MiR-31促進(jìn)人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和遷移

王佳微, 曹利利, 丁雪婷, 田 峰*, 王春芳*

(1)山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院, 太原 030012;2)口腔疾病防治與新材料山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 太原 030012;3)山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心, 太原 030012)

牙髓炎是由牙髓組織的細(xì)菌感染引起的一種炎癥性疾病,目前主要的治療方法是根管治療,即去除感染的牙髓組織,對(duì)根管髓腔進(jìn)行完備的預(yù)備消毒后用生物材料進(jìn)行嚴(yán)密的充填,目前,我國(guó)每年有超過(guò)1 400萬(wàn)例根管治療手術(shù)。然而在根管治療后,牙齒失去了對(duì)牙齒硬組織的營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充、對(duì)冷熱刺激的敏感反應(yīng)以及抵御繼發(fā)感染的能力,因此,發(fā)現(xiàn)新的對(duì)牙髓炎有效且副作用小的治療方法十分必要,也是迫切的[1, 2]。在2001年,Iwaya等[3]首次提出了牙髓血運(yùn)重建的概念,在此基礎(chǔ)上將其發(fā)展成一種全新的、具有極高治療效果的牙髓再生技術(shù),其中牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞(dental pulp stem cells, DPSCs)作為牙髓再生的一種可行的細(xì)胞來(lái)源,逐漸進(jìn)入人們的視野并受到越來(lái)越多的關(guān)注[4]。Gronthos 等在2000年,首次分離出DPSCs,并且鑒于其易于獲取、無(wú)倫理問(wèn)題且增殖能力快等特性而受到了廣泛關(guān)注[5-7]。DPSCs是牙髓組織再生最重要的干細(xì)胞來(lái)源,其起源于顱神經(jīng)嵴譜系,并在牙髓血管的周邊,以自我更新,多譜系分化為特征,能分化成軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞及神經(jīng)外胚層細(xì)胞,這一研究結(jié)果對(duì)人類健康具有重要支撐作用,給我們帶來(lái)更大可能[8]。更重要的是,它們?cè)诋愺w移植中可能不會(huì)引起免疫反應(yīng),因其是非免疫原性的,具有很強(qiáng)的免疫抑制特性,可以作為牙髓組織再生的主要干細(xì)胞來(lái)源[9, 10]。為明確牙髓干細(xì)胞在根管移植中的作用機(jī)制及方法,已開(kāi)展大量的研究工作,包括細(xì)胞水平的研究和動(dòng)物研究[11, 12]。盡管DPSCs 為解決牙髓疾病提供了新的手術(shù)方法,但是干細(xì)胞的移植仍有缺點(diǎn),例如細(xì)胞不能有效匯聚到病變區(qū)域,定植在損傷區(qū)的細(xì)胞存活時(shí)間短和存活率低,使細(xì)胞治療的效果大打折扣[13]。

微RNA(microRNAs, miRNAs)為21～24個(gè)核苷酸的內(nèi)源性小RNA,它們既能調(diào)控生物體生理機(jī)制,也能促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育,因而在生物學(xué)、病理學(xué)領(lǐng)域中扮演了重要的角色[14]。近年的研究表明,miRNAs不僅參與調(diào)控干細(xì)胞相關(guān)調(diào)節(jié)因子,還與干細(xì)胞增殖、遷移、分化等多種功能的運(yùn)轉(zhuǎn)有著密切的聯(lián)系[15, 16]。微核糖核酸31(microRNA-31, miR-31)屬于miRNAs家族的一種高度保守的miRNAs,近年的研究表明,miR-31可以調(diào)控細(xì)胞的功能對(duì)細(xì)胞表型產(chǎn)生潛在影響,例如,miR-31通過(guò)直接靶向RAS p21蛋白激活因子1(RAS P21 protein activator 1, RASA1)、SProuty 相關(guān)EVH1 域含蛋白 1(SProuty-related EVH1 domain-containing protein 1, Spred1)、SProuty 相關(guān)EVH1 域含蛋白 2(SProuty-related EVH1 domain-containing protein 2,Spred2)和RTK 通路特異性抑制因子(sprouty4, Spry4)來(lái)激活Ras 蛋白(rat sarcoma, Ras)/絲裂原活化蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號(hào)傳導(dǎo), 促進(jìn)表皮角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖和遷移,從而促進(jìn)皮膚傷口的愈合[17]。MiR-31還是人精原干細(xì)胞的主要生物學(xué)調(diào)節(jié)劑,經(jīng)P21活化激酶1(p21-activated kinase 1, Pak1)-鋅指并列基因 1 (juxtaposed with another zinc finger gene 1, JAZF1)-細(xì)胞周期蛋白A2(cyclinA2, CCNA2)途徑增殖人精原干細(xì)胞、調(diào)節(jié)DNA合成與凋亡[18]。MiR-31在癌癥治療中也發(fā)揮著重要作用,它能夠抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)、擴(kuò)散和侵襲,而且對(duì)化療有敏感性[19]。因此,可將miR-31機(jī)制歸納為靶向關(guān)鍵信號(hào)通路,調(diào)節(jié)相應(yīng)細(xì)胞的增殖和遷移,最終有利于損傷組織的修復(fù)。以上研究揭示了,miR-31對(duì)細(xì)胞功能的影響。同時(shí),Michon等[20]在研究miRNA芯片技術(shù)時(shí)發(fā)現(xiàn),miR-31在牙胚形成階段具有重要作用。然而,miR-31在DPSCs生物學(xué)過(guò)程中是否也具有相同作用,目前仍未見(jiàn)到相關(guān)的研究,因此,本文研究了miR-31對(duì)細(xì)胞增殖和遷移的影響,希望為DPSCs更好的應(yīng)用于牙髓再生提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

流式細(xì)胞儀(安捷倫ACEC, 美國(guó));DMEM高糖培養(yǎng)基(Gibco, 美國(guó));胎牛血清(Biological Industries,比利時(shí));CD90,CD75,CD34(博士德,中國(guó));酶標(biāo)儀(Thermo scientific, 美國(guó));高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad,美國(guó));實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(Thermo Fisher Scientific, 美國(guó));Hoechst(Sigma, 美國(guó));增強(qiáng)型RIPA裂解液,蛋白酶抑制劑PMSF,BCA試劑盒(博士德,中國(guó));脫脂奶粉(Cell signaling Technology);Ki67,PCNA ,MMP-2 ,CXCR4,GAPDH抗體(博士德,中國(guó));INTERFERin?轉(zhuǎn)染試劑(Polyplus, 法國(guó));miR-31agomir和antagomir(銳博生物科技,中國(guó));4%多聚甲醛,CCK-8,0.1%結(jié)晶紫(索萊寶,中國(guó));RNA 裂解液,Mir-X First-Strand Synthesis Kit,TB Green Premix Ex Taq II試劑盒,Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit(Takara, 日本)。

1.2 倫理問(wèn)題

本實(shí)驗(yàn)所需要的牙收集于山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院,并與患者簽署了相關(guān)知情同意書,且已通過(guò)山西醫(yī)科大學(xué)口腔醫(yī)院倫理委員會(huì)的嚴(yán)格審查(2022SJL32)。

1.3 牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的提取和培養(yǎng)

健康牙取自18～22歲患者完整的第三磨牙或者因正畸而需要拔除的牙齒,炎癥牙取自因牙髓炎而需要拔除的牙齒。用錘子劈開(kāi)取新鮮牙髓,將組織剪碎并加入濃度為3 mg/mL I型膠原酶消化,消化45 min。把組織塊置于T25培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),各組織塊之間大致相距0.5～1 cm,加入1～2 mL完全培養(yǎng)基。待細(xì)胞融合率到達(dá)80%后使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板將消化下來(lái)的細(xì)胞根據(jù)1～2個(gè)每孔的密度接種到96孔板中,鏡下選擇長(zhǎng)勢(shì)好、克隆形成能力較強(qiáng)的細(xì)胞,用于孔板標(biāo)記,當(dāng)細(xì)胞匯合到80%時(shí),穩(wěn)定傳代。

1.4 鑒定牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)志物,并繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

取P3代細(xì)胞,消化離心后棄上清,調(diào)節(jié)密度至1×106個(gè)/mL;將其分別標(biāo)記為對(duì)照組、分化簇90(cluster of differentiation 90,CD90)、分化簇73(cluster of differentiation 73,CD73)、分化簇34(cluster of differentiation 34,CD34)和分化簇45(cluster of differentiation 45,CD45),向各管加入100 μL細(xì)胞懸液,2.5 μL PBS和抗體;4 ℃避免光照30 min,離心棄上清,1 mL PBS濾膜濾除細(xì)胞團(tuán),用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。生長(zhǎng)曲線:P3代細(xì)胞消化后調(diào)整密度到5×104/mL,接種于12孔板。置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中,從第1 d到第10 d,每日取3孔消化,離心,重懸和測(cè)定,最后取其平均值,將測(cè)量時(shí)間作為橫坐標(biāo)軸,細(xì)胞的數(shù)目為縱坐標(biāo)軸。

1.5 RT-qPCR 檢測(cè)組織和轉(zhuǎn)染后miR-31水平的表達(dá)

每個(gè)孔加1 mL Trizol充分裂解,靜置 5 min后每管加入200 μL氯仿,13 000 r/min離心 15 min;隨后加入500 μL異丙醇,離心后將上層水相轉(zhuǎn)移到該新的 EP管中;酒精沉淀10 min,離心去除上清液;75% 乙醇洗滌 RNA 沉淀,離心后去上清并風(fēng)干RNA 沉淀 5～10 min;將RNA溶解在30 μL DEPC水中后按體系加樣并反轉(zhuǎn)錄為cDNA;使用TBGreen試劑盒在實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)上進(jìn)行定量分析,其中以U6作為內(nèi)參(引物序列見(jiàn)Table 1)。

Table 1 Primer sequence

1.6 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和分組

將細(xì)胞以1×105細(xì)胞/孔的數(shù)量接種于6孔板;用200 μL/孔的無(wú)血清DMEM稀釋5 μL /孔的miR-31 agomir、miR-31 antagomir和NC于EP管中混勻,后將4 μL 的INTERFERin?轉(zhuǎn)染試劑加入3個(gè)EP管中并靜置10 min;最后將129 μL/孔轉(zhuǎn)染復(fù)合物加入到六孔板的細(xì)胞中,放入培養(yǎng)箱4～6 h后更換培養(yǎng)基。

1.7 CCK-8檢測(cè)miR-31對(duì)牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞增殖的影響

將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞分別接種于96孔板上,并分別在24 h、48 h、72 h和96 h時(shí)棄舊培養(yǎng)基,加入100 μL10% CCK-8溶液和90% DMEM培養(yǎng)基的混勻液,培養(yǎng)2 h后通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)定長(zhǎng)度為450 nm的吸光度值。

1.8 Transwell檢測(cè)miR-31對(duì)牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞垂直方向遷移的影響

轉(zhuǎn)染后消化計(jì)數(shù);把Transwell培養(yǎng)小室放入24孔板中,分3組,各組復(fù)孔3個(gè),小室下層加入600 μL含有20%胎牛血清的培養(yǎng)液,小室內(nèi)添加200 μL單細(xì)胞懸液,其中含有3×104個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)24 h;取出小室,甲醛15 min固定,用0.1%結(jié)晶紫染料20 min,PBS進(jìn)行兩次洗滌后拍照。

1.9 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-31對(duì)牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞水平方向遷移的影響

用標(biāo)記筆在6孔板后面約每0.5～1 cm畫一道線,在每個(gè)孔內(nèi)種5×105個(gè)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞;用PBS洗細(xì)胞3次,添加無(wú)血清培養(yǎng)基;置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng),按照0 h與24 h的時(shí)間拍攝照片,并利用Image J進(jìn)行影像分析。

1.10 Western 印跡檢測(cè)增殖蛋白質(zhì)和遷移蛋白質(zhì)的表達(dá)

取適量裂解液并添加蛋白酶抑制劑,將裂解液加入轉(zhuǎn)染后的DPSCs,使細(xì)胞充分裂解后將裂解液移入離心管,10 000 g離心10 min,取上清,BCA法測(cè)蛋白質(zhì)濃度。SDS-PAGE凝膠電泳后,將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,用TBST 洗膜后5%BSA封閉1.5 h,一抗孵育過(guò)夜(Ki67抗體稀釋比例1∶1 500;PCNA抗體稀釋比例1∶3 000 ;CXCR4抗體稀釋比例1∶2 000;MMP2抗體稀釋比例1∶1 000;內(nèi)參GAPDH抗體稀釋比例1∶1 500)。孵育結(jié)束后TBST洗膜,之后孵育二抗2 h(HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG,稀釋比例1∶5 000),孵育結(jié)束TBST洗膜,ECL顯影,并用Image J軟件對(duì)條帶進(jìn)行分析。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用IBM SPSS Statistics 26軟件統(tǒng)計(jì)分析,并使用 GraphPad Prism 5.0軟件繪制柱狀圖。多組間比較運(yùn)用單因素方差分析(one-way ANOVA),以P<0. 05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)

通過(guò)組織塊酶消化法從牙髓組織中提取DPSCs(提取過(guò)程大致如Fig.1A所示)。在第10～11 d,通過(guò)倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn), 少量原代細(xì)胞從組織塊邊緣爬出,隨后,細(xì)胞以輻射狀向周圍游離,貼壁生長(zhǎng),形態(tài)呈長(zhǎng)梭形,即纖維細(xì)胞樣 (Fig.2A)。經(jīng)過(guò)傳代培養(yǎng)后DPSCs 在體外大量擴(kuò)增,傳代培養(yǎng)后細(xì)胞為長(zhǎng)梭形 (Fig.2B-C)。

Fig.1 Experimental flow diagram (A) DPSC extraction diagram: we first split the isolated tooth to extract the pulp, then wait for the cells to crawl out from the edge of the tissue block following enzyme digestion, and purify by the limited dilution method after reaching a certain fusion rate. (B) CCK8 experiment diagram: A mixture of 10% CCK-8 solution and 90% DMEM medium was prepared, and the absorbance value of 450 nm was measured using an enzyme-labeled instrument after 2 hours of culture. (C) Cell transfection diagram: A mixture of miR-31 agomir/antagomir and transfection reagents was applied to pre-planted cells, and the cells were left for 24 hours before further studies. (D) Transwell diagram: the transfected cells were implanted into the upper chamber of the Transwell chamber, fixed with paraformaldehyde 24 hours later, and the cells passing through the polycarbonate membrane were stained with crystal violet, observed, and counted under an inverted phase contrast microscope

Fig.2 Isolation and culture of DPSCs in vitro (A) The image showed cells climbing out of the optical microscope from the tissue block edge (×100). Scale bar = 250 μm. (B) The second generation of DPSCs (×40). Scale bar = 500 μm. (C) The second generation of DPSCs (×100), cell morphology of the spindle was shown. Scale bar = 250 μm

2.2 體外培養(yǎng)的牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

取第3代細(xì)胞采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面特異性標(biāo)志物,得到的結(jié)果表明,其高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物CD90(99.2%)和CD73(99.0%),而造血干細(xì)胞表面標(biāo)記CD34(0.09%)和CD44(0.19%)均未表達(dá)(Fig.3A)。此外,DPSCs免疫熒光鑒定結(jié)果顯示,間充質(zhì)干細(xì)胞的表面標(biāo)志物STRO-1陽(yáng)性表達(dá)97.8%(Fig.3B-C)。以上結(jié)果均表明,已成功提取培養(yǎng)DPSCs。為了進(jìn)一步了解其生長(zhǎng)狀況,本文繪制了其生長(zhǎng)曲線,呈典型“S”形,在接種后1～2 d內(nèi),細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢,處于停滯期,從第2 d開(kāi)始,增長(zhǎng)速率變得異常迅速,增長(zhǎng)曲線急劇向上,進(jìn)入對(duì)數(shù)增殖期,第8 d,細(xì)胞總量達(dá)到了相當(dāng)大的水平,隨時(shí)間的延長(zhǎng)增長(zhǎng)曲線又出現(xiàn)了平線(Fig.3D)。這表明,所培養(yǎng)DPSCs具有良好的生長(zhǎng)狀態(tài),并取對(duì)數(shù)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

2.3 炎癥牙來(lái)源的牙髓組織和 牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞中miR-31的表達(dá)水平較正常組顯著下降

通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),炎癥牙來(lái)源的牙髓組織和DPSCs中miR-31的表達(dá)大約為健康牙的1/2,結(jié)論具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,Fig.4),這提示炎癥環(huán)境下miR-31的表達(dá)降低,可能對(duì)牙周組織功能有不利影響。

Fig.4 Expression levels of miR-31 in dental pulp tissues and DPSCs from inflammatory and normal teeth (A) Samples of normal extracted teeth and teeth with pulpitis were collected from the clinic. (B) The relative expression level of miR-31 in the pulp tissue and DPSCs of normal and inflammatory teeth was detected by RT-qPCR (Mean ± SD, n=3 ). #P<0.05: pulpitis tissue compared with the control group;*P<0.05: inflammatory DPSCs compared with the control group

2.4 miR-31轉(zhuǎn)染牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞

為進(jìn)一步觀察miR-31對(duì)細(xì)胞的影響,本文定制了高親和力膽固醇修飾miR-31agomir和miR-31antagomir,且在Cy3熒光標(biāo)記下表現(xiàn)出了良好的穩(wěn)定性。用其轉(zhuǎn)染細(xì)胞后(轉(zhuǎn)染過(guò)程正如Fig.1C),直接在熒光顯微鏡下觀察到其發(fā)出紅色熒光,進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn),miR-31 agomir組和miR-31 antagomir組轉(zhuǎn)染效率均大于90%(Fig.5A-B)。為進(jìn)一步探討miR-31 agomir和miR-31 antagomir是否作用于細(xì)胞,本文通過(guò)RT-qPCR加以證實(shí)。結(jié)果顯示:細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,miR-31agomir組miR-31的表達(dá)是對(duì)照組的20倍(P<0.001),而miR-31antagomir組miR-31的表達(dá)是對(duì)照組的0.2倍(Fig.5C),進(jìn)一步說(shuō)明轉(zhuǎn)染成功。

Fig.5 MiR-31 was successfully transfected into DPSCs Immunofluorescence and PCR were used to confirm the transfection of miR-31 into DPSCs further. (A) The status of miR-31agomir and miR-31antagomir transfection was evaluated by immunofluorescence, with red fluorescence indicating successful transfection. Scale bar = 250 μm. (B) Statistics of the results of miR-31agomir and miR-31 antagomir transfection efficiency. (C) The relative expression level of miR-31 in the control group, miR-31 agomir group, and miR-31 antagomir group after transfection was detected by RT-qPCR (Mean ± SD, n = 3). ***P<0.001

2.5 miR-31促進(jìn)牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖

為探討miR-31在DPSCs增殖過(guò)程中的作用,本文在轉(zhuǎn)染后,進(jìn)行了CCK-8的檢測(cè)(CCK-8過(guò)程,大致如Fig.1B)。結(jié)果表明,與對(duì)照組相比,兩組的增殖能力在24 h時(shí)已出現(xiàn)差異,且在72 h時(shí)miR-31agomir組的DPSCs增殖能力相較于其他時(shí)間段顯著優(yōu)于NC組(P<0.01)。除此之外,miR-31antagomir組對(duì)DPSCs增殖的抑制作用也顯著優(yōu)于其他時(shí)間段(P<0.001),表明miR-31能夠有效促進(jìn)細(xì)胞增殖(Fig.6) 。

Fig.6 MiR-31 promoted the proliferation of DPSCs in different time periods After transfecting DPSCs with miR-31, the effect of miR-31 on cell proliferation was detected with the CCK-8 experiment. The absorbance values of the control group, miR-31 agomir group, and miR-31 antagomir group at 450 nm were compared at 24, 48, 72, and 96 hours, respectively (Mean ± SD, n=3 ).*P< 0.05,**P<0.01,***P< 0.001

2.6 miR-31促進(jìn)牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞的遷移

通過(guò)CCK8檢測(cè)發(fā)現(xiàn),miR-31具有促進(jìn)DPSCs增殖的功能。那么其遷移是否受到影響呢?本文進(jìn)行了劃痕和Transwell實(shí)驗(yàn),以分別探討轉(zhuǎn)染后miR-31在細(xì)胞水平遷移和垂直遷移中的作用。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,在24 h時(shí)miR-31agomir組的無(wú)細(xì)胞區(qū)域顯著小于NC組,(P<0.05),但miR-31antagomir組和NC組細(xì)胞的無(wú)細(xì)胞區(qū)域差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05,Fig.7A-B),表明過(guò)表達(dá)miR-31對(duì)細(xì)胞水平方向的遷移能力有明顯的促進(jìn)作用。為進(jìn)一步探索和研究miR-31在細(xì)胞垂直遷移中的作用,本文進(jìn)行了Transwell實(shí)驗(yàn),將轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞接種到上室,培養(yǎng)24 h后統(tǒng)計(jì)遷移至下室的細(xì)胞數(shù)量(Transwell實(shí)驗(yàn)過(guò)程大致如Fig.1D),結(jié)果表明,miR-31agomir組穿過(guò)Transwell小室的數(shù)目顯著高于NC組(P<0.001),miR-31antagomir組穿過(guò)Transwell小室的數(shù)目顯著性低于NC組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,Fig.7C-D)。以上結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)miR-31能明顯增強(qiáng)細(xì)胞水平和垂直方向遷移能力。

Fig.7 MiR-31 promotes the vertical and horizontal migration of DPSCs After transfecting DPSCs with miR-31, the effects of miR-31 on horizontal and vertical migration of DPSCS were detected by wound-healing assay and Transwell assay. (A, B) The cell-free regions of the control group, miR-31agomir group, and miR-31antagomir group were compared at 0 and 24 hours (Mean ± SD, n=3). Scale bar =250 μm. (C, D) The number of cells migrating to the lower chamber of the control group, miR-31 agomir group, and miR-31 antagomir group was calculated at 24 hours (Mean ± SD, n=3). Scale bar =125 μm.*P< 0.05,**P< 0.01,***P<0.001

2.7 miR-31上調(diào)增殖蛋白質(zhì)和遷移蛋白質(zhì)的表達(dá)水平

為了深入研究miR-31是否影響DPSCs增殖、遷移相關(guān)蛋白質(zhì)的表達(dá),本文檢測(cè)了其關(guān)鍵蛋白質(zhì)水平。Western印跡檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,miR-31agomir組Ki67和PCNA的蛋白質(zhì)水平顯著升高(P<0.01),而miR-31antagomir組Ki67和PCNA的蛋白質(zhì)水平顯著降低(P<0.01,Fig.8A-C)。此外,miR-31agomir組CXCR4和MMP2蛋白質(zhì)水平較對(duì)照組顯著升高(P<0.05),miR-31antagomir組CXCR4和MMP2的蛋白質(zhì)水平顯著降低(P<0.05,Fig.8A,D-E)。結(jié)果表明,miR-31不僅在表型上促進(jìn)了DPSCs的增殖遷移,在分子層面上其也有效促進(jìn)了細(xì)胞增殖和遷移相關(guān)的蛋白質(zhì)水平。

Fig.8 MiR-31 up-regulates the expression levels of key proliferation proteins Ki67, PCNA, and key migration proteins MMP-2 and CXCR4 (A) The Western blot method was used to determine the relative level of Ki67, PCNA, CXCR4, and MMP-2 in each group. (B-E) Semi-quantitative analysis of relevant protein levels in A, quantified and standardized to GAPDH (Mean ± SD, n= 3) .*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

3 討論

牙髓炎是目前臨床上的常見(jiàn)病,主要是由牙髓感染引起的牙髓組織發(fā)炎。根據(jù)北京大學(xué)口腔醫(yī)院2020年調(diào)查分析表明,在眾多病因中,因牙髓炎而急診收治的病人占比最大[21]。牙髓炎傳統(tǒng)的治療手段為根管治療,其成功率在85%～90%左右,但是由于牙髓組織的缺失,牙齒殘余組織更加脆弱,并且妨礙未成熟恒牙牙根發(fā)育。因此,保持牙髓活力是必要的。

近年來(lái),組織工程及再生醫(yī)學(xué)的發(fā)展顯著促進(jìn)了再生牙髓學(xué)研究,即尋求用再生的髓樣組織代替炎癥或壞死的牙髓組織[22, 23]。值得一提的是,20年前有學(xué)者從人的牙髓中分離出一種克隆性、高增殖干細(xì)胞群,即DPSCs,可使牙本質(zhì)或者髓樣組織再生[5],還能有效再生骨、血管及新形成功能性牙髓[24-26]。于是,人們提出了基于牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞的牙髓再生技術(shù)來(lái)保持牙齒活力。但是,使用干細(xì)胞移植也存在著缺點(diǎn),細(xì)胞不能高效募集損傷區(qū)域,導(dǎo)致受損區(qū)的活細(xì)胞數(shù)量下降,存活時(shí)間短,不足以完全發(fā)揮細(xì)胞的作用。近期研究發(fā)現(xiàn),部分miRNAs能夠?qū)PSCs進(jìn)行功能調(diào)整,從而改變細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育。例如,Tian等人的研究表明,miR-584在蛋白激酶B (protein kinase b, AKT)信號(hào)通路中可能對(duì)具有PDZ結(jié)合模序的轉(zhuǎn)錄共激活因子(transcriptional co-activator with PDZ-binding motif ,TAZ)的表達(dá)發(fā)揮調(diào)控作用,從而成為DPSCs增殖的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子[27]。此外,2019年研究確認(rèn),下調(diào)miR-224-5p有利于DPSCs的增殖與遷移;當(dāng)miR-224-5p上調(diào)時(shí),發(fā)現(xiàn)了與之相反的現(xiàn)象[28]。2022年,Wei等證實(shí),miR-153-3p經(jīng)由核結(jié)合因子亞基β (core-binding factors-beta,CBFβ)信號(hào)通路對(duì)人類DPSCs的成骨分化具有抑制作用,該研究為骨缺損的治療和骨再生的促進(jìn)提供了新的策略[29]。但迄今為止,尚未有確切的證據(jù)表明miR-31對(duì)DPSCs增殖和遷移的影響。

首先我們采用 RT-qPCR 技術(shù),分別對(duì)炎癥牙,健康牙的牙髓組織和 DPSCs 中 miR-31 的表達(dá)水平進(jìn)行了測(cè)試,結(jié)果表明與對(duì)照組相比,炎癥牙的牙髓組織和DPSCs中miR-31的表現(xiàn)水準(zhǔn)明顯降低,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),miR-31在健康牙的DPSCs中有較高表達(dá),結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道相符[20]。在此基礎(chǔ)上,我們?cè)O(shè)計(jì)用miR-31成功轉(zhuǎn)染 DPSCs,然后用了一系列細(xì)胞功能性實(shí)驗(yàn)表明miR-31能促進(jìn)DPSCs的增殖和遷移。

為了深入了解miR-31對(duì)DPSCs增殖影響的潛在機(jī)制,本文測(cè)量了DPSCs 中 Ki67、PCNA 的蛋白質(zhì)水平。Gerdes等人在1983年最初使用小鼠單克隆抗體,用霍奇金淋巴瘤細(xì)胞系的細(xì)胞核免疫小鼠,確定了Ki67抗原的存在并進(jìn)行了研究,結(jié)果發(fā)現(xiàn),其不存在于靜止細(xì)胞內(nèi),而是廣泛地表達(dá)于增殖細(xì)胞(正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞)[30, 31]。PCNA作為細(xì)胞周期標(biāo)記物已被人們所熟知,正常增殖細(xì)胞和轉(zhuǎn)化細(xì)胞及腫瘤中均檢出了不同量的該蛋白質(zhì),它的濃度隨細(xì)胞周期而起伏變化,S期顯著增加[32]。所以,本文在轉(zhuǎn)染后對(duì)Ki67和PCNA的蛋白質(zhì)水平進(jìn)行了測(cè)量,結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)miR-31可上調(diào)Ki67、PCNA蛋白質(zhì)水平,從而有利于DPSCs增殖。接著,本文對(duì)miR-31作用于DPSCs遷移生物學(xué)機(jī)制進(jìn)行探討,本文檢測(cè)了DPSCs中CXCR4、MMP2的蛋白質(zhì)水平。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1α,SDF-1α)作為小分子趨化因子,提高了細(xì)胞的遷移能力,CXCR4作為SDF-1α特異性受體已被人們熟知。SDF1α/CXCR4軸在促進(jìn)干細(xì)胞的募集以及干細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移過(guò)程中發(fā)揮重要作用[33-35]。CXCR4在干細(xì)胞中表達(dá)減少,增殖及遷移能力隨之下降[36]?；|(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)是一組20種以上的蛋白酶,為鋅依賴性內(nèi)肽酶,起初是以蛋白酶的形式發(fā)現(xiàn),其對(duì)細(xì)胞外蛋白質(zhì)具有靶向和切割作用,可以有效地改變細(xì)胞的功能[37],其中,MMP-2是基質(zhì)金屬蛋白酶家族中參與細(xì)胞遷移的重要蛋白質(zhì)[38]。研究結(jié)果表明,過(guò)表達(dá)miR-31能上調(diào)CXCR4、MMP2蛋白質(zhì)水平從而有利于DPSCs遷移。

總之,本文的數(shù)據(jù)表明,miR-31在炎癥牙中下調(diào),且miR-31過(guò)表達(dá)有利于DPSCs增殖和遷移,為干細(xì)胞在損傷部位聚集從而利于牙髓組織再生提供良好的理論基礎(chǔ),且miR-31作為一種重要的分子標(biāo)記物,有望成為牙髓炎預(yù)后和治療的一種新的有前途的候選分子。但是該研究目前仍存在許多不足,首先實(shí)驗(yàn)多以細(xì)胞為主,有關(guān)臨床組織方面的研究較少,本文的研究結(jié)論在臨床數(shù)據(jù)上仍缺乏支持;其次,本研究只探討了基于miR-31在DPSCs中的生物學(xué)作用,需要進(jìn)一步進(jìn)行關(guān)于其調(diào)控細(xì)胞增殖和遷移的內(nèi)在機(jī)制研究;最后,DPSCs是多譜系分化的細(xì)胞,關(guān)于miR-31是否能影響干細(xì)胞向成牙髓方向分化將是未來(lái)研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。