超聲輔助浸提烤肉蘸料中多元素檢測前處理方法

杜華楠，佘鐵軍，楊英嬌，王姣，范雯謖，張蕾

齊齊哈爾市疾病預(yù)防控制中心（齊齊哈爾 161000）

烤肉是齊齊哈爾地區(qū)特色美食，隨著烤肉文化的影響和商業(yè)化推廣，烤肉的受眾群體越來越多，作為烤肉“伴侶”的烤肉蘸料越來越值得重視?？救庹毫鲜墙Y(jié)合區(qū)域特色食品而生的一種復(fù)合調(diào)味料，其主料為花生、大豆、芝麻等，其余輔料，不同廠商配比各不相同，烤肉中污染物的限量要求遵循GB 2762—2017《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中污染物限量》，而GB 31644—2018《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 復(fù)合調(diào)味料》中大部分限量要求，特別是元素部分則引用GB 2762—2017，但復(fù)合調(diào)味品為混合物，很多限值及檢測方法由于其類別歸屬不明確而無法確定，所以針對烤肉蘸料中多元素檢測特點，建立一套實用性強(qiáng)、效率高、穩(wěn)定性好、針對性強(qiáng)的烤肉蘸料中多元素檢測方法是有必要的。

針對烤肉蘸料等復(fù)合調(diào)味品的研究主要集中在有機(jī)領(lǐng)域?qū)︼L(fēng)味物質(zhì)的檢測和對違規(guī)食品添加劑的檢測，對需要精確定量的元素檢測研究較少[1-3]，因重金屬代謝周期長，易沉積在體內(nèi)，所以對烤肉蘸料中元素的質(zhì)控更應(yīng)做到未雨綢繆[4-6]。如：Korkmaz等[7]針對土耳其常見的15種香料中微量元素和鎘含量進(jìn)行研究；范文秀等[8]通過微波消解法-等離子體發(fā)射光譜法對王守義麻辣鮮、燉雞肉香料等10種天然復(fù)合調(diào)味品中7種金屬元素進(jìn)行檢測，研究優(yōu)化消化程序，并對檢測數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。

復(fù)合調(diào)味料元素檢測前處理方法、檢測方法以及其之間的組合較多，多參照食品中元素檢測的方法，如微波消解、干法消解、火焰原子吸收、石墨爐法等[8-9]，但是烤肉蘸料的特點是原料中主要成分油脂含量較大，對消解條件要求較為苛刻，需要高溫度且長時間消解，如微波消解溫度達(dá)200 ℃以上，易造成揮發(fā)性元素的損失[10-11]，降低溫度縮短時間會造成消解不完全影響檢測[12]。試驗研究乙醚超聲萃取-微波消解法，通過乙醚超聲浸提處理，去除樣品中大量油脂[13]，對微波消解進(jìn)行“減負(fù)”，最大程度減少揮發(fā)性元素?fù)p失，保證檢測方法的準(zhǔn)確性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

烤肉蘸料（齊齊哈爾市售）；金屬多元素混合標(biāo)準(zhǔn)品（美國安捷倫公司）；68%硝酸（優(yōu)級純，美國Merck牌）；雙氧水（優(yōu)級純，滬試牌）；無水乙醚（優(yōu)級純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；純水（實驗室純水機(jī)自制）；高純氬氣、高純氦氣（齊齊哈爾市售）。

1.2 儀器與設(shè)備

安捷倫7900型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀（ICPMS，美國安捷倫公司）；Mars6型微博消解儀（美國CEM公司）；微型破碎機(jī)（德國IKA公司）；BP211D型分析天平（德國賽多利斯公司）；超聲波發(fā)生儀；Milli-Q型去離子水發(fā)生器（美國Millipore公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理方法

稱取0.5 g市售烤肉蘸料，如樣品粉碎粒度不夠細(xì)則需重新粉碎，以免影響消解效果，樣品稱量后編號，待處理。

1.3.2 乙醚超聲浸提方法單因素試驗

以無水乙醚為溶劑，在超聲輔助下對樣品中的油脂進(jìn)行浸提[14]。

超聲浸提工藝參數(shù)的確定[15]：分別對烤肉蘸料中的常量元素Fe、微量元素Pb、易揮發(fā)元素Hg這3種元素進(jìn)行檢測，為增強(qiáng)對比效果，F(xiàn)e、Pb元素直接檢測，Hg元素含量少易揮發(fā)損失進(jìn)行加標(biāo)后檢測；分別對超聲浸提的功率、溫度、時間3個主要參數(shù)進(jìn)行單因素試驗，超聲功率單因素區(qū)間25～65 W，超聲溫度單因素區(qū)間20～60 ℃，超聲時間單因素區(qū)間10～50 min，單因素試驗指標(biāo)設(shè)為Q，按式（1）計算。

式中：C0為應(yīng)用超聲浸提輔助前處理方法檢出元素含量，mg/kg；C1為常規(guī)前處理檢出元素含量，mg/kg。

1.3.3 響應(yīng)面試驗設(shè)計

各元素在消解過程中揮發(fā)損失的程度不同，應(yīng)以易損失元素確定消化條件。與其他元素相比，Hg元素更易損失，以Hg元素檢出值為響應(yīng)值設(shè)計中心組合（Box-Behnken）試驗，自變量因素為超聲功率、超聲溫度、超聲時間，Q（Hg）為響應(yīng)值，自變量水平編碼見表1。

表1 因素水平編碼表

1.3.4 微波消解方法[16-17]

將經(jīng)過乙醚超聲浸提后的樣品進(jìn)行除溶劑處理，放入消解罐中，加入8 mL消解液[硝酸與雙氧水（HNO3與H2O2）體積比6︰2]，冷消化1 h，設(shè)定2套微波消解程序。第1套微波消解程序為普通方法參數(shù)，第2套微波消解程序為配合超聲浸提的微波消解程序。詳見表2。

表2 微波消解條件

1.3.5 金屬元素檢測方法

檢測方法采用ICP-MS法，該方法與傳統(tǒng)的原子熒光、原子吸收檢測法相比，可多元素進(jìn)行同時檢測，具檢測效率高、靈敏度高、檢出限低等優(yōu)勢。其中：K、Ca、Na、Mg、Fe等常量元素檢測標(biāo)準(zhǔn)序列范圍為0～10 000 ng/mL；B、Al、V、Cr、Mn、Co、Ni、Cu、Zn、As、Se、Rb、Sr、Mo，Cd、Sn、Sb、Ba、Pb、Li等微量元素檢測標(biāo)準(zhǔn)序列范圍為0～500 ng/mL；Hg元素因其含量低、易殘留等原因需要單獨(dú)測定，標(biāo)準(zhǔn)序列范圍為0～3.0 ng/mL；超出曲線部分可進(jìn)行稀釋后檢測，具體檢測條件見表3。

表3 ICP-MS檢測條件[18-19]

1.3.6 超聲乙醚浸提對微波消解條件的影響[14]

以Hg元素回收率為指標(biāo)對空白組樣品進(jìn)行不同濃度梯度的加標(biāo)回收試驗，詳見表4。

表4 加標(biāo)回收試驗條件表

1.3.7 確定方法檢出限、定量限[20]

根據(jù)單因素試驗及響應(yīng)面優(yōu)化法確定試驗參數(shù)，對烤肉蘸料中常見的26種元素檢測方法的檢出限、定量限進(jìn)行計算，按式（2）和（3）計算。

式中：SMDL為檢出限；SLOQ為定量限；σ為空白樣品或被測物定量限界附近的樣品測定值的標(biāo)準(zhǔn)偏差；Sslope為檢出限/定量限附近標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲浸提單因素試驗

2.1.1 超聲浸提功率單因素試驗

按照1.3.2的試驗設(shè)計進(jìn)行，超聲功率作為單因素變量，分別選取25，35，45，55和65 W，另外2個定量分別設(shè)置為超聲時間30 min、超聲溫度40 ℃，超聲浸提處理后對樣品進(jìn)行脫溶劑處理待測，計算Q值。由圖1可以看出，3種元素的Q值變化趨勢一致，在25～45 ℃區(qū)間呈正比關(guān)系，在45～55 ℃區(qū)間3種元素Q值略有小幅波動，總體呈平穩(wěn)趨勢，超過55 W后3種元素Q值均有略微下降趨勢。形成該趨勢主要原因為浸提實質(zhì)是傳質(zhì)過程，超聲功率加大，超聲空化作用加強(qiáng)，浸提體系內(nèi)局部形成的液體噴流動能加大對細(xì)胞壁等組織機(jī)構(gòu)沖擊力加大，提高細(xì)胞結(jié)構(gòu)通透性，提高傳質(zhì)效率[15]，另外加大超聲功率可加速體系內(nèi)質(zhì)點運(yùn)動作用，同時提高超聲功率可迅速排除物料中氣體加快溶質(zhì)進(jìn)入[21]，但也不可使用過大功率，因為空化作用與超聲頻率密切相關(guān)，在超聲振幅一定時超聲功率增大超聲頻率增加，會引起整個體系空化閾值增加，空化作用難以繼續(xù)增強(qiáng)甚至?xí)袦p弱趨勢[22]，選擇適當(dāng)功率的低頻率的超聲條件，更有利于超聲浸提。

圖1 超聲功率對Q值的影響

2.1.2 超聲浸提溫度單因素試驗

按照1.3.2的試驗設(shè)計進(jìn)行，超聲溫度作為單因素變量，分別選取20，30，40，50和60 ℃，另外2個定量分別設(shè)置為超聲時間30 min、超聲功率45 W，超聲浸提處理后對樣品進(jìn)行脫溶劑處理待測，計算Q值。由圖2可以看出，3種元素的Q值變化趨勢一致，在20～40 ℃區(qū)間呈顯著上升趨勢，在40～50 ℃區(qū)間Pb元素Q值呈平穩(wěn)趨勢，Hg和Fe元素Q值略有增加，超過50 ℃后3種元素Q值均區(qū)域平穩(wěn)，不再繼續(xù)增大，甚至略有下降。形成該趨勢主要原因是溫度升高對超聲熱效應(yīng)有輔助作用，提高體系內(nèi)質(zhì)點運(yùn)動的速度，加之超聲空化作用會產(chǎn)生具有高強(qiáng)動能的沖擊波來改變植物細(xì)胞組織的通透性，從而達(dá)到提高浸提效率的作用[22]，并且一般常規(guī)體系的液體擴(kuò)散系數(shù)與溫度也呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系，因為溫度升高，液體體系黏度降低有利于提取[23]，但也不可一味提高溫度，因為超聲聲能最后大部分轉(zhuǎn)化為熱能[24]，如局部溫度過高會導(dǎo)致易揮發(fā)元素?fù)p失，而且溫度過高會加快大分子降解，還會發(fā)生熱裂解反應(yīng)產(chǎn)生自由基[25]，而這2種因素都會影響浸提效率和效果。

圖2 超聲溫度對Q值的影響

2.1.3 超聲浸提時間單因素試驗

按照1.3.2的試驗設(shè)計進(jìn)行，超聲時間作為單因素變量，分別選取10，20，30，40和50 min，另外2個定量分別設(shè)置為超聲溫度40 ℃、超聲功率45 W，超聲浸提處理后對樣品進(jìn)行脫溶劑處理待測，計算Q值。由圖3可以看出，在0～20 min內(nèi)3種元素Q值均隨著超聲時間的增加而增加，20～30 min內(nèi)3種元素Q值略有增加，與前20 min內(nèi)趨勢相比增加速度明顯減慢，30 min后曲線趨勢趨于平穩(wěn)或略有下降趨勢。形成該趨勢主要原因是超聲介入通過空化作用產(chǎn)生的沖擊力，改變細(xì)胞組織的通透性，通過微波熱作用和直流作用加速質(zhì)點運(yùn)動，溶劑迅速進(jìn)入物料細(xì)胞組織，并且將物料縫隙中的氣體迅速排除，傳質(zhì)阻力降低[26]，浸提效率大幅提高，隨著超聲浸提時間的延長，整個體系達(dá)到一個平衡狀態(tài)，此時繼續(xù)延長超聲浸提時間，數(shù)據(jù)趨勢沒有明顯變化。

圖3 超聲時間對Q值的影響

2.2 超聲解吸條件響應(yīng)面優(yōu)化試驗

響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計按照1.3.3中表1的試驗設(shè)計方案進(jìn)行，三水平三因素試驗設(shè)計方案及檢測結(jié)果見表5。應(yīng)用Design Expert 8.5.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析和處理，得到的試驗結(jié)果回歸擬合模型為R1=2.79+0.50A+0.29B+0.27C+0.25AB-0.18AC-0.047BC-0.84A2-0.50B2-0.28C2。Q（Hg）的響應(yīng)面回歸模型方差分析結(jié)果見表6。

表5 響應(yīng)面設(shè)計方案及試驗結(jié)果

表6 Q(Hg)的響應(yīng)面回歸模型方差分析

表7 響應(yīng)面尋優(yōu)結(jié)果

由表6得出，在響應(yīng)面模型二次項中，A、B、C、AB、A2、B2、C2的P值均小于0.01，極顯著，交互影響評定，AB、AC交互作用顯著，其中AB交互極顯著，BC交互作用不顯著?；貧w模型P＜0.000 1，模型極顯著，失擬項P＞0.05，不顯著，模型響應(yīng)值Q（Hg）的二次多項回歸方程決定系數(shù)R2=0.987 6、調(diào)整系數(shù)Radj2=0.971 7，說明模型模擬的精密度、回歸效果及擬合度良好，可信度高，模型可真實反映各因素與響應(yīng)值之間的聯(lián)系。根據(jù)回歸模型，做出關(guān)于3個超聲浸提因素與響應(yīng)值的響應(yīng)面分析圖，結(jié)果如圖4所示。

圖4 Q(Hg)響應(yīng)面圖

按照所得整理值對回歸模型進(jìn)行驗證性試驗，試驗結(jié)果Q（Hg）為2.99 mg/kg，結(jié)果證明響應(yīng)面優(yōu)化所得預(yù)測值與試驗值之間的擬合性良好，模型所得參數(shù)切實可行真實有效。

2.3 超聲浸提處理對微波消解條件的影響

按照1.3.5的試驗設(shè)計方案進(jìn)行試驗，其中超聲浸提參數(shù)采用2.2中優(yōu)化出的參數(shù)，分別對3種濃度梯度的加標(biāo)樣品進(jìn)行檢測。由結(jié)果可知，第1組、第2組加標(biāo)回收率相近，第3組最低，第4組結(jié)果最高。由于第1和第2組應(yīng)用的微波消解溫度較高，所以會造成Hg元素的損失，而且損失量大體相近。第3組沒有應(yīng)用超聲浸提除去油脂，直接應(yīng)用低溫消解的方式，造成消化不徹底，影響檢測準(zhǔn)確性，特別是在0.05 mg/kg這個濃度加標(biāo)回收率已經(jīng)＜60%。第4組為試驗重點研究的方法，加標(biāo)回收率為4組試驗中最高，對易揮發(fā)性元素檢測準(zhǔn)確性較高，加標(biāo)回收率達(dá)到測組分含量1～100 mg/kg、回收率范圍90%～110%，測組分含量0.1～1 mg/kg、回收率范圍80%～110%，測組分含量＜0.1 mg/kg、回收率范圍60%～120%的標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果詳見表8。

表8 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

2.4 多元素檢出限定量限的確定

按照1.3.6的試驗設(shè)計，采用2.2中優(yōu)化出的超聲解吸參數(shù)進(jìn)行試驗，結(jié)果各元素檢出限（SMDL）定量限（SLOQ）均低于GB 5009.268—2016中的要求，詳見表9。

表9 方法檢出限、定量限

3 結(jié)論

通過超聲輔助浸提法與低溫微波消解法相結(jié)合，去除樣品中大量油脂，解決烤肉蘸料多元素檢測過程中，樣品油脂含量過大導(dǎo)致消化不完全及消化溫度高部分元素?fù)p失的問題。通過Box-Behnken試驗對方法參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，得到最優(yōu)超聲浸提工藝參數(shù)：超聲浸提功率50 W、超聲浸提溫度43.6 ℃、超聲浸提時間36 min。應(yīng)用響應(yīng)面模型所得參數(shù)進(jìn)行試驗，測得Q（Hg）為2.99 mg/kg。通過4組試驗對不同濃度梯度的Hg進(jìn)行加標(biāo)回收試驗，超聲輔助浸提低溫微波消解法加標(biāo)回收率最高，表明烤肉蘸料等高油脂含量樣品中多元素檢測，可通過乙醚超聲浸提除油處理，降低微波消解溫度梯度，減少易揮發(fā)元素的損失。應(yīng)用試驗方法對26種元素進(jìn)行檢出限、定量限檢測和計算，結(jié)果均符合國標(biāo)要求。試驗對烤肉蘸料等高含油量的樣品中金屬離子檢測領(lǐng)域的發(fā)展具有一定意義。