可能是因?yàn)闊崽幚硎沟鞍踪|(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生去折疊，原本暴露在表面的帶電氨基酸隨蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變而發(fā)生內(nèi)折，表面靜電荷密度減小[45]。

圖8 不同熱處理?xiàng)l件下API電位的變化

2.7 粒徑分析

乳液的穩(wěn)定性在很大程度上受平均粒徑的影響，通常情況下，乳液粒徑越小越穩(wěn)定[46]。API粒徑的變化主要是由熱處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子內(nèi)的交聯(lián)和聚集引起的[47-48]。由圖9可知，對(duì)照組和65 ℃、30 min處理的API只出現(xiàn)有一個(gè)波峰，位于100～1 000 nm之間，平均粒徑分別為198.3 nm和183.6 nm。而90 ℃、15 min和121 ℃、3 min處理下API表現(xiàn)出多峰結(jié)構(gòu)且分布范圍變寬，這表明升溫處理導(dǎo)致蛋白質(zhì)解離破碎成更小的聚集體，且當(dāng)熱處理?xiàng)l件為121 ℃、3 min時(shí)，API的平均粒徑顯著增大至393.0 nm（P＜0.05），這是因?yàn)樾滦纬傻木奂w在熱力學(xué)上并不穩(wěn)定，表面基團(tuán)在疏水推動(dòng)力和高溫作用下重聚的可能性增加[24]。

圖9 不同熱處理?xiàng)l件下API粒徑分布和平均粒徑圖

2.8 紫外吸收光譜分析

紫外吸收光譜可以反映蛋白質(zhì)近紫外區(qū)域的三級(jí)結(jié)構(gòu)和聚集狀態(tài)，用于研究蛋白質(zhì)構(gòu)象變化[49]。與25℃對(duì)照組相比，65 ℃、30 min和90 ℃、15 min下的表征色氨酸和酪氨酸殘基的紫外吸收峰均發(fā)生紅移，這表明疏水區(qū)域的芳香族氨基酸發(fā)生不同程度的暴露，部分酪氨酸殘基轉(zhuǎn)移到極性微環(huán)境中[50]。由圖10可知，121 ℃、3 min時(shí)紫外吸光度基本消失，這可能是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)高度折疊變性，生色基團(tuán)被完全包裹或熱處理導(dǎo)致生色氨基酸基團(tuán)發(fā)生氧化。

圖10 不同熱處理?xiàng)l件下杏仁蛋白的紫外2階導(dǎo)數(shù)光譜

3 結(jié)論

熱處理對(duì)杏仁蛋白的結(jié)構(gòu)及熱穩(wěn)定性有較大影響。121 ℃、3 min的超高溫?zé)崽幚頃?huì)導(dǎo)致杏仁分離蛋白發(fā)生不可逆變性，β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲含量增加，粒徑變大，溶解度降低。而65 ℃、15 min模擬巴氏加熱的熱處理方式可通過使杏仁分離蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生一定程度解折疊，從而提高其熱穩(wěn)定性。雖然不同熱處理方式改變亞基間二硫鍵的形成方式和模式，但實(shí)際上并未改變亞基組成也未造成亞基間的共價(jià)結(jié)合。試驗(yàn)結(jié)果為實(shí)踐中生產(chǎn)杏仁蛋白乳制品提供理論基礎(chǔ)。