真空冷凍干燥制備花青素微膠囊及穩(wěn)定性研究

許樂(lè)貝，張見(jiàn)，劉元法

1.白馬未來(lái)食品研究院（南京 211226）；2.江南大學(xué)食品學(xué)院（無(wú)錫 214122）

花青素是以2-苯基苯并吡喃陽(yáng)離子為母核，以C6—C3—C6為基本碳骨架的黃酮類(lèi)物質(zhì)，是一種天然的水溶性色素[1-2]。已知的花青素有20余種，自然界最基本、最常見(jiàn)的花青素有6種，包括矢車(chē)菊素、飛燕草素、天竺葵素、芍藥素、矮牽牛素和錦葵花素。自然條件下游離狀態(tài)的花青素極少見(jiàn)，花青素通常與1個(gè)或多個(gè)葡萄糖、鼠李糖、半乳糖、阿拉伯糖在C3、C5、C7和C3’、C4’、C5’位以糖苷鍵相連形成花色苷[3]。

藍(lán)莓花青素具有顯著抗氧化性能，長(zhǎng)期食用藍(lán)莓據(jù)稱(chēng)可以增強(qiáng)視力和大腦功能，并且可通過(guò)發(fā)揮抗炎作用減輕慢性疾病，如肥胖和糖尿病[4-5]。然而，花青素由于其本身化學(xué)結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、易在環(huán)境中降解的特性，極大限制其在食品和醫(yī)療工業(yè)中的應(yīng)用。由于溫度、光照、氧氣、金屬離子、酶和pH等多種環(huán)境因素的影響，這類(lèi)化合物很容易發(fā)生降解從而失去顏色[1]。研究顯示，花青素的生物利用度為0.26%～1.8%[6]。在胃中，pH 1.5～3時(shí)，其主要化學(xué)形式為黃酮陽(yáng)離子，而在腸道環(huán)境中，甲醇形式占主導(dǎo)地位，吸收率較低[7]。因此，探索如何提高花青素的穩(wěn)定性具有非常重要意義。近年來(lái)，為提高花青素的生物利用度，提出并開(kāi)發(fā)納米膠囊化、微膠囊化和蛋白質(zhì)復(fù)合物等不同的新型遞送系統(tǒng)[6,8-9]。

常見(jiàn)的制備花青素微膠囊的方法包括噴霧干燥法[10]和真空冷凍干燥法[11-12]。真空冷凍干燥法制備花青素微膠囊不僅能有效抑制花青素因高溫、氧氣等外界因素而發(fā)生變化，而且能較好保存花青素的活性及其本身的外觀顏色[13]。用于微膠囊的壁材應(yīng)性質(zhì)穩(wěn)定，不與內(nèi)部的芯材發(fā)生反應(yīng)，且應(yīng)具有良好的乳化性、致密性和成膜性，其中多孔變性淀粉、纖維素衍生物類(lèi)是具有廣闊的應(yīng)用前景的壁材[13-14]。在前期研究中發(fā)現(xiàn)，取芯壁材體積比1︰1，1︰2和1︰3，芯壁材體積比1︰1時(shí)，混合后的液體水分高，預(yù)凍時(shí)間及真空冷凍干燥時(shí)間相對(duì)延長(zhǎng)，不利于低耗生產(chǎn)；芯壁材體積比1︰3時(shí)，以高濃度的魔芋粉壁材為例，芯材與壁材融合后的液體較濃稠，花青素分散不均勻，不利于制備品質(zhì)均一的花青素微膠囊；芯壁材體積比1︰2時(shí)，花青素分散均勻，所制備的花青素微膠囊品質(zhì)均一，且有利于低耗生產(chǎn)。因此，確定最佳的芯壁體積比為1︰2。

試驗(yàn)比較5種壁材對(duì)藍(lán)莓花青素的包埋效果的影響，研究pH、溫度、金屬離子Ca2+和儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)藍(lán)莓花青素微膠囊的影響，以期為藍(lán)莓的深加工利用和藍(lán)莓花青素的性質(zhì)研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

藍(lán)莓花青素粉末（純度25%，西安圣青生物科技有限公司）；羥丙基淀粉、羥丙基二淀粉磷酸酯（杭州普羅星淀粉有限公司）；麥芽糊精（河南中辰生物科技有限公司）；粘米粉、魔芋粉（均購(gòu)于當(dāng)?shù)卮笮统校粰幟仕帷幟仕徕c、氯化鈣、鹽酸、無(wú)水乙醇、甲醇、乙腈、甲酸（均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

真空冷凍干燥機(jī)（scientz-100FB-S，寧波新芝生物科技股份有限公司）；液相色譜儀（LC-20A，日本島津）；恒溫水浴鍋（HHS-21-6，上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司）；分析天平（BSA224S，德國(guó)賽多利斯）；pH計(jì)[FE28，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司]；一級(jí)純水系統(tǒng)（ELIX 5+Synergy UV，美國(guó)密理博）；高速冷凍離心機(jī)（Thermo X4R pro，賽默飛）。

1.2 藍(lán)莓花青素的包埋工藝

芯材（藍(lán)莓花青素溶液）制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取10 g藍(lán)莓花青素粉末（純度25%），溶于1 500 mL一級(jí)純水中，充分?jǐn)嚢柚敝辆鶆?，制得質(zhì)量濃度1.67 g/L的藍(lán)莓花青素芯材，避光陰涼處保存。

壁材制備：準(zhǔn)確稱(chēng)取40，60和80 g 5種不同壁材（麥芽糊精、魔芋粉、羥丙基淀粉、羥丙基二淀粉磷酸酯、粘米粉），分別溶于1 000 mL的一級(jí)純水中，充分?jǐn)嚢柚敝辆鶆颍频觅|(zhì)量濃度40，60和80 g/L的壁材（麥芽糊精、魔芋粉、羥丙基淀粉、羥丙基二淀粉磷酸酯、粘米粉）。

按照芯材與壁材體積比1︰2，吸取15 mL芯材，分別溶于30 mL的各濃度壁材中，充分?jǐn)嚢柚敝粱旌暇鶆?，倒入硅膠膜具中，在-20 ℃冰箱中預(yù)凍24 h。

真空冷凍干燥過(guò)程：預(yù)凍結(jié)束后，將各物塊從硅膠模具中脫模，置于不銹鋼樣品盤(pán)中，進(jìn)入真空冷凍干燥機(jī)設(shè)備的自動(dòng)程序進(jìn)行真空冷凍干燥，持續(xù)時(shí)間為48 h。真空冷凍干燥結(jié)束，收集各物塊并充分碾碎，避光密封保存。

1.3 藍(lán)莓花青素含量的液相色譜測(cè)定

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.1 g（精確至0.000 1 g，固體、液體均適用）待測(cè)樣品，用提取液（V無(wú)水乙醇︰V一級(jí)水︰V鹽酸=2︰1︰1）定容至50 mL刻度線，混勻1 min后，超聲提取30 min。超聲提取后，于100 ℃沸水浴中水解1 h，取出冷卻后，用提取液再次定容至50 mL，在5 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液，用0.22 μm有機(jī)相濾膜過(guò)濾，收集濾液，上機(jī)待測(cè)。

液相色譜檢測(cè)條件：色譜柱大小4.6 mm×250 mm，材質(zhì)5 μm C18；柱溫40 ℃；進(jìn)樣量10 μL；流速1.00 mL/min。

1.4 藍(lán)莓花青素包埋率的測(cè)定

花青素包埋率按式（1）計(jì)算。

式中：Ax為樣品中花青素測(cè)定的實(shí)際值，mg/g，由液相色譜測(cè)定并計(jì)算所得，每個(gè)樣品3組平行，取平均值；A0為樣品中花青素含量的理論值，mg/g。

40 g/L的各材質(zhì)壁材中A0=（C芯×V芯）/（C壁×V壁）=（1.67×15）/（40×30）×100=20.83 mg/g；60 g/L的各材質(zhì)壁材中A0=（C芯×V芯）/（C壁×V壁）=（1.67×15）/（60×30）×100=13.89 mg/g；80 g/L的各材質(zhì)壁材中A0=（C芯×V芯）/（C壁×V壁）=（1.67×15）/（80×30）×100=10.42 mg/g。

1.5 藍(lán)莓花青素微膠囊穩(wěn)定性試驗(yàn)

1.5.1 不同壁材及濃度對(duì)花青素微膠囊的影響

測(cè)定壁材質(zhì)量濃度40，60和80 g/L的麥芽糊精、魔芋粉、羥丙基淀粉、羥丙基二淀粉磷酸酯、粘米粉包埋質(zhì)量濃度為1.67 g/L花青素溶液芯材后的各微膠囊中花青素含量，每組3個(gè)平行，取平均值。

1.5.2 pH對(duì)花青素微膠囊的影響

向裝有0.1 g的花青素微膠囊的離心管中分別加入5 mL pH 2.0，5.0和7.0的檸檬酸鹽緩沖液溶液，密封后充分混勻，于室溫（20 ℃）避光靜置8 h，取出測(cè)定花青素含量，每組3個(gè)平行，取平均值。

1.5.3 溫度對(duì)花青素微膠囊的影響

向裝有0.1 g花青素微膠囊的離心管中加入5 mL pH 3.0的檸檬酸鹽緩沖液，密封后充分混勻，分別于4，20和60 ℃避光水浴8 h，取出測(cè)定花青素含量，每組3個(gè)平行，取平均值。

1.5.4 Ca2+對(duì)花青素微膠囊的影響

向裝有0.1 g花青素微膠囊的離心管中分別加入5 mL濃度為0.1，0.5和1.0 mol/L的CaCl2溶液，密封后充分混勻，于室溫（20 ℃）避光靜置8 h，取出測(cè)定花青素含量，每組3個(gè)平行，取平均值。

1.5.5 儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)花青素微膠囊的影響

避光密封在室溫儲(chǔ)存3個(gè)月后，再次測(cè)定壁材濃度為40，60和80 g/L的羥丙基二淀粉磷酸酯包埋花青素溶液芯材后的各微膠囊中花青素含量，每組3個(gè)平行，取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 壁材對(duì)藍(lán)莓花青素包埋率的影響

5種壁材的3種不同濃度對(duì)花青素包埋率的影響如圖2所示。

圖2 不同壁材及壁材濃度對(duì)花青素包埋率的影響

由于麥芽糊精的DE值較低，因此常用作一種惰性包埋材料[15-16]。魔芋粉因具有良好的穩(wěn)定性和成膜性，在功能性物質(zhì)的微膠囊化研究中報(bào)道較多，具有一定的應(yīng)用前景[17]。變性淀粉如羥丙基淀粉和羥丙基二淀粉磷酸酯在功能性物質(zhì)的微膠囊化研究中鮮有報(bào)道，它們都屬于食品添加劑中增稠劑的一種，具有良好的穩(wěn)定性[18-19]。粘米粉是一種常見(jiàn)的食品原料，具有良好的穩(wěn)定性和安全性，但不具有增稠性[20]。由圖2可知，5種壁材的3種濃度對(duì)1.67 g/L的花青素溶液進(jìn)行包埋，羥丙基二淀粉磷酸酯在各濃度下的包埋率在這5種壁材里均為最高，羥丙基二淀粉磷酸酯濃度達(dá)到60 g/L時(shí)，包埋率最高可達(dá)55.21%。這可能是由于羥丙基二淀粉磷酸酯本身作為一種增稠劑、黏結(jié)劑，遇水后膨潤(rùn)性高，與花青素交聯(lián)緊密導(dǎo)致。麥芽糊精、魔芋粉在包埋評(píng)價(jià)中表現(xiàn)次之，粘米粉表現(xiàn)最差。

2.2 pH對(duì)藍(lán)莓花青素包埋率的影響

通過(guò)選用質(zhì)量濃度60 g/L、包埋率55.21%的羥丙基二淀粉磷酸酯壁材進(jìn)行羥丙基二淀粉磷酸酯-花青素微膠囊的pH穩(wěn)定性的研究。pH對(duì)羥丙基二淀粉磷酸酯-花青素微膠囊包埋率的影響如圖3所示。

圖3 不同pH對(duì)花青素包埋率的影響

結(jié)果表明，利用60 g/L的羥丙基二淀粉磷酸酯包埋花青素時(shí)，在強(qiáng)酸pH 2.0、弱酸pH 5.0和中性pH 7.0條件下，包埋率分別為55.17%，54.09%和51.36%，損失率分別為0.07%，2.03%和6.97%?？傮w來(lái)說(shuō)，羥丙基二淀粉磷酸酯-花青素微膠囊在2.0＜pH＜7.0時(shí)具有良好的穩(wěn)定性，但隨著體系變中性，損失率也增大。

2.3 溫度對(duì)藍(lán)莓花青素包埋率的影響

選用質(zhì)量濃度60 g/L、包埋率55.21%的羥丙基二淀粉磷酸酯壁材進(jìn)行羥丙基二淀粉磷酸酯-花青素微膠囊的溫度穩(wěn)定性的研究。溫度對(duì)花青素包埋率的影響如圖4所示。

圖4 不同溫度對(duì)花青素包埋率的影響

結(jié)果表明，利用60 g/L的羥丙基二淀粉磷酸酯包埋花青素時(shí)，在4，20和60 ℃下，包埋率分別為51.61%，53.17%和47.63%，損失率分別為6.52%，3.69%和13.73%。其原因在于，溫度升高時(shí)，花青素結(jié)構(gòu)發(fā)生氧化降解，向無(wú)色的甲醇假堿和查爾酮轉(zhuǎn)化。已有大量研究結(jié)果表明，溫度對(duì)不同來(lái)源的花色苷的降解均符合一級(jí)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)規(guī)律，隨著加熱溫度的升高或時(shí)間的延長(zhǎng)，花青素的降解速度加快，25 ℃是花青素最穩(wěn)定的溫度[21-22]。溫度降低時(shí)，花青素結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生一定程度的降解。因此，在20 ℃條件下最為穩(wěn)定，適合這一微膠囊的儲(chǔ)存。

2.4 Ca2+對(duì)藍(lán)莓花青素包埋率的影響

選用60 g/L的羥丙基二淀粉磷酸酯壁材進(jìn)行羥丙基二淀粉磷酸酯-花青素微膠囊的金屬離子Ca2+穩(wěn)定性的研究。Ca2+對(duì)花青素包埋率的影響如圖5所示。

結(jié)果表明，利用60 g/L的羥丙基二淀粉磷酸酯包埋花青素時(shí)，Ca2+濃度0.1，0.5和1.0 mol/L時(shí)，包埋率分別為53.83%，43.69%和5.22%，損失率分別為2.49%，20.87%和90.55%。低濃度的Ca2+（＜0.1 mol/L）對(duì)花青素的穩(wěn)定性沒(méi)有顯著影響，但隨著Ca2+濃度增加，溶液由深紫色轉(zhuǎn)變成深藍(lán)色，花青素出現(xiàn)明顯破環(huán)與損失。因此，在這一微膠囊的儲(chǔ)存及應(yīng)用環(huán)節(jié)中，應(yīng)避免濃度＞0.1 mol/L的Ca2+環(huán)境。

2.5 儲(chǔ)存時(shí)間對(duì)藍(lán)莓花青素包埋率的影響

儲(chǔ)藏時(shí)間（3個(gè)月）對(duì)不同壁材濃度的羥丙基二淀粉磷酸酯-花青素微膠囊包埋率的影響如圖6所示。

圖6 儲(chǔ)藏時(shí)間對(duì)羥丙基二淀粉磷酸酯-花青素微膠囊包埋率的影響

結(jié)果表明，利用40，60和80 g/L的羥丙基二淀粉磷酸酯包埋花青素時(shí)，包埋率分別為41.14%，55.21%和48.97%，經(jīng)過(guò)3個(gè)月的避光密封室溫儲(chǔ)存后，包埋率分別為40.04%，54.45%和48.66%，損失率分別為2.67%，1.38%和0.63%，在各濃度下，花青素的穩(wěn)定性沒(méi)有發(fā)生顯著變化，保存得較為完好。由此可見(jiàn)，羥丙基二淀粉磷酸酯是一種理想的花青素包埋劑，通過(guò)真空冷凍干燥的包埋處理可有效提高花青素穩(wěn)定性。

3 結(jié)論

試驗(yàn)從幾種較為常見(jiàn)的微膠囊壁材及鮮有報(bào)道的幾種淀粉材料出發(fā)，比較5種壁材對(duì)藍(lán)莓花青素包埋率的影響，篩選適合藍(lán)莓花青素真空冷凍干燥的包埋劑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，羥丙基二淀粉磷酸酯的包埋效果顯著，可能是由于其本身作為一種食品增稠劑具有良好的交聯(lián)效果及穩(wěn)定性所致。此外，羥丙基二淀粉磷酸酯-花青素微膠囊利用在食品，如軟糖中，還具有協(xié)同的凝膠作用。以60 g/L羥丙基二淀粉磷酸酯包埋花青素時(shí)，在強(qiáng)酸pH 2.0及弱酸pH 5.0條件下具有良好穩(wěn)定性，在20 ℃下穩(wěn)定性最佳。然而，其不耐受高濃度的Ca2+體系，Ca2+濃度為1 mol/L時(shí)，損失率達(dá)90.55%。在密封避光條件下，室溫儲(chǔ)藏3個(gè)月穩(wěn)定性幾乎沒(méi)有發(fā)生變化。綜上所述，羥丙基二淀粉磷酸酯作為一種新型藍(lán)莓花青素的包埋劑，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。然而，羥丙基二淀粉磷酸酯-花青素微膠囊在腸胃中的代謝與人體的吸收機(jī)制需進(jìn)一步進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證。