Supervillin isoform 4(SV4)通過增強Aurora A活性調控細胞有絲分裂

畢文旭, 張思鈺, 李抒洋, 王 薇, 陳學冉, 方志友*

(1)中國科學院合肥物質科學研究院健康與醫(yī)學技術研究所, 合肥 230031;2)中國科學技術大學研究生院科學島分院健康與醫(yī)學技術研究所基礎醫(yī)學中心, 合肥 230026)

有絲分裂是真核細胞平等分離其已經復制的染色體到2個子細胞中的過程。在細胞有絲分裂過程中,染色質濃縮包裝形成形態(tài)與數(shù)量一定的染色體,同時,γ-微管蛋白環(huán)復合物和其他微管調節(jié)因子被募集到中心體使其激活和成熟,微管成核并與復制的染色體相互作用形成其分離所需的雙極紡錘體,染色體向相反的兩極分離[1-2]。作為細胞中主要的微管組織中心,中心體的正確激活和成熟對于協(xié)調有絲分裂期間雙極紡錘體的形成及染色體的準確分離至關重要[3-4]。Aurora A是細胞在有絲分裂期間中心體成熟和紡錘體組裝的重要調控蛋白質[5-7]。Aurora A的活化受到共作用因子TPX2(TPX2 microtubule nucleation factor)的影響,Aurora A與TPX2結合后,Aurora A的構象發(fā)生改變,激酶活性增強[8-9]。

Supervillin是絨毛蛋白/凝溶膠蛋白超家族中最大的亞家族,可與F-肌動蛋白、肌球蛋白II等多種細胞骨架蛋白質結合[10-11],調節(jié)細胞的黏附、極化、擴散、運動和遷移[12-13]。目前,已經鑒定出supervillin蛋白的5種剪切異構體,它們都是由SVIL基因轉錄而來。其中,supervillin剪接異構體4(supervillin isoform 4 ,SV4)是在增殖細胞中supervillin家族內最大的剪接異構體,與supervillin異構體1(SV1)相比,包含額外的編碼外顯子3、4 和5 (exon 3-4-5)。

前期研究文獻表明,supervillin參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程。在肝癌中,supervillin促進內皮依賴性血管的發(fā)展并誘導血管生成擬態(tài)的形成[14]。在缺氧微環(huán)境中,supervillin還可以通過上皮-間質轉換促進腫瘤細胞的侵襲和轉移,進而促進肝癌的惡性進展,是肝癌患者的獨立預后指標[15]。同時,supervillin可以通過降低腫瘤抑制蛋白質 p53 和下游靶基因的水平來增加細胞存活[16]。Supervillin還參與巨噬細胞運動的調節(jié)以及LPS誘導的 IL-6、IL-1β和 TNF-α上調的炎癥反應[17],可以和KIR2DL1(killer cell immunoglobulin like receptor, two Ig domains and long cytoplasmic tail 1)受體結合,阻斷NK細胞的細胞毒性[18]。Supervillin的幾種亞型在腫瘤發(fā)展的過程中發(fā)揮著重要作用,包括細胞存活,遷移和轉移[19-20]。

Supervillin家族蛋白質在調節(jié)細胞分裂過程中也發(fā)揮著重要作用。例如,在細胞胞質分裂過程中,supervillin可以與KIF14(kinesin family member 14)、EPLIN(epithelial protein lost in neoplasm)等蛋白質相互作用,協(xié)調肌動蛋白和微管的運動功能[21]。Supervillin作為細胞外信號調節(jié)激酶3 (extracellular regulated protein kinase 3,ERK3) 的底物調節(jié)分裂細胞中的肌球蛋白 II 激活,促進胞質分裂[22]。有研究表明,敲低supervillin會導致細胞早期胞質分裂期間的分裂失敗[21]。然而,早期研究并未對supervillin在有絲分裂期間的不同剪接異構體的功能進行區(qū)分研究。本文利用外顯子Exon 3-4-5制備特異性抗體,對supervillin剪接異構體SV4進行研究,發(fā)現(xiàn)在細胞有絲分裂期間,SV4定位于中心體和細胞膜,其通過與TPX2-AurA復合物相互作用,進而調控Aurora A在中心體的募集和激活,幫助中心體的成熟和紡錘體的組裝,從而保證有絲分裂中期微管正確組裝與染色體正確分離。

1 材料與方法

1.1 儀器及圖像處理

使用激光共聚焦掃描顯微鏡(EVOS M7000 3D;賽默飛世爾科技;美國)獲得圖像。使用Adobe Photoshop軟件統(tǒng)一調整圖像的對比度和亮度并進行合并。

1.2 抗體

文中描述的一抗包括supervillin抗體(HPA020138;sigma;美國)、β微管蛋白抗體(anti-β-tubulin )(#TA506805;Origene;中國)、anti-TPX2(#12245;Cell signaling technology;美國)、anti-Aurora A(#14475;Cell signaling technology;美國)、γ微管蛋白抗體(anti-γ-tubulin)(ab11317;abcam;美國)。

1.3 細胞培養(yǎng)和轉染

本研究使用的所有細胞系都通過形態(tài)學觀察定期驗證,并測試無支原體污染。細胞被保存在Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基(DMEM)中,并添加10% 胎牛血清FBS(Gibco;美國)和1%青霉素/鏈霉素(Hyclone;美國)。培養(yǎng)箱在加濕的空氣中,含5%的二氧化碳,溫度為37 ℃。

靶向人類SV1/SV4 cDNA序列Stealth RNA (賽默飛世爾科技;美國) dsRNA轉染細胞: siRNA#1∶5′-CCCCUGGAAGAUAUCGAAGCCAGAC-3′,siRNA#2∶5′-TATTAAGGTAGAAAGGTTGATTCGC-3。

1.4 質粒

EGFP標記的人SV1和SV4根據(jù)之前的報道制備[16,21]。利用PCR技術從SV1或SV4中擴增出SV1/4片段,亞克隆到pEGFP-C2 (Invitrogen)或p3xFlag-CMV(Sigma)中[16,23]。從人cDNA中PCR擴增人γ-微管蛋白,通過BglII/XbaI位點克隆到pEGFP-C1(Clontech)和p3xFlag-CMV(Sigma)。編碼人Aurora A的質粒(#26293)購置于Addgene公司,通過消化生成Flag標記的Aurora A蛋白,通過BamHI位點連接到p3xFlag-CMV質粒。

甲亢是指血液循環(huán)中甲狀腺激素過多，引起以神經、循環(huán)、消化等系統(tǒng)興奮性增高和代謝亢進，臨床上以Grave’s甲亢多見，約占所有甲亢的80%～85%。Grave’s甲亢治療主要有抗甲狀腺藥物治療、131I治療和手術治療。131-I治療Grave’s甲亢是核醫(yī)學的傳統(tǒng)優(yōu)勢項目之一，已有70余年歷史，是目前成人Grave’s甲亢的首選治療方法。本文旨在研究131I治療Grave’s甲亢伴頸部血管雜音的劑量分析。

1.5 GST pull down分析

從pEGFP-SV4中利用PCR擴增人類SV4(外顯子3-4-5,E3-4-5),并克隆到pGEX-6p-1(GE Healthcare)載體的EcoRI和SalI位點之間。轉化至感受態(tài)細胞BL21中表達SV4-GST融合蛋白,并用谷胱甘肽瓊脂糖珠(GE Healthcare)純化。瓊脂糖偶聯(lián)的GST標記的SV4/E345(對照組為瓊脂糖偶聯(lián)的等量GST蛋白質)與U2OS全細胞裂解物在緩沖體系(25 mmol/L Tris-HCl,pH7.5,150 mmol/L NaCl, 10%甘油和0.5% NP-40)4 ℃孵育3 h。離心清洗,加入1.2x SDS上樣緩沖液(loading buffer),100 ℃水浴變性10 min,通過SDS-PAGE分離,Western 印跡進行分析。

1.6 免疫沉淀

HEK293細胞在含10%胎牛血清(Gibco)的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。將編碼Flag標簽的γ-微管蛋白、Aurora A或SV1截斷片段的質粒與GFP標記的SV1、SV4及其截斷片段或γ-微管蛋白瞬間轉染HEK293細胞。在裂解緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl,pH 7.5,150 mmol/L NaCl,10 mmol/L NaF,1 mmol/L NaVO4,0.5% NP-40和蛋白酶抑制劑混合物)中制備全細胞裂解物,并在4 ℃的條件下用抗Flag M2樹脂(Sigma)免疫沉淀全細胞裂解物數(shù)小時。經裂解緩沖液洗滌后收集復合物,用抗Flag、GFP和相應的抗體進行免疫印跡實驗,檢測共沉淀蛋白質。

1.7 延時顯微成像

將control siRNA和SV4 siRNA分別轉染到HeLa細胞48 h,每3 min拍攝1次圖像,在蔡司顯微鏡下對HeLa細胞進行活細胞的觀察。在顯微鏡下,在含10%FBS的 OPTI-MEM培養(yǎng)基中孵育細胞,培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃和5% CO2。

將control siRNA和SV4 siRNA轉染到U2OS細胞后48 h開始,每3 min使用蔡司多通道系統(tǒng)拍攝1次圖像,對U2OS細胞中的H2B-GFP進行觀察。在顯微鏡下,在含10%FBS的 OPTI-MEM培養(yǎng)基中孵育細胞,培養(yǎng)環(huán)境為37 ℃和5% CO2。

1.8 免疫熒光顯微鏡

為了檢測內源性SV4和γ-微管蛋白或β-微管蛋白的總量,細胞在含0.25% Triton X-100的PHEM (60 mmol/L Pipes,25 mmol/L Hepes,10 mmol/L EGTA和2 mmol/L MgCl2)中孵育2 min,然后4%的多聚甲醛中固定。對于其他抗體,細胞在TBS中洗滌2次,并在4%的多聚甲醛中固定。免疫染色時,在室溫條件下加入封閉液(TBS,4%山羊血清,0.2% Triton X-100)1 h后加入適當?shù)囊豢?并在4 ℃的條件下孵育過夜。用特定的二抗在室溫下孵育載玻片1 h后用TBS沖洗。細胞核用DAPI復染,經TBS清洗,防熒光淬滅劑封片。用徠卡直立顯微鏡或尼康共聚焦顯微鏡進行觀察分析。

1.9 微管再生試驗

用100 ng/mL諾可達唑孵育有絲分裂的細胞3 h,冰上孵育30 min,破壞微管。為了評估微管再生的能力,用預冷緩沖液洗滌有絲分裂細胞2次以去除諾可達唑,37 ℃ 孵育5 min。固定的細胞用抗γ-微管蛋白和β-微管蛋白抗體染色,分析成核能力和中心體大小。從有絲分裂細胞中獲取圖像,通過在中心體周圍繪制感興趣的區(qū)域,使用ImageJ軟件獲得中心體區(qū)域的量化,進而確定中心體的大小。使用ImageJ測量信號,通過平均像素強度在紡錘極分析有絲分裂細胞內源性Aurora A、pT288-Aurora A或γ-微管蛋白,并對細胞質背景進行校正。

1.10 統(tǒng)計學方法

采用GraphPad Prism 5軟件進行統(tǒng)計分析,所有數(shù)據(jù)均以至少3個獨立實驗的平均值±標準差表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗進行分析。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 在細胞有絲分裂中SV4表達定位于中心體

為了探索SV4的作用,在SV4野生型MEF細胞中使用純化制備的SV4抗體(Fig.1A),發(fā)現(xiàn)該細胞中存在全長的SV4及它的蛋白質切割片段,而敲除SV4的MEF細胞在這些相應的區(qū)域處條帶顏色變淺甚至消失。野生型U2OS細胞中也存在全長的SV4及相應的蛋白質切割功能片段。結果顯示:在細胞分裂間期中,SV4彌散分布于細胞質與細胞膜(Fig.1B),在中心粒上也有分布。然而,在細胞有絲分裂期間,SV4在中心體上的定位信號從前期開始顯著增強,并在中期達到最高(Fig.1C)。在末期和細胞質分裂期間,中心體處的SV4信號逐漸降低,并保持在較低的表達水平。與此相一致的是,在細胞分裂中期,GFP/myc標記的外源性SV4也定位于中心體,且與γ-微管蛋白存在明顯地共定位,基于GFP標記的SV4信號雖然能在中心體部位存在定位,但是信號并不強,而Myc標記的SV4在中心體處的定位信號很強,進一步說明了SV4在有絲分裂中的功能及定位可能更集中于coiled-coil domain區(qū)域(Fig.1D)。這些結果表明SV4可能在細胞有絲分裂中期發(fā)揮著作用。

Fig.1 SV4 localizes to the centrosome and mitotic spindle poles (A) WT MEF , KO MEF and U2OS cells were immunoblotted with anti-SV4, and anti-Actin antibodies. (B) U2OS cells were fixed with pre-cold methanol for 5 minutes at -20℃, and immunostained with anti-γ-tubulin (green) and anti-SV4 (red) in interphase. The scale bars represent 10μm (left). High magnification views on the right indicate centrosome structures. The scale bars represent 1μm (right). (C) SV4 was stained with an anti-SV4 antibody (green), β-tubulin was stained with an anti-β-tubulin antibody (red) and the nucleus was stained with DAPI in U2OS cells via an immunofluorescence assay. (D) U2OS cells with stably expressed GFP and Myc-tagged SV4 were stained with anti-GFP or Myc antibodies (green) and an anti-β-tubulin antibody (red) to indicate the mitotic spindle. The scale bars represent 10 μm

2.2 SV4的缺失導致有絲分裂中期的遲滯及多極紡錘體的形成增加

為了進一步探索SV4在細胞分裂中的作用,利用延時成像技術對轉染SV4 siRNA的U2OS細胞進行了實時觀察(Fig.2A)。結果顯示:在對照細胞中,細胞分裂前期到后期的時間約為32 ± 2 min (n=38,Fig.2B,Supplementary Movie 1)。在SV4敲低細胞中,時間約為104 ± 10 min (n=55,Fig.2B,Supplementary Movie 2)。在SV1/4雙敲低細胞中,時間約為69 ± 6 min (n=41,Fig.2B)。SV1/4雙敲除時,有一部分細胞阻滯在G2/M期,無法進入有絲分裂期[17,21],而SV4定位于中心體(Fig.1C),在有絲分裂期有更強的功能,因此SV4單獨敲除對有絲分裂的阻滯效果更好。同時,利用免疫熒光染色技術觀察了有絲分裂被阻滯的U2OS細胞中紡錘體的改變。結果顯示:與對照siRNA相比,SV4 siRNA處理過的細胞傾斜紡錘體和多極紡錘體(有2個以上紡錘桿的細胞)明顯增多(Fig.2C,D和E)。同時,SV4 siRNA組中擁有2個以上γ-微管蛋白陽性的中心體細胞數(shù)量也明顯增加(Fig.2C和2D)。因此,這些結果提示,SV4參與了有絲分裂中雙極紡錘極完整性的維持。

Fig.2 SV4 regulates the mitotic spindle organization at mitosis (A) Selected frames from time-lapse imaging of U2OS cells stably expressing GFP-tagged H2B treated with the control or SV4 targeting stealth siRNA. Time-lapse imaging began from 48 hours post-transfection with the control and SV4 siRNA. Experiments were repeated 3 times. (B) Duration of mitosis of time-lapse imaging of cells treated with the control or SV4 siRNA.***P<0.001, n=100 cells. (C) γ-tubulin was stained with an anti-γ-tubulin antibody (green), β-tubulin was stained with an anti-β-tubulin antibody (red) and the nucleus was stained with DAPI (blue) in U2OS cells via an immunofluorescence assay. The scale bars represent 10 μm. (D) Metaphase U2OS cells treated with the control or SV4 targeting stealth siRNA were immunostained with anti-TPX2 (green), anti-β-tubulin antibodies (red) and DAPI (blue).The scale bars represent 10 μm. (E) Percentage of disrupted poles, tilt spindles, and multipolar spindles in cells treated with the control or SV4 siRNA . n=50 mitotic cells per experiment

2.3 SV4促進中心體上γ-微管蛋白的募集和微管的形成

為了確定supervillin結構域的功能活性,根據(jù)supervillin結構域特征分別構建了一系列突變體(Fig.3A)。免疫熒光結果顯示,SV1/4(825～1 270)區(qū)域與γ-微管蛋白共定位于有絲分裂中心體(Fig.3B)。免疫共沉淀結果顯示:Flag標記的γ-微管蛋白僅可以與GFP標記的包含825～1 270區(qū)域的SV1/4存在相互作用,而與其他SV片段無相互作用關系(Fig.3A和3C)。此外,Flag標記SV截斷(675～1 270)也證實可以與GFP標記的γ-微管蛋白共沉淀(Fig.3D)。這些結果表明,SV1/4中825～1 270區(qū)域在中心體生物活性調控中可能發(fā)揮重要作用,可能是決定supervillin定位于中心體的關鍵結構域。

Fig.3 Interaction of SV1/4 with γ-tubulin is required for γ-tubulin recruitment and mitotic spindle organization (A) GFP-tagged SV1/4 full-length and truncation constructs used in this paper. (B) Metaphase U2OS cells expressing GFP-tagged supervillin truncations were immunostained with anti-GFP (green), anti- β -tubulin antibodies (red), and DAPI (blue) for DNA. The scale bars represent 10 μm. (C) Flag-tagged γ-tubulin was transiently co-expressed with GFP-tagged SV1FL, SV4FL or truncations in HEK293 cells and immunoprecipitated with anti-Flag magnetic beads. Western blotting for whole cell lysates and immunoprecipitation were probed with antibodies against the indicated proteins. (D) Flag-tagged coiled-coil domain of supervillin was transiently co-expressed with GFP-tagged γ-tubulin in HEK293 cells and immunoprecipitated with anti-Flag magnetic beads. Western blotting for whole cell lysates and immunoprecipitation were probed with antibodies against the indicated proteins. (E) Synchronized U2OS cells were transfected either with the control or SV4 siRNA and were arrested in mitosis and microtubules were allowed to regrow (time point 30 minutes) after ice treatment, and fixed and stained with antibodies against γ-tubulin (green), β-tubulin antibodies (red) and DAPI (blue). The scale bars represent 10 μm. (F) The intensities of γ-tubulin that had formed around centrosomes in mitotic cells after 30 seconds of regrowth were quantified, and mean values were plotted as percentages of intensities in control and SV4 depletion cells.***P<0.001, (n=20 poles, error bars: SEM)

敲低SV4后,中心體上的γ-微管蛋白信號強度比對照組中期細胞下降約50%(Fig.2C),提示SV4的缺失導致γ-微管蛋白未被適當?shù)啬技街行捏w。因此,通過微管再生研究分別檢測對照組和SV4 siRNA組有絲分裂細胞中的中心體微管成核情況。結果顯示:與對照組細胞相比,SV4敲低細胞中γ-微管蛋白定位于中心體的信號明顯減少(P<0.001),且信號均為短微管和弱γ-微管蛋白(Fig.3E和3F)。因此,在SV4敲低細胞中,γ-微管蛋白不能被適當?shù)卣心嫉街行捏w,導致中心體介導的微管成核能力減弱。

2.4 SV4特異性結構域E3-4-5與Aurora A相互作用并參與Aurora A在中心體的募集和激活

在細胞有絲分裂中,SV4與Aurora A在細胞中存在明顯的共定位(Fig.4A)。同時,利用U2OS細胞裂解液分別孵育GST和GST/SV4-E345融合蛋白,進行GST pull down實驗。并利用質譜鑒定結合蛋白質。結果顯示:Aurora A、TPX2和SV4-E3-4-5存在同一復合物中,它們之間可能存在相互作用,且Aurora A信號比TPX2更強(Fig.4B)。進一步的免疫共沉淀結果表明:Aurora A僅與SV4相互作用,與SV1無相互作用關系(Fig.4C),且與其它SV4結構域相比,Aurora A僅與SV4(1～1 250)特異性相互作用,且其結合也將促進TPX2與Aurora A的相互作用的增強(Fig.4D)。

Fig.4 SV4 activates Aurora A at mitotic spindle poles through interacting with TPX2 (A) U2OS cells were immunostained by an anti-SV4 antibody (red), an anti-Aurora A antibody (green) and DAPI (blue) in metaphase. The scale bars represent 10 μm. (B) GST and SV4-specific domain fusion proteins could pull-down Aurora A and TPX2 from HeLa cell lysates. (C) Flag-tagged Aurora A was transiently co-expressed with GFP-tagged SV1FL, SV4FL in HEK293 cells and immunoprecipitated with anti-Flag magnetic beads. Western blotting for whole cell lysates and immunoprecipitation were probed with antibodies against the indicated proteins. (D) Flag-tagged Aurora A was transiently co-expressed with GFP-tagged SV1/4 truncations in HEK293 cells and immunoprecipitated with anti-Flag magnetic beads. Western blotting for whole cell lysates and immunoprecipitates were probed with antibodies against the indicated proteins. (E) U2OS cells were transfected either with the control or SV4 siRNA. Metaphase cells were stained with an anti-β-tubulin antibody (red), an anti-Aurora A antibody (green) and DAPI (blue).The scale bars represent 10 μm. (F) The intensities of Aurora A at spindle poles in the control siRNA or SV4 siRNA treated cells,** P<0.01 (20 poles). (G) RPE1 cells transfected with individual control, SV4 and SV1/4 siRNAs targeting different regions of supervillin isoforms were immunoblotted with anti-supervillin, anti-TPX2 (C-terminal), anti-pAurA-T288, anti-Aurora A and anti-actin antibodies. (H) The intensities of SV1/4, Aurora A, phospho-Aurora A T288, TPX2 in control, SV4 siRNA, SV1/4 siRNA#1, SV1/4 siRNA#2-treated cells. Relative levels of indicated proteins were quantified by ImageJ. (I) U2OS cells were transfected either with control or SV4 siRNA. Metaphase cells were fixed and stained with an anti-β-tubulin antibody (red), an anti-phospho-Aurora A-T288 antibody (green) and DAPI (blue). The scale bars represent 10 μm. The lower right corner is the image magnified five times where the arrow points. (J) The intensities of phospho-Aurora A T288 at spindle poles in control or SV4 siRNA treated cells,*** P<0.001 (20 poles)

為了進一步探究在有絲分裂過程中SV4對Aurora A蛋白的調控作用,通過免疫熒光染色分別檢測了對照組和SV4 siRNA組中Aurora A及pT288-Aurora A(Aurora A活化形式)的分布情況。結果顯示:Aurora A雖然均可以定位于對照組和SV4缺失組細胞的紡錘體中,但是SV4 siRNA組細胞的Aurora A的分布發(fā)生了改變(Fig.4E)。對照組細胞的Aurora A蛋白水平未受顯著影響,但SV1/4的雙敲除降低了Aurora A和pT288-Aurora A蛋白水平以及TPX2的切割(Fig.4G和4H)。相比于對照組細胞,SV4 siRNA組細胞中Aurora A在中期中心體的相對熒光下調約44%(Fig.4E和4F,P<0.01),pT288-Aurora A的相對熒光下調高達60%(Fig.4I和4J,P<0.001)。

因此,這些結果提示,SV4有可能通過與TPX2-AurA復合物結合,促進Aurora A的激活及其在細胞分裂中的生物學功能發(fā)揮。

3 討論

細胞有絲分裂的順利進行需要基于成熟的中心體形成紡錘體微管,為分裂細胞提供動力,使染色體準確分離,保證親代和子代之間遺傳性狀的穩(wěn)定性。在有絲分裂進入期間,中心粒周圍物質(pericentriolesmaterial,PCM)和中心粒周蛋白在中心粒周圍積累,PCM中的Aurora A激酶通過磷酸化并激活中心體成熟調控性蛋白質Polo樣激酶1(polo like kinase 1,PLK1),促進其定位到中心體,PLK1可以促進PCM的擴增和中心體的成熟,并加速紡錘體微管的成核[24]。紡錘體微管在中心體成熟后動態(tài)聚合和解聚,以捕獲姐妹染色單體并將染色體運輸?shù)郊忓N體赤道完成細胞的分裂[25]。

Supervillin作為肌動蛋白和膜相關蛋白質,在細胞遷移、運動及胞質分裂等過程中發(fā)揮著重要作用。本研究發(fā)現(xiàn),SV4在細胞分裂間期信號較弱,且呈彌散狀分布,而在細胞分裂期間表達不斷升高,在中期達到最高,提示了SV4在有絲分裂中期發(fā)揮作用的事實。研究結果顯示,SV4在細胞分裂期間定位于中心體,SV4的缺失導致細胞內多級紡錘體的形成及有絲分裂進程被阻滯。在SV4敲低細胞中,中心體的微管成核能力減弱。因此,SV4通過促進微管的成核能力,調控中心體的成熟及紡錘體的組裝,從而保證有絲分裂的順利進行。

本研究結果顯示,SV4不僅定位于中心體,還定位在細胞膜上。SV1/4(825～1 270)區(qū)域與γ-微管蛋白共定位于有絲分裂中心體,而其他SV片段與γ-微管蛋白無相互作用關系,表明SV1/4(825～1 270)區(qū)域負責中心體的定位,并通過調控中心體的生物活性影響細胞有絲分裂的進程,而SV4表達降低對γ-微管蛋白在中心體定位的影響機制可能與其在中心體的功能相關,前期論文中也發(fā)現(xiàn),SV1/4(825～1 270)結構區(qū)域與一些中心粒相關蛋白質相互作用,例如ODF2(outer dense fiber of sperm tails 2)和RHAMM(receptor for hyaluronan-mediated motility)等[21]。而只有SV4(1～1 250)區(qū)域,即SV4的N-端結構域具有明顯的細胞膜定位。因此,SV1/4(825～1 270)區(qū)域可以結合中心體,SV4的N-端結構域則負責與細胞膜上的F-肌動蛋白和肌球蛋白II結合,在胞質分裂過程中為細胞產生機械力,使其分裂為2個子細胞。此前文獻報道,supervillin 中的2個區(qū)域影響細胞分裂,分別是結合紡錘體蛋白的殘基 831～1 281,以及結合肌球蛋白 II 重鏈 (MHC) 和長形式的肌球蛋白輕鏈激酶的殘基 1～170[17],與本文結果相符。同時,Aurora A僅與SV4相互作用,而與SV1無相互作用關系,表明SV4的特異性結構域,即包含額外的編碼外顯子3、4 和5 (Exon3-4-5)區(qū)域可以募集Aurora A蛋白,并與其相互作用,促進Aurora A蛋白在中心體處的定位與激活。

Aurora A蛋白在有絲分裂的G2期出現(xiàn)并定位于中心體,參與調節(jié)有絲分裂的多個過程,包括中心體復制、成熟和分離,雙極紡錘體的組裝、有絲分裂進入的觸發(fā)、中期染色體的排列、胞質分裂/脫落以及返回G1期[26]。Aurora A作為細胞有絲分裂過程中的調節(jié)劑,有報道稱,Aurora A的下調和上調均能導致胞質分裂缺陷。這表明Aurora- A對細胞質分裂的影響不僅在于其表達水平,還在于其激活和失活的時機。事實上,Aurora A的激活和定位受到嚴格的調控。Aurora A活性的時空分布至少部分是由Aurora A激活劑所控制。例如,TPX2激活Aurora A是雙極紡錘體組裝所必需的[27-28];而Ajuba(Ajuba LIM protein)激活Aurora A是有絲分裂進入的必要條件[29];通過非有絲分裂,發(fā)現(xiàn)Aurora A、TPX2和SV4-E3-4-5存在于同一復合物中,且Aurora A與SV4(1～1 270)的特異性結合促進了TPX2與Aurora A相互作用的增強。免疫熒光染色結果顯示,敲低SV4,在中期細胞的中心途徑HEF-1(human enhancer of filamentation 1)激活Aurora A對初級纖毛的分解是必需的[30]。本研究利用GST pull down技術,Aurora A及其pT288-Aurora A的定位信號均顯著下調。提示SV4促進Aurora A在中心體的募集和激活,TPX2可能是SV4與Aurora A發(fā)生相互作用的橋梁。

Supervillin能通過與細胞膜和肌動蛋白細胞骨架緊密結合介導肌球蛋白II激活和肌動蛋白動力學[31]。SV4作為supervillin的一個剪接異構體,在G2晚期中心體信號增強,而Aurora A在G2/M期也被募集到中心體。目前尚不清楚SV4何時以及如何激活Aurora A。SV4本身可能不足以激活Aurora A。SV4可能起到支架的作用,將Aurora A和它的激活劑(例如TPX2)結合在一起。

綜上所述,本文發(fā)現(xiàn),SV4除了定位在細胞膜上,在有絲分裂中期還能定位在中心體上,SV4在中心體的定位影響γ-微管蛋白的分布與微管成核,SV4通過與Aurora A的直接相互作用,并促進TPX2/AurA復合物在中心體的定位和成熟以及紡錘體的組裝,在有絲分裂過程中發(fā)揮著不可或缺的作用。這一發(fā)現(xiàn),有助于進一步理清supervillin蛋白在細胞周期過程中的功能與調控的分子機制,及其對腫瘤細胞增殖的影響,特別是其剪切異構體中的不同結構特征可能是其發(fā)揮功能的重要因素。