沙棘果渣黃酮微波提取工藝優(yōu)化及其純化研究

楊歡歡，趙明慧，虎濤，管元康，劉婧琳,，孫靜濤,,

1.石河子大學(xué)食品學(xué)院（石河子 832000）；2.新疆植物藥資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（石河子 832003）；3.食品營(yíng)養(yǎng)與安全控制兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（石河子 832000）；4.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部特色農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（石河子 832000）

沙棘是胡頹子科沙屬藥食同源植物，我國(guó)是天然沙棘資源最豐富、種植面積最大的國(guó)家之一[1]。由于新疆有著得天獨(dú)厚的地理環(huán)境及區(qū)域氣候優(yōu)勢(shì)，這賦予沙棘較高的品質(zhì)及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[2]。新疆沙棘含有豐富的維生素C、亞油酸、蛋白質(zhì)和黃酮類化合物等生物活性物質(zhì)[3]，同時(shí)黃酮類化合物還具有抗衰老、降血脂、抗氧化和增強(qiáng)人體免疫力等保健作用[4]。

黃酮類物質(zhì)的提取方法有溶劑回流法[5]、超聲輔助提取[6]、微波輔助提取[7]和超臨界二氧化碳提取等方法[8]。微波是頻率為300 MHz～300 GHz的電磁波，微波輔助提取是利用樣品中極性分子在高頻變換的電磁波輻射作用下發(fā)生快速振動(dòng)，是在樣品內(nèi)部產(chǎn)生大量摩擦熱下進(jìn)行提取的，具有高效、快速、操作簡(jiǎn)單和提取效率高等特點(diǎn)[9]。刁丹等[10]利用微波輔助提取法研究了微波功率、微波時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)變?nèi)~榕根中黃酮提取量的影響。結(jié)果表明，微波功率500 W、微波時(shí)間20 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)，其總黃酮提取率最高可達(dá)1.77%。李樂(lè)等[11]利用微波輔助提取法研究微波功率、溫度、液料比和乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)關(guān)山櫻花總黃酮提取率的影響。結(jié)果表明，微波功率400 W、液料比40︰1 mL/g、溫度75 ℃和乙醇體積分?jǐn)?shù)50%時(shí)，總黃酮提取率可達(dá)16.08%。

通常在提取黃酮類物質(zhì)的過(guò)程中，不可避免地會(huì)有多糖、蛋白等非黃酮物質(zhì)溶出，因此需進(jìn)一步純化提取出的黃酮來(lái)提高穩(wěn)定性以及功能性。常用黃酮類物質(zhì)純化方法有大孔樹脂吸附法、硅膠柱色譜法和膜分離法等[12-13]。周孟焦等[14]利用聚酰胺-大孔吸附樹脂純化竹葉花椒總黃酮，結(jié)果表明，上樣濃度6 mg/mL、上樣流速1.5 mL/min、洗脫劑流速2 mL/min時(shí)，其純化后的總黃酮含量達(dá)87.35%。姚林娜等[15]采用AB-8大孔樹脂對(duì)竹葉黃酮提取物進(jìn)行了純化，結(jié)果表明：上樣濃度1.2 mg/mL、上樣體積60 mL、洗脫劑體積分?jǐn)?shù)70%、洗脫體積60 mL時(shí)，竹葉黃酮純度由28.39%提高至77.42%。試驗(yàn)以沙棘果渣為原料，采用微波輔助法提取沙棘果渣中的黃酮，并使用大孔樹脂對(duì)沙棘果渣粗黃酮進(jìn)行純化，以提高沙棘副產(chǎn)物利用率，為更充分地開發(fā)利用沙棘資源提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新疆清河沙棘（購(gòu)于石河子農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)）；蘆?。?biāo)準(zhǔn)品，上海源葉生物科技有限公司）；無(wú)水乙醇（分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；亞硝酸鈉、硝酸鋁（分析純，深圳市鋮遠(yuǎn)科技有限公司）；氫氧化鈉（分析純，天津市森源化學(xué)試劑有限公司）；稀鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液（深圳市鋮遠(yuǎn)科技有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

JP-1000B-2高速多功能粉碎機(jī)（永康市永久工貿(mào)有限公司）；BS224S分析天平（美國(guó)Mettler Toledo公司）；LC-FD-03H冷凍干燥機(jī)（上海力辰儀器科技有限公司）；PM20M3美的微波爐（美的廚房電器制造有限公司）；SN-HWS-11恒溫水浴鍋（杭州艾普儀器設(shè)備有限公司）；ZG18MM高速離心機(jī)（上海卓光儀器科技有限公司）；VM-300S多功能旋渦混合儀（群安儀器有限公司）；1.5×20 cm層析柱（北京化玻站）；SHZ-B恒溫振蕩器（上海博遠(yuǎn)醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；W2690/5高效液相色譜儀（美國(guó)）；W2489紫外檢測(cè)器（美國(guó)）；BT100-3J實(shí)驗(yàn)室蠕動(dòng)泵（蘭格恒流泵有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

沙棘→清洗→打漿→過(guò)濾→果渣→凍干→粉碎→微波提取→純化→濃縮→凍干→沙棘黃酮

1.3.2 黃酮的測(cè)定

稱取20 mg蘆丁標(biāo)品，用60%乙醇溶解于100 mL容量瓶，得到0.2 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別吸取1.0，2.0，3.0，4.0，5.0和6.0 mL的標(biāo)準(zhǔn)液于25 mL容量瓶中，加入6 mL 30%乙醇和1 mL 50 g/L的亞硝酸鈉，搖勻，靜置6 min，加入1 mL 100 g/L的硝酸鋁，搖勻，放置6 min，加10 mL 40 g/L氫氧化鈉溶液，加30%乙醇定容。搖勻后靜置15 min在波長(zhǎng)500 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[16]。根據(jù)測(cè)得數(shù)據(jù)計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程y=8.741 1x+0.002 4，R2=0.999 8。稱取1 g預(yù)處理后的果渣，加入提取液，經(jīng)微波提取后冷卻至室溫，按8 000 r/min離心10 min，取1 mL上清液，測(cè)定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線按照式（1）計(jì)算黃酮提取量。

式中：a為測(cè)定液稀釋倍數(shù)；c為測(cè)定液中總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；m為果渣質(zhì)量，g；W為黃酮提取量，mg/g。

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1.3.31 微波功率對(duì)沙棘黃酮提取量的影響

料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、微波時(shí)間2 min時(shí)，考察不同微波功率（150，300，450，600和750 W）對(duì)沙棘果渣中黃酮提取量的影響。

1.3.32 微波時(shí)間對(duì)沙棘黃酮提取量的影響

料液比1∶20（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%、微波功率450 W時(shí)，考察不同微波時(shí)間（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 min）對(duì)沙棘果渣中黃酮提取量的影響。

1.3.33 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)沙棘黃酮提取量的影響

料液比1︰20（g/mL）、微波功率450 W、微波時(shí)間2 min時(shí)，考察不同乙醇體積分?jǐn)?shù)（30%，40%，50%，60%，70%，80%和90%）對(duì)沙棘果渣中黃酮提取量的影響。

1.3.34 料液比對(duì)沙棘黃酮提取量的影響

微波功率450 W、微波時(shí)間2 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)，考察不同料液比（1︰20，1︰25，1︰30，1︰35和1︰40 g/mL）對(duì)沙棘果渣中黃酮提取量的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以沙棘總黃酮提取量為響應(yīng)值，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）、微波時(shí)間（C）3個(gè)因素，進(jìn)行Box-Behnkem響應(yīng)面試驗(yàn)，確定微波輔助提取沙棘果渣中總黃酮的最佳工藝參數(shù)。響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken響應(yīng)面因素與水平設(shè)計(jì)

1.3.5 沙棘果渣黃酮純化研究

1.3.51 樹脂種類的篩選

純化分離植物黃酮的大孔樹脂主要有AB-8、X-5、NKA-9、D101這4種。選擇4種樹脂為研究對(duì)象，以吸附率和解吸率為指標(biāo)，篩選出最佳純化沙棘果渣黃酮的大孔樹脂。

1.3.52 大孔樹脂的動(dòng)態(tài)吸附條件的優(yōu)化

經(jīng)預(yù)處理后的AB-8樹脂在pH 4條件下對(duì)1.137 mg/mL的黃酮溶液進(jìn)行動(dòng)態(tài)吸附，比較不同上樣濃度（1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mg/mL）和上樣流速（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5和3.0 mL/min）對(duì)沙棘黃酮?jiǎng)討B(tài)吸附率的影響。吸附完成后采用80%的乙醇對(duì)AB-8大孔樹脂進(jìn)行洗脫，比較不同洗脫液用量（10，20，30，40，50，60，70，80，90，100，110和120 mL）和洗脫液流速（1，2，3，4和5 mL/min）對(duì)沙棘黃酮?jiǎng)討B(tài)解吸率的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 微波功率對(duì)沙棘果渣中黃酮提取量的影響

由圖1可看出，提取功率150～750 W時(shí)，沙棘果渣中黃酮提取量隨著功率的增大先增高后降低，提取功率600 W時(shí)達(dá)到最大提取量14.37 mg/g?？赡苁怯捎谖⒉üβ侍岣?，提取液升溫快，分子熱運(yùn)動(dòng)加快，提高了沙棘黃酮的溶出速度，微波功率大于600 W時(shí)，使得提取液溫度過(guò)高，導(dǎo)致黃酮類化合物分解，從而黃酮提取量降低。

圖1 微波功率對(duì)沙棘黃酮提取量的影響

2.1.2 微波時(shí)間對(duì)沙棘果渣中黃酮提取量的影響

由圖2可看出，隨著微波時(shí)間的增加，沙棘果渣中黃酮提取量先急劇升高后緩慢降低，微波時(shí)間2.0 min時(shí)達(dá)到最大提取量19.86 mg/g。其原因可能是隨著提取時(shí)間延長(zhǎng)，溶液溫度上升，分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，同時(shí)溶質(zhì)和溶劑的接觸時(shí)間延長(zhǎng)，有利于黃酮提取量升高。但提取時(shí)間繼續(xù)增加，溶劑體系溫度急劇上升，使黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)被破壞，黃酮提取量降低。故選取微波時(shí)間2.0 min為響應(yīng)面試驗(yàn)中間值。

圖2 微波時(shí)間對(duì)沙棘黃酮提取量的影響

2.1.3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)沙棘果渣中黃酮提取量的影響

由圖3可看出，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，沙棘果渣中黃酮提取量先急劇增高，乙醇體積分?jǐn)?shù)為60%達(dá)到最大值19.17 mg/g。乙醇體積分?jǐn)?shù)大于60%時(shí)，黃酮提取量又逐漸下降。其原因可能與黃酮類物質(zhì)的極性有關(guān)，乙醇體積分?jǐn)?shù)超過(guò)60%，其會(huì)破壞植物細(xì)胞壁，加速黃酮類物質(zhì)從細(xì)胞內(nèi)溶出，從而導(dǎo)致總黃酮得率下降。故選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)60%為響應(yīng)面試驗(yàn)中間值。

圖3 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)沙棘黃酮提取含量的影響

2.1.4 料液比對(duì)沙棘果渣中黃酮提取量的影響

由圖4可看出，隨著料液比的減小，沙棘果渣中黃酮提取量急劇增大，料液比1︰25（g/mL）時(shí)達(dá)到最大，提取量為17.81 mg/g。料液比小于1︰25（g/mL）時(shí)，黃酮提取量逐漸下降?？赡苁怯捎诖罅康娜軇┑募尤爰铀冱S酮類物質(zhì)的擴(kuò)散，同時(shí)更多溶劑滲入細(xì)胞內(nèi)部，進(jìn)一步促進(jìn)黃酮類物質(zhì)的溶解，但也會(huì)使其他雜質(zhì)溶出，導(dǎo)致黃酮析出量降低，而且會(huì)造成資源的浪費(fèi)。故選取料液比1︰25（g/mL）為響應(yīng)面試驗(yàn)中間值。

圖4 料液比對(duì)沙棘黃酮提取量的影響

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，選取乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、料液比（B）和微波時(shí)間（C）為變量，以沙棘黃酮提取量為響應(yīng)值，應(yīng)用Box-Behnken進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面分析試驗(yàn)，進(jìn)一步優(yōu)化沙棘果渣黃酮提取工藝。響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型及方差分析結(jié)果

根據(jù)響應(yīng)面試驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)學(xué)要求，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式擬合及方差分析，方差分析結(jié)果見表3。乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和微波時(shí)間對(duì)沙棘黃酮提取量的二次多項(xiàng)擬合方程為Y=19.71-0.46A-1.84B+0.72C+1.20AB+0.60AC-0.39BC-0.64A2-2.80B2-0.90C2。

表3 回歸模型方差分析

從表3可以看出，該模型極顯著（P＜0.01），同時(shí)失擬項(xiàng)不顯著（P=0.532 1＞0.05），這表明此模型結(jié)果可靠，故能夠利用該模型確定沙棘黃酮的最佳提取工藝。從表3可以看出，B、C、AB、B2、C2影響均極顯著（P＜0.01），說(shuō)明料液比和微波時(shí)間對(duì)沙棘黃酮提取量的影響極其顯著。各因素對(duì)響應(yīng)值的影響可以由P值反映，即P值越小，表明影響越大。由此可得出，影響微波提取沙棘黃酮提取量因素的主次關(guān)系是B＞C＞A，即料液比＞微波時(shí)間＞乙醇體積分?jǐn)?shù)。

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果

圖5為乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比之間交互作用對(duì)沙棘黃酮提取量影響的響應(yīng)曲面與等高線圖。響應(yīng)面越陡峭、等高線圖形狀越呈橢圓形表明兩因素交互作用對(duì)黃酮提取量影響越顯著且交互作用越強(qiáng)。乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比對(duì)黃酮提取量的響應(yīng)面走勢(shì)彎曲陡峭程度較大，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比兩因素對(duì)黃酮提取量影響有較強(qiáng)的顯著性，等高線為橢圓且緊密，說(shuō)明乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比兩因素之間有較強(qiáng)的交互作用。微波時(shí)間2 min時(shí)，增大乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比料，沙棘黃酮提取量先增加后下降，料液比1︰26（g/mL）、乙醇體積分?jǐn)?shù)60%時(shí)，黃酮提取量達(dá)到最大值20.18 mg/g。

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)與料液比對(duì)黃酮提取量的響應(yīng)曲面與等高線圖

2.2.3 響應(yīng)面驗(yàn)證試驗(yàn)

通過(guò)響應(yīng)面模型的預(yù)測(cè)，最佳工藝條件為乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1︰24.16（g/mL）、微波時(shí)間2.38 min，此時(shí)黃酮提取量的預(yù)測(cè)值為19.17 mg/g?？紤]到試驗(yàn)的實(shí)際操作，進(jìn)行取整微調(diào)，即乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1︰25（g/mL）、微波時(shí)間2.5 min，在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得沙棘黃酮平均提取量為22.13 mg/g，與預(yù)測(cè)值差異較小，這表明該模型可較準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)沙棘黃酮提取量，具有較好的可靠性。

2.3 沙棘果渣黃酮純化研究

2.3.1 大孔樹脂篩選結(jié)果

由圖6可看出，4種樹脂對(duì)沙棘黃酮都有一定吸附能力，其中AB-8吸附能力最強(qiáng)，其吸取量達(dá)到12.03 mg/g，解吸量達(dá)到10.95 mg/g。吸附能力的排名為AB-8＞X-5＞NKA-9＞D101，解吸能力排名為AB-8＞D101＞X-5＞NKA-9。通過(guò)比較可知，AB-8對(duì)沙棘黃酮具有最高的吸附能力和解吸力，因此選AB-8大孔樹脂對(duì)沙棘總黃酮分離純化。

圖6 樹脂的篩選

2.3.2 AB-8大孔樹脂動(dòng)態(tài)吸附條件優(yōu)化

2.3.21 泄露曲線的確定

從圖7可看出，隨流出液體積的增加，流出液中的黃酮含量逐漸增加，說(shuō)明AB-8樹脂對(duì)于沙棘黃酮的吸附效果逐漸變差，當(dāng)流出液濃度達(dá)到上樣液濃度的10%（泄漏點(diǎn)），即上樣液黃酮濃度1.137 mg/mL、泄漏點(diǎn)濃度0.114 mg/mL、流出液體積70 mL時(shí)，流出液中黃酮濃度達(dá)到0.119 mg/mL，因此確定其為泄漏點(diǎn)。綜上所述，上樣液中黃酮濃度1 mg/mL時(shí)，AB-8樹脂最大上樣液體積為70 mL。

圖7 沙棘黃酮的泄露曲線

2.3.22 上樣液濃度的選擇

由圖8可看出，隨著供試液濃度的增加，AB-8樹脂對(duì)于沙棘黃酮的吸附率逐漸增加然后緩慢下降，質(zhì)量濃度2 mg/mL時(shí)達(dá)到峰值。供試液濃度較低時(shí)，即使存在泄漏現(xiàn)象，樹脂也不會(huì)達(dá)到飽和；提高其濃度，則提高黃酮與樹脂的接觸率，利于黃酮向樹脂擴(kuò)散，有利于提高樹脂的吸附率；但是濃度過(guò)高，會(huì)導(dǎo)致吸附的雜質(zhì)增加，從而減少有效吸附面積，降低樹脂吸附效果。綜合來(lái)看，供試液質(zhì)量濃度2 mg/mL左右為宜。

圖8 上樣濃度對(duì)吸附率的影響

2.3.23 上樣液流速的選擇

由圖9可看出，隨上樣流速的增加，AB-8樹脂對(duì)沙棘黃酮的吸附率逐漸下降，可能是由于流速增加導(dǎo)致黃酮在樹脂中的停留時(shí)間短，沙棘黃酮和AB-8樹脂之間的接觸時(shí)間更短。流速越慢，樹脂對(duì)沙棘黃酮的吸附效果越好。但是流速過(guò)慢，會(huì)讓吸附效率變低，上樣液流速不超過(guò)1.5 mL/min時(shí)，增加流速，沙棘黃酮的吸附率只是略微降低，上樣液流速超過(guò)1.5 mL/min，黃酮的吸附率快速降低，綜合吸附效果及吸附效率，選擇上樣流速1.5 mL/min較合適。

圖9 上樣流速對(duì)于吸附率的影響

2.3.24 洗脫液用量的確定

由圖10可知，隨著洗脫液用量的增加，流出液中黃酮濃度先迅速增加后快速降低。洗脫液用量100 mL時(shí)，流出液中黃酮的濃度接趨近于0；洗脫液用量110～120 mL時(shí)，洗脫液中沙棘黃酮的濃度降低為0。洗脫液用量過(guò)少，AB-8樹脂不能充分解吸，洗脫液用量過(guò)多又會(huì)造成資源的浪費(fèi)。綜合來(lái)看，洗脫液用量50 mL較合適。

2.3.25 洗脫液流速的確定

由圖11可看出，沙棘黃酮在AB-8樹脂上的解吸率，隨洗脫液流速的增加而下降。洗脫液流速1 mL/min時(shí)，解吸率達(dá)到最大值60.23%。適當(dāng)?shù)脑黾恿魉?，可提高解吸效率。從圖11可以看出，洗脫液流速1和2 mL/min在解吸率上區(qū)別很小，但可以提高試驗(yàn)效率，因此選擇洗脫液流速2 mL/min較合適。

圖11 洗脫液流速對(duì)洗脫率的影響

3 結(jié)論

以沙棘果渣為原料，采用微波輔助方法提取沙棘果渣中的黃酮，通過(guò)單因素試驗(yàn)研究乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、微波時(shí)間和微波功率對(duì)沙棘果渣中黃酮提取量的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上采用響應(yīng)面優(yōu)化沙棘黃酮提取工藝，并利用大孔樹脂對(duì)沙棘果渣粗黃酮進(jìn)行純化。結(jié)果表明：沙棘果渣黃酮微波輔助處理，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、料液比1︰25（g/mL）、微波時(shí)間2.5 min時(shí)，沙棘黃酮平均提取量達(dá)22.13 mg/g。在動(dòng)態(tài)吸附/解吸試驗(yàn)中，AB-8型大孔樹脂純化沙棘黃酮的最佳條件為上樣量70 mL、上樣濃度2 mg/mL、上樣流速1.5 mL/min、洗脫液用量100 mL、洗脫液流速2 mL/min。利用上述試驗(yàn)條件純化沙棘果渣黃酮，經(jīng)過(guò)真空冷凍干燥后得到的沙棘果渣提取物中黃酮含量從17.3%提高到31.50%。試驗(yàn)結(jié)果為沙棘副產(chǎn)物資源綜合利用提供參考。