基于比較轉錄組測序分析雨生紅球藻對克氏原螯蝦肝胰腺基因表達的影響

周玥祺 黃春紅 劉玉媛 易弋

摘 要：為明確飼料中添加雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）對克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）肝胰腺基因表達的影響，以克氏原螯蝦商業(yè)飼料作為基礎飼料添加雨生紅球藻，配置含有3‰雨生紅球藻的試驗飼料對克氏原螯蝦進行為期45 d的喂養(yǎng)。基于RNA-seq技術對其肝胰腺的轉錄組數(shù)據(jù)進行分析，測序共獲得44.61 Gb干凈數(shù)據(jù)，Q30堿基百分比在92.46%以上。在FDR≤0.05且|log2FC|≥3的篩選條件下轉錄組測序分析共鑒定出895個差異表達基因。GO功能富集分析結果顯示，差異表達基因主要在能量代謝過程上顯著富集。KEGG通路富集分析結果顯示，差異基因主要在能量代謝、免疫和神經(jīng)傳遞相關通路中被顯著富集。綜上所述，飼料中添加3‰的雨生紅球藻可能有助于克氏原螯蝦提高抵抗病原體和外界環(huán)境變化的能力。

關鍵詞：雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）；克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）；轉錄組

克氏原螯蝦（Procambarus clarkii）又稱淡水小龍蝦，是十足目鰲蝦科原鰲蝦屬節(jié)肢動物[1]。因其適應能力強、肉質緊實、風味極佳且營養(yǎng)豐富，已成為我國重要的養(yǎng)殖水生生物[2]。2022年我國小龍蝦產(chǎn)業(yè)綜合產(chǎn)值為4 580億元，產(chǎn)量為289.07萬噸，占全國淡水養(yǎng)殖總產(chǎn)量的8.79%。是淡水蝦類中養(yǎng)殖面積最廣泛的品種[3]。

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種淡水單細胞綠藻，因其富含蛋白質、礦物質和水溶性維生素等營養(yǎng)物質以及天然蝦青素等生物活性物質而具有較高的營養(yǎng)價值和藥用價值[4]。研究表明，飼料中添加15 mg/kg的雨生紅球藻可以顯著降低虹鱒體內的氧化程度，提高機體的抗氧化能力[5]。飼料中添加15%雨生紅球藻粉可以促進中華絨螯蟹幼蟹生長，改善機體抗氧化功能[6]。飼料中添加0.1%～1.0%的雨生紅球藻能提高尖吻鱸的抗氧化狀態(tài)，降低魚體的過氧化損傷[7]。飼料中添加大于0.30％的雨生紅球藻能夠顯著提高黃顙魚的生長性能，改善血液健康狀況、氧化損傷及免疫應答能力[8]。

目前，雨生紅球藻作為飼料添加劑在克氏原螯蝦中進行的研究主要集中于探究其生長性能、抗氧化能力以及免疫狀態(tài)等方面[9-10]。而雨生紅球藻作為飼料添加劑影響克氏原螯蝦基因表達的有關研究尚未見報道，其對克氏原螯蝦肝胰腺作用的分子機制及作用通路尚未明確。本研究通過轉錄組測序技術探究飼料中添加雨生紅球藻對克氏原螯蝦肝胰腺差異表達基因轉錄表達的情況，為雨生紅球藻作為克氏原螯蝦飼料添加劑的研發(fā)提供參考，促進克氏原螯蝦養(yǎng)殖業(yè)蓬勃發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

克氏原螯蝦取自柳州市柳江區(qū)百朋鎮(zhèn)光明水產(chǎn)養(yǎng)殖場。挑選42只初始平均體質量為（12.74±0.31）g體質健壯無病的克氏原螯蝦在循環(huán)水養(yǎng)殖實驗室中進行為期45 d的喂養(yǎng)。隨機分為2組，每組3個重復，每個重復7尾。養(yǎng)殖過程中，每天分別于09：00和18：00按照蝦體重的3%進行飽食投喂2次，養(yǎng)殖期間每天全量換水1次。

1.2 試驗飼料

對照組飼喂基礎飼料，HP處理組在基礎飼料中添加3‰的雨生紅球藻?；A飼料購自揚州市宏大飼料有限公司，基礎飼料營養(yǎng)指標見表1。雨生紅球藻購自云南維他源生物科技有限公司。飼料原料粉碎后與雨生紅球藻混合均勻，用面條機加工成2.0和2.5 mm規(guī)格的飼料。飼料制作完成在通風處風干，用自封袋密封，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 樣品采集

試驗蝦在養(yǎng)殖期結束后用75%酒精消毒后用無菌解剖剪剪開頭部，然后用無菌眼科鑷取出肝胰腺放入1.5 mL無酶離心管中。采樣結束后將樣品放液氮中速凍，隨后保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 轉錄組學測序

使用RNA抽提（Trizol）法從肝胰腺組織中提取總RNA，采用Oligo dT富集mRNA。將mRNA隨機斷裂成300 bp左右的小片段并進行反轉錄。將反轉錄得到的cDNA加入End Repair Mix將其補成平末端，在3末端加上一個A堿基，用于連接Y字形的接頭。對連接adapter（接頭）后的產(chǎn)物進行純化和片段分選，用分選產(chǎn)物進行PCR擴增，純化得到最終的文庫。采用Illumina NovaSeq 6000平臺進行測序。采用fastp對測序得到的數(shù)據(jù)進行質控得到干凈數(shù)據(jù)，再使用HiSat2與參考基因組（GCF_020424385.1）進行對比得到后續(xù)轉錄本組裝、表達量計算等需要用到的mapped data（映射數(shù)據(jù)）。采用RSEM軟件和DESeq2軟件進行表達量分析和表達差異分析。顯著差異表達基因的篩選標準為：FDR＜0.05，|log2FC|≥3。使用美吉生物云系統(tǒng)對顯著差異表達基因進行KEGG和GO的注釋和富集分析。

1.5 熒光定量PCR驗證

從轉錄組結果中隨機選擇6個差異表達基因采用primer 3軟件設計定量引物。以β-actin為內參，進行熒光定量PCR反應，以Ct值計算每個基因的相對表達量。差異表達基因擴增引物序列如表2所示。

2 結果與分析

2.1 克氏原螯蝦轉錄組測序數(shù)據(jù)質控及差異基因表達

6個樣品的轉錄組分析共獲得44.61 GB干凈數(shù)據(jù)，各樣品干凈數(shù)據(jù)均達到6.08 GB以上，Q30＞92.46%，Q20＞97.34%，測序質量良好。分別將各樣品的干凈數(shù)據(jù)與指定的參考基因組進行序列比對，比對率從92.79%到94.99%不等，符合測序所要求范圍。通過DESeq2軟件對兩組差異表達基因進行篩選，共得到895個差異表達基因，338個上調，557個下調（圖1，見封三）。

2.2 GO功能分類及富集

2.2.1 GO注釋分析結果 對差異表達基因進行GO功能注釋分析（圖2，見封三），結果顯示，上調和下調差異基因在細胞組分中均主要集中在膜部分和細胞部分，在分子功能中均主要集中在結合和催化過程，在生物過程中均主要集中在代謝過程和細胞過程。

2.2.2 GO富集分析結果 對差異基因進行GO功能富集分析（圖3），結果顯示，在P≤0.05條件下，只有上調差異基因顯著富集。差異上調基因主要注釋在氧化還原相關過程、呼吸和能量傳遞中。

2.3 KEGG功能分類及富集

2.3.1 KEGG注釋分析結果 對差異表達基因進行KEGG功能注釋分析（圖4，見封三），結果顯示，差異基因主要集中在能量代謝、免疫、環(huán)境適應和信號轉導等相關通路中。

2.3.2 KEGG富集結果 對差異表達基因進行KEGG功能富集分析（圖5），結果顯示，差異基因主要富集在能量代謝、免疫和神經(jīng)傳遞相關通路中。能量代謝包括化學致癌作用-活性氧、氧化磷酸化和產(chǎn)熱。免疫包括VEGF信號通路、趨化因子信號通路、白細胞跨內皮遷移、胃癌、子宮內膜癌和細菌對上皮細胞的侵襲、糖尿病性心肌病、亨廷頓病、帕金森病、朊病毒病、肌萎縮側索硬化癥、阿爾茲海默癥、神經(jīng)退行性疾病的途徑 - 多種疾病和非酒精性脂肪肝病。神經(jīng)傳遞包括逆行內源性大麻素信號傳導、軸突導向和神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路。

2.4 熒光定量PCR驗證結果

為了驗證轉錄組測序的準確性，采用熒光定量PCR技術隨機檢測了6個基因的mRNA表達，結果見圖 6。結果表明，熒光定量PCR與轉錄組測序的皮爾遜相關系數(shù)為0.840，說明轉錄組測序結果相對可靠。

3 討論

目前，在水生生物的研究中，轉錄組經(jīng)常被用作研究手段。Yu等[11]采用轉錄組學技術分析了飼料中添加硒可緩解低鹽脅迫下南美白對蝦的作用機制。Luo等[12]采用轉錄組學技術分析了高脂低蛋白飼料中添加左旋肉堿對鯉魚脂肪和蛋白質代謝的調控作用及分子機制。Jiang等[13]基于轉錄組分析技術探究產(chǎn)梭菌蛋白代替魚粉對南美白對蝦肝胰腺轉錄組的影響。Li等[14]采用轉錄組學技術分析飼料中添加褪黑激素對南美白對蝦肝胰腺轉錄組的影響，推測出褪黑激素對南美白對蝦抗氧化和免疫功能影響的分子機制。 不同飼料喂養(yǎng)下皺紋盤鮑肝胰腺轉錄組分析結果表明在循環(huán)水工廠化養(yǎng)殖中，人工飼料比天然飼料更能促進皺紋盤鮑生長[15]。因此，本研究選擇采用克氏原螯蝦肝胰腺進行轉錄組學測序進行研究。肝臟主要參與水生動物的營養(yǎng)代謝和調節(jié)，并在免疫功能中起重要作用，肝胰腺是甲殼類動物重要的消化代謝和內分泌器官[16]。因此，本研究采用克氏原螯蝦的肝胰腺進行轉錄組分析來探究飼料中添加3‰雨生紅球藻對克氏原螯蝦機體生理變化的調控機制。

在本研究中，差異表達上調基因顯著富集在化學致癌作用-活性氧、氧化磷酸化和產(chǎn)熱通路中?；钚匝酰≧OS）是線粒體氧化磷酸化的副產(chǎn)物，對細胞存活、增殖、損傷和衰老至關重要，而產(chǎn)熱是線粒體氧化磷酸化的必然結果[17-18]。研究表明，ROS水平超過細胞抗氧化防御系統(tǒng)的能力會誘發(fā)氧化應激，但氧化應激本身并不是壞事[19]。例如吞噬細胞中含有病原體的吞噬體中氧化應激的產(chǎn)生是抗菌免疫的重要組成部分。Sheu等[20]發(fā)現(xiàn)巨噬細胞通常是最先遇到入侵病原體的免疫細胞，它們通過吞噬作用吞噬病原體、死細胞和細胞碎片，隨后降解吞噬溶酶體中的物質。巨噬細胞對細菌的識別會導致ROS大量產(chǎn)生并發(fā)揮不同的抗菌功能[21]。弓形蟲是水生生物易感染的一種寄生蟲， Park等[22]研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細胞在針對這種病原體的免疫防御中起著核心作用，即ROS的大量產(chǎn)生有助于增強生物體對弓形蟲的抵抗。線粒體來源的活性氧（mtROS）的殺菌活性直接有助于殺死吞噬細胞的細菌[23]。線粒體會誘導鼠傷寒沙門氏菌感染斑馬魚巨噬細胞產(chǎn)生基質mtROS促進鼠傷寒沙門氏菌的失活[24]。斑馬魚結核病模型中，過量的TNF誘導感染巨噬細胞中mtROS形成，有助于在吞噬過程中殺死細菌[25]。

線粒體氧化磷酸化提供了需氧生物90%以上的能量，線粒體的主要細胞功能是通過三羧酸循環(huán)和氧化磷酸化途徑中代謝產(chǎn)物的氧化產(chǎn)生ATP[26]。在這個過程中，NADH和FADH2作為復合物 I（NADH：泛醌氧化還原酶）和復合物II（琥珀酸脫氫酶）的電子供體發(fā)揮作用，它們通過復合物III（泛醇細胞色素c還原酶）轉運到復合物IV（細胞色素c氧化酶），其中分子氧充當線粒體呼吸鏈的最終電子受體。這種電子傳遞產(chǎn)生穿過線粒體內膜的質子梯度，與復合物V（ATP 合酶）偶聯(lián)，將ADP轉化為ATP[27]。水生生物面對脅迫條件時需要消耗大量的能量來緩解脅迫條件對機體產(chǎn)生的壓力[28]。研究表明，產(chǎn)熱和氧化磷酸化是冷脅迫下黃顙魚產(chǎn)生能量的主要生物過程，產(chǎn)生的能量用以維持機體的代謝穩(wěn)態(tài)[29]。胡成楓[30]發(fā)現(xiàn)斑馬魚細胞會通過促進機體適應性產(chǎn)熱以適應低溫環(huán)境造成的影響。南美白對蝦和日本沼蝦在面對冷應激時氧化磷酸化和產(chǎn)熱通路也被顯著激活，釋放大量能量來抵御外界環(huán)境的變化[31-32]。這與我們的研究結果一致。綜上所述，飼料中添加3‰的雨生紅球藻可能有助于克氏原螯蝦提高抵抗細菌、病原體和外界環(huán)境變化的能力。

本研究也富集到許多與疾病相關的通路，包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病和癌癥等，說明添加雨生紅球藻可以影響與疾病相關的免疫調節(jié)。

4 結論

通過對飼料中添加3‰的雨生紅球藻對克氏原螯蝦肝胰腺基因表達的影響進行分析，結果表明飼料中添加3‰的雨生紅球藻可能有助于克氏原螯蝦提高抵抗外界不良影響的能力。該研究將有助于為水產(chǎn)養(yǎng)殖飼料中添加雨生紅球藻作為飼料添加劑的使用提供參考。

參考文獻：

[1]

田貴云， 姜虎成， 孫夢玲，等. 噻蟲嗪暴露對克氏原螯蝦的病理損傷和生化反應的影響[J]. 水產(chǎn)養(yǎng)殖， 2023， 44 （10）： 18-22+54.

[2] 吳樂， 李嘉堯， 周文宗，等. 氨氮短期脅迫與恢復對克氏原螯蝦的影響 [J/OL].? 水產(chǎn)科學，? 1-14[2024-03-01].https：//doi.org/10.16378/j.cnki.1003-1111.23038.

[3] 于秀娟， 郝向舉， 楊霖坤， 等. 中國小龍蝦產(chǎn)業(yè)發(fā)展報告（2023）[J]. 中國水產(chǎn)，? 2023（7）： 26-31.

[4] 王裕玉， 宋慶輝， 賈晶，等. 雨生紅球藻的營養(yǎng)價值及其在魚類飼料中的應用[J]. 飼料研究， 2023， 46（17）： 167-172.

[5] 陳果， 王磊， 吳旭干，等. 投喂雨生紅球藻蝦青素條件下的虹鱒血清代謝組學研究[J]. 基因組學與應用生物學， 2023， 42（11）： 1189-1202.

[6] 李玥睿， 高金偉， 張文慧，等. 蛋白核小球藻粉和雨生紅球藻粉對中華絨螯蟹幼蟹生長和生理生化指標的影響[J]. 飼料研究， 2022， 45（20）： 49-54.

[7] 虞為， 陳雪晴， 楊育凱，等. 飼料中添加雨生紅球藻對尖吻鱸生長性能、抗氧化能力及免疫狀態(tài)的影響[J].? 南方水產(chǎn)科學， 2022， 18（5）： 46-54.

[8] 樊玉文， 張木子， 黎明， 等. 飼料中添加雨生紅球藻對黃顙魚生長、抗氧化酶活性、免疫應答及氨氮耐受的影響[J]. 水產(chǎn)學報，2022， 46（11）： 2168-2176.

[9] 惠文杰. 雨生紅球藻對克氏原螯蝦生長、體色、抗氧化及肝腸組織的影響[D]. 長沙：湖南農(nóng)業(yè)大學， 2023.

[10] AN Z， ZHANG Y， SUN L. Effects of dietary astaxanthin supplementation on energy budget and bioaccumulation in Procambarus clarkii （Girard， 1852） crayfish under microcystin-LR stress[J].Toxins （Basel）. 2018，10（7）：277.

[11] YU Q， HAN F， ROMBENSO A， et al. Dietary selenium supplementation alleviates low salinity stress in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei：? growth，? antioxidative capacity and hepatopancreas transcriptomic responses[J]. Br J Nutr， 2023， 130（6）： 933-943.

[12] LUO W， CHEN P， ZHANG X， et al. Effect of adding L-carnitine to high-fat/low-protein diets of common carp （Cyprinus carpio） and the mechanism of regulation of fat and protein metabolism[J]. Aquac Nutr， 2022： 3768368.

[13] JIANG X， YAO W， YANG H， et al. Dietary effects of Clostridium autoethanogenum protein substituting fish meal on growth， intestinal histology and immunity of Pacific white shrimp （Litopenaeus vannamei） based on transcriptome analysis[J]. Fish Shellfish Immunol， 2021， 119： 635-644.

[14] LI Y， YANG Y， LI S， et al. Effects of dietary melatonin on antioxidant and immune function of the Pacific white shrimp （Litopenaeus vannamei）， as determined by transcriptomic analysis[J]. Comp Biochem Physiol Part D Genomics Proteomics， 2023， 48： 101146.

[15] 梁爽， 梁健， 李永仁， 等. 不同飼料對皺紋盤鮑肝胰腺轉錄組的影響研究[J]. 飼料研究， 2023， 46（20）： 52-56.

[16] 鄭亮， 謝熙， 鄭宏坤， 等. 三疣梭子蟹JHEH基因的克隆及表達分析[J].? 華北農(nóng)學報， 2020， 35（6）： 225-234.

[17] 張立秋， 李成華， 姜麗， 等.?? 衰老假說與活性氧研究[J].生理科學進展， 2020， 51（5）： 327-331.

[18] 高蕓， 徐美雪， 于太永，等.? N-油酰（基）甘氨酸與油酸對線粒體UCP1非依賴產(chǎn)熱的影響[J].? 中國生物化學與分子生物學報， 2021， 37（11）： 1482-1488.

[19] DAN D J， ALVAREZ LA， ZHANG X.? Reactive oxygen species and mitochondria： A nexus of cellular homeostasis[J]. Redox Biol.? 2015， 6： 472-485.

[20] SHEU K M，? HOFFMANN A.?? Functional hallmarks of healthy macrophage responses：? Their regulatory basis and disease relevance[J].?? Annu Rev Immunol.?? 2022，? 40： 295-321.

[21] HERB M，? SCHRAMM M.?? Functions of ROS in macrophages and antimicrobial immunity[J].?? Antioxidants （Basel），? 2021，? 10（2）： 313.

[22] PARK J，? HUNTER C A.?? The role of macrophages in protective and pathological responses to Toxoplasma gondii[J].?? Parasite Immunol，? 2020，? 42（7）： e12712.

[23] FERNANDEZ-BOYANAPALLI R F，? FRASCH S C，? THOMAS S M，? et al.?? Pioglitazone restores phagocyte mitochondrial oxidants and bactericidal capacity in chronic granulomatous disease[J].?? J Allergy Clin Immunol，? 2015，? 135（2）： 517-527.

[24] DO AMARALl M A，? PAREDES L C，? PADOVANI B N，? et al.?? Mitochondrial connections with immune system in Zebrafish[J].?? Fish Shellfish Immunol. Rep，? 2021，? 2： 100019.

[25] ROCA F J，? RAMAKRISHNAN L.?? TNF dually mediates resistance and susceptibility to mycobacteria via mitochondrial reactive oxygen species[J].?? Cell，? 2013，? 153（3）： 521-534.

[26] BERMEJO-NOGALES A，? CALDUCH-GINER J A，? PEREZ-SANCHEZ J.?? Unraveling the molecular signatures of oxidative phosphorylation to cope with the nutritionally changing metabolic capabilities of liver and muscle tissues in farmed fish[J]. ??PLoS One.?? 2015，? 10（4）： e0122889.

[27] RICQUIER D.?? Fundamental mechanisms of thermogenesis[J].?? C R Biol，? 2006，? 329（8）： 578-586.

[28] 豐超杰， 劉霞飛， 張穎， 等.?? 高溫脅迫下黑龍江茴魚幼魚肝臟組織結構變化及轉錄組表達特征[J].?? 大連海洋大學學報， 2023， 38（4）： 603-614.

[29] HU J，? ZHAO H，? WANG G，? et al.?? Energy consumption and intestinal microbiome disorders of yellow catfish （Pelteobagrus fulvidraco） under cold stress[J].?? Front Physiol，? 2022，? 13： 985046.

[30] 胡成楓.?? PGC-1α在斑馬魚細胞冷應激過程中的功能探究[D].?? 上海：? 上海海洋大學，? 2017： 37.

[31] FAN L，? WANG L，? WANG Z.?? Proteomic characterization of the hepatopancreas in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei under cold stress：? Revealing the organism homeostasis mechanism[J].?? Fish Shellfish Immunol，? 2019，? 92： 438-449.

[32] JIN S，? HU Y，? FU H，? et al.?? Analysis of testis metabolome and transcriptome from the oriental river prawn （Macrobrachium nipponense） in response to different temperatures and illumination times [J].?? Comp Biochem Physiol Part D Genomics Proteomics，? 2020，? 34： 100662.

The impact of Haematococcus pluvialis on hepatopancreas gene expression in Procambarus clarkii investigated through comparative transcriptome sequencing analysis

ZHOU Yueqi1， HUANG Chunhong2， LIU Yuyuan1， YI Yi1

（1. Guangxi University of Science and Technology， Liuzhou 545000， China; 2. Liujiang District Agricultural and Rural Comprehensive Development Service Center， Liuzhou 545000， China）

Abstract：To investigate the impact of Haematococcus pluvialis supplementation on hepatopancreas gene expression in Procambarus clarkii， commercial feed for Procambarus clarkii was used as the base diet and supplemented with Haematococcus pluvialis at a concentration of 3‰. The experimental group was fed with modified diet for 45 days， and RNA-seq technology was employed to analyze the transcriptome data from the hepatopancreas. A total of 44.61 Gb clean sequencing data were obtained， with over 92.46% Q30 bases. Through transcriptome sequencing analysis using screening criteria （FDR≤0.05 and |log2FC|≥3）， we identified 895 differentially expressed genes. GO functional enrichment analysis revealed that these differentially expressed genes were primarily associated with energy metabolism pathways. KEGG pathway enrichment analysis demonstrated significant enrichment of differential genes in energy metabolism， immunity， and neurotransmission-related pathways. In conclusion， supplementing Procambarus clarkii's diet with 3‰ Haematococcus pluvialis may enhance its resistance against pathogens and environmental changes externally imposed upon it.

Key words：Haematococcus pluvialis; Procambarus clarkii; transcriptome

（收稿日期：2024-01-29）