布尼亞病毒核蛋白的結(jié)構(gòu)與功能

李祥亮, 王朝溪, 歐陽松應(yīng),3)*

(1)福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物科學(xué)系, 福州 350117;2)華中農(nóng)業(yè)大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院水產(chǎn)動(dòng)物醫(yī)學(xué)系, 武漢 430070;3)福建師范大學(xué)南方生物醫(yī)學(xué)研究中心, 福州 350117)

布尼亞病毒是有包膜,分節(jié)段的負(fù)鏈RNA病毒,對(duì)全世界的公共衛(wèi)生事業(yè)有重大的影響[1]。布尼亞病毒種類繁多,包括近500個(gè)成員。繁多的種類使得抗布尼亞病毒藥物的研發(fā)變得愈加困難,鑒于核蛋白(nucleoprotein,NP)的高保守性,目前,越來越多的研究者將注意力集中在布尼亞病毒的NP上。NP在保護(hù)病毒RNA和免疫抑制過程中發(fā)揮重要的作用,但其分子機(jī)制尚不完全清楚,針對(duì)NP的研究不僅有助于人們進(jìn)一步了解病毒的生命周期,而且對(duì)于藥物靶點(diǎn)的開發(fā)具有重大意義[2]。目前,已經(jīng)有許多布尼亞病毒NP的結(jié)構(gòu)被解析,從這些結(jié)構(gòu)可以看出屬于同科病毒的NP結(jié)構(gòu)相似性較高。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一些以NP末端臂及RNA結(jié)合口袋為靶標(biāo)的抗病毒抑制劑,這對(duì)布尼亞病毒疫苗和藥物研發(fā)具有重大意義。本文將從布尼亞病毒及其NP的背景、NP參與的免疫反應(yīng)、NP的三維結(jié)構(gòu)、NP藥物靶點(diǎn)的預(yù)測以及NP的應(yīng)用現(xiàn)狀等方面來進(jìn)行總結(jié)闡述。

1 布尼亞病毒的背景

布尼亞病毒目(Bunyavirales)包含的病毒種類豐富,據(jù)國際病毒命名委員會(huì)(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)最新發(fā)布的報(bào)告,布尼亞病毒目包括496個(gè)成員,分為14個(gè)科,60個(gè)屬。14個(gè)科分別為沙狀病毒科(Arenaviridae)、甲殼類林肯病毒科(Cruliviridae)、盤狀病毒科(Discoviridae)、費(fèi)莫病毒科(Fimoviridae)、漢坦病毒科(Hantaviridae)、利什曼原蟲布尼亞病毒科(Leishbuviridae)、多足類湖北病毒科(Mypoviridae)、內(nèi)羅病毒科(Nairoviridae)、泛布尼亞病毒科(Peribunyaviridae)、幻影病毒科(Phasmaviridae)、白纖病毒科(Phenuiviridae)、番茄斑萎病毒科(Tospoviridae)、圖拉斯病毒科(Tulasviridae)和武漢蜈蚣病毒科(Wupedeviridae)。

布尼亞病毒以節(jié)肢動(dòng)物、鋸齒狀動(dòng)物為載體進(jìn)行傳播,并在自然界的吸血節(jié)肢動(dòng)物和易感脊椎動(dòng)物中循環(huán)[3]。近年來,布尼亞病毒目中的許多新興病毒對(duì)人類健康產(chǎn)生了重大影響。例如,裂谷熱病毒(Rift Valley fever virus,RVFV)和克里米亞-剛果出血熱病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus,CCHFV)感染人類后,可引發(fā)嚴(yán)重的病毒性腎綜合征出血熱(hemorrhagic fever with renal syndrome,HFRS),死亡率高達(dá)30%[4]。中國中部的患者身上分離出的發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus,SFTSV)引起了高達(dá)10%～30%的死亡率[5]。感染這些病毒的病例主要人群為農(nóng)民,且在發(fā)病前很可能有過野外工作的經(jīng)歷[6]。布尼亞病毒的主要傳播媒介是蜱蟲和蚊子,SFTSV和CCHFV甚至可以通過人與人之間的直接接觸進(jìn)行傳播[7]。布尼亞病毒的感染已經(jīng)成為一個(gè)不容忽視的公共衛(wèi)生問題,因此,尋找有效且安全的藥物對(duì)抗布尼亞病毒十分緊迫。

布尼亞病毒是有包膜、分節(jié)段的負(fù)鏈 RNA病毒。布尼亞病毒呈球形,直徑80～100 nm,病毒基因組由3段負(fù)鏈RNA片段組成,根據(jù)長短分別命名為L、M和S。L段編碼RNA依賴的RNA聚合酶(RNA-dependent RNA polymerase,RdRp);M段編碼病毒包膜糖蛋白(glycoprotein,GP);S段編碼病毒NP和1個(gè)非結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)[8](Fig.1A)。

Fig.1 Bunyaviruses, their genomic patterns and NP amino acid sequence alignment (A) Bunyavirus are enveloped, with GP arranged on the membrane exterior. The bunyavirus genome comprises three RNA segments (S, M and L). (B) NP amino acid sequence alignment of SFTSV, RVFV and TOSV

2 布尼亞病毒核蛋白簡介

布尼亞病毒的基因組S、M、L可以與NP相互作用,形成NP-RNA復(fù)合體,即核糖核蛋白復(fù)合體 (ribonucleoprotein complex,RNP),RNP在病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄中發(fā)揮重要作用[9]。NP與RNA結(jié)合后作為一個(gè)整體既充當(dāng)復(fù)制的活性模板,又保護(hù)RNA不被宿主酶消化。當(dāng)病毒進(jìn)入宿主細(xì)胞時(shí),RNP可以保護(hù)病毒的基因組物質(zhì)不被宿主免疫系統(tǒng)識(shí)別,從而使病毒的RNA再復(fù)制和轉(zhuǎn)錄成為可能。研究RNP的功能和形成機(jī)制對(duì)于明確病毒的復(fù)制和組裝非常關(guān)鍵,且對(duì)新型藥物靶點(diǎn)的開發(fā)具有重要意義。除此之外,在病毒的組裝過程,NP也發(fā)揮著極大的作用,它能夠與RdRp和GP相互作用,一起完成病毒感染周期。

布尼亞病毒目中同科的病毒NP在一級(jí)序列上有較高的同源性,而不同科病毒之間NP一級(jí)序列的同源性很低。白纖病毒科中的SFTSV和托斯卡納病毒(Toscana virus,TOSV),與同是白纖病毒科的RVFV NP在氨基酸序列上顯示出較高的同源性,多序列比對(duì)顯示同源性分別高達(dá)38%和50%[10](Fig.1B)。除此之外,泛布尼亞病毒科中大多數(shù)病毒也表現(xiàn)出高度的氨基酸序列同源性。

3 布尼亞病毒核蛋白參與的免疫反應(yīng)

NP是高免疫原性的病毒蛋白質(zhì),在宿主細(xì)胞免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用[11]。NP在免疫反應(yīng)中的作用已經(jīng)在許多其他病毒,例如狂犬病病毒、甲型流感病毒等中得以驗(yàn)證:狂犬病病毒NP可以抑制宿主細(xì)胞I型干擾素反應(yīng)[12];傳染性造血壞死病毒(infectious hematopoietic necrosis virus,IHNV)NP的過表達(dá)顯著降低了誘導(dǎo)I型干擾素表達(dá)蛋白質(zhì)(mediator of IRF3 activator,MITA)的水平,數(shù)據(jù)表明,IHNV NP可以通過降解MITA來抑制宿主細(xì)胞I型干擾素的產(chǎn)生[13]。布尼亞病毒NP同樣可以參與宿主細(xì)胞免疫反應(yīng),NP的不同結(jié)構(gòu)域發(fā)揮不同的作用。例如,沙狀病毒科的拉沙病毒(Lassa virus,LASV)NP的 C-端結(jié)構(gòu)域有外切酶活性,是NP抑制干擾素所必需的[14]。外切核酸酶結(jié)構(gòu)域可以降解病毒復(fù)制過程中產(chǎn)生的雙鏈RNA(double-stranded RNA, dsRNA),從而防止它們?cè)诩?xì)胞質(zhì)中的積累以及被宿主細(xì)胞識(shí)別消化的風(fēng)險(xiǎn)[14, 15]。CCHFV NP和LASV NP在氨基酸序列和結(jié)構(gòu)上有較高的同源性,但CCHFV NP不會(huì)像LASV NP一樣,通過抑制干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)的激活途徑來執(zhí)行類似的免疫逃避反應(yīng)。事實(shí)上,CCHFV NP在N-端結(jié)構(gòu)域中含有1個(gè)內(nèi)切酶活性位點(diǎn),可能在免疫抑制中發(fā)揮重要作用[16, 17]。RVFV NP的結(jié)構(gòu)和內(nèi)切酶活性域與CCHFV也不相同,這表明每種病毒的免疫抑制機(jī)制可能會(huì)有所差異。

LASV NP可以與DEAD-box RNA解旋酶3(DEAD-box RNA helicases 3,DDX3)相互作用,進(jìn)而調(diào)控感染期間宿主細(xì)胞和病毒的生命周期[18]。DDX3是一種抗病毒蛋白質(zhì),是ATP依賴的RNA解旋酶[19],在RNA代謝過程中參與轉(zhuǎn)錄和翻譯等。DDX3通過其解旋酶結(jié)構(gòu)域使dsRNA展開,然后NP與DDX3相互作用以將解旋酶活性招募到復(fù)制轉(zhuǎn)錄復(fù)合體(replication transcription complexes,RTC)中,以促進(jìn)病毒RNA的合成,從而促進(jìn)病毒復(fù)制[18]。DDX3也是宿主細(xì)胞針對(duì)病毒感染的先天免疫反應(yīng)的一個(gè)組成部分,在核因子κB激酶抑制劑ε(inhibitor of kappa-B kinase ε,IKKε)及TANK結(jié)合激酶1(TANK-binding kinase 1,TBK1)的上游和下游發(fā)揮作用,導(dǎo)致β干擾素的發(fā)生[20]。病毒感染早期,DDX3協(xié)助病毒RNA復(fù)制;感染晚期,DDX3充當(dāng)干擾素的抑制因子[18]。黑色素瘤分化相關(guān)分子(melanoma differentiation-associated gene 5,MDA5)是細(xì)胞內(nèi)的異體RNA監(jiān)測蛋白,屬于視黃酸誘導(dǎo)基因I (retinoic acid-inducible gene I,RIG-I)樣受體家族的重要成員。NP介導(dǎo)RIG-I和MDA5與病毒RNA結(jié)合后,激活I(lǐng)KKε/TBK-1復(fù)合物和IKKα/β復(fù)合物[21],這些復(fù)合物磷酸化IRF-3和核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB),進(jìn)而啟動(dòng)β干擾素、α干擾素和細(xì)胞因子的表達(dá)[22]。雙鏈RNA依賴的蛋白質(zhì)激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)是一種抗病毒蛋白質(zhì),一旦檢測到病毒dsRNA,它會(huì)通過磷酸化核糖體真核起始因子2(eukaryotic initiation factor 2,eIF2)來抑制病毒蛋白質(zhì)翻譯起始[23]。PKR也可以被干擾素誘導(dǎo)的PKR蛋白激活因子(PKR-activating protein,PACT)激活,隨后通過磷酸化其抑制亞基介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活[24]。對(duì)病毒感染早期的研究表明,NP阻斷了IRF-3的核易位和轉(zhuǎn)錄活性,從而抑制了I型干擾素的產(chǎn)生[25]。干擾素活性喪失是上游幾個(gè)協(xié)同過程的結(jié)果[26]。因此,RIG-I和MDA5未激活I(lǐng)KKε磷酸化的級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而不能激活I(lǐng)RF3通路。PACT和PKR都未被激活,導(dǎo)致活躍的eIF2持續(xù)存在,使病毒蛋白質(zhì)繼續(xù)翻譯并抑制NF-kB通路的激活[27]。沙狀病毒科病毒NP-IKKε的相互作用阻斷了其自催化活性和磷酸化IRF3的能力[28]。綜上所述,NF-κB,RIG-I-MAVS和TBK1-IRF3等信號(hào)通路中的很多關(guān)鍵分子是NP的作用靶點(diǎn),NP可以通過對(duì)其進(jìn)行調(diào)控誘導(dǎo)免疫反應(yīng),進(jìn)而影響病毒和宿主細(xì)胞的生命周期[29](Fig.2)。

Fig.2 Diagram of the innate immune pathway and function of LASV NP (A) NP interacts with DDX3 to assist viral RNA replication, suppress IFN production and facilitate infection. (B) PKR phosphorylates eIF2 upon recognition of dsRNA and inhibits protein translation. (C) The interaction of NP with MDA5 transmits signals to downstream. (D) NP-IKKε interactions block its autocatalytic activity and ability to phosphorylate IRF3, NP blocks the nuclear translocation and transcriptional activity of IRF-3, which results in inhibition of IFN-I.(E)NP regulates phosphorylation of IKBα and NF-κB, prevents their nuclear translocation and inhibits cytokine expression

布尼亞病毒NP還可以同宿主細(xì)胞的許多其他分子相互作用,進(jìn)而影響宿主細(xì)胞生命活動(dòng)。最近的研究表明,漢坦病毒(Hantan virus,HTNV)感染宿主細(xì)胞后,NP與熱休克蛋白40(heat shock proteins 40,Hsp40)競爭結(jié)合P58IPK(干擾素誘導(dǎo)的PKR抑制因子),導(dǎo)致Hsp40-P58IPK復(fù)合物解聚。隨后,NP通過與核糖體小亞基RPS19相互作用,將活化的P58IPK招募到核糖體40S亞基抑制PKR的抗病毒作用[30]。

4 布尼亞病毒核蛋白的三維結(jié)構(gòu)

NP是RNP的主要組成部分,RNP在病毒中可以折疊成雙螺旋結(jié)構(gòu),以保護(hù)基因組RNA不被消化[31]。與GP相比,NP在病毒中具有較高的保守性,是研發(fā)抗病毒藥物的一個(gè)重要靶蛋白。NP在病毒的生命周期中參與很多過程:病毒RNA的包被和保護(hù);轉(zhuǎn)錄、復(fù)制過程的調(diào)節(jié)以及誘導(dǎo)宿主免疫抑制[1]。到目前為止,布尼亞病毒目中許多病毒NP單體結(jié)構(gòu)和結(jié)合RNA的復(fù)合物結(jié)構(gòu)已經(jīng)被解析。RVFV NP結(jié)構(gòu)是布尼亞病毒目中最先解析的[32]。RVFV NP的結(jié)構(gòu)顯示,其N-端臂可以介導(dǎo)蛋白質(zhì)寡聚作用,每一個(gè)NP單體的N-端臂與相鄰單體的背面相互作用,形成一個(gè)6聚體環(huán)(Fig.3A),在LASV NP的結(jié)構(gòu)中C-端臂發(fā)揮類似的功能[16]。這可能是負(fù)鏈RNA病毒NP形成多聚體和包被RNA的普遍規(guī)律。

Fig.3 Structure of several Bunyavirus NPs (A) Structure of RVFV NP hexamer (left) and monomer (right) (PDB: 4H5M). (B) Structure of LEAV NP tetramer-bound ssRNA (left) and monomer surface electrostatic potential (right) (PDB: 4J1G). (C) HTNV NP is a two-lobed structure, and the RNA-binding cleft is located at the intersection between the two lobes(PDB:5FSG). (D)Structure of the TSWV NP trimer (left) and monomer (right) (PDB: 5IP1). (E) Superposition of monomeric structures of RVFV NP (green,PDB:4H5M), SFTSV NP (blue,PDB:4J4U) and TOSV NP (purple,PDB:4CSF) in the family Phenuiviridae. (F)Superposition of monomeric structures of BUNV NP (green,PDB:3ZLA), LACV NP (blue,PDB:4BHH) and LEAV NP (purple,PDB:4J1G) in the family Peribunyaviridae

通過解析布尼維爾病毒(Bunyamwera virus,BUNV)NP-RNA復(fù)合物四聚體的三維結(jié)構(gòu),揭示了BUNV NP獨(dú)特的結(jié)構(gòu)形式。電鏡研究表明,重組表達(dá)的BUNV NP-RNA復(fù)合物在溶液狀態(tài)下會(huì)以四聚體、五聚體和六聚體的形式共同存在[33]。同年,本研究團(tuán)隊(duì)報(bào)道了與BUNV同屬于泛布尼亞病毒科的Leanyer virus(LEAV)的NP-RNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu)(Fig.3B),顯示了與BUNV類似的保護(hù)基因組RNA的模式。從結(jié)構(gòu)中顯示,NP由N-端和C-端兩部分結(jié)構(gòu)域組成,它們中間形成強(qiáng)烈的正電荷溝槽,此部位結(jié)合并保護(hù)單鏈病毒RNA。同時(shí),在NP的N-端和C-端分別伸出柔性手臂,分別搭在前后相鄰的2個(gè)NP上,穩(wěn)定蛋白質(zhì)的多聚化形式[34]。HTNV是出血熱腎綜合征的病原體,HTNV NP的結(jié)構(gòu)與泛布尼亞病毒科NP結(jié)構(gòu)相似性較小。它的 RNA 結(jié)合口袋位于雙葉(lobe)之間的交叉處,NP的寡聚化由與相鄰單體結(jié)合的N-端臂和C-端臂介導(dǎo)(Fig.3C)[35]。布尼亞病毒目番茄斑萎病毒科的番茄斑萎病毒(tomato spotted wilt virus,TSWV),分布范圍很廣,可侵害1 000多種植物,包括雙子葉植物和單子葉植物,給人類社會(huì)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失[36]。TSWV NP的單體由3部分組成:N-端臂、C-端臂和核心結(jié)構(gòu)域。與其他負(fù)鏈RNA病毒的NP不同,TSWV NP形成不對(duì)稱的三聚體環(huán)。NP的N-端臂和C-端臂與2個(gè)相鄰NP的核心結(jié)構(gòu)域相互作用,進(jìn)而形成三聚體環(huán)[37]。通過解析TSWV NP與RNA復(fù)合物的晶體結(jié)構(gòu),發(fā)現(xiàn)不對(duì)稱三聚體環(huán)的內(nèi)部溝槽是RNA結(jié)合位點(diǎn)(Fig.3D)。這些特征與其他布尼亞病毒的NP相似。

結(jié)構(gòu)疊加表明,白纖病毒科中SFTSV,RVFV和TOSV的NP結(jié)構(gòu)是非常保守的(Fig.3E)。此外,在泛布尼亞病毒科中BUNV、拉克羅斯病毒(La Crosse virus,LACV)和LEAV的單體構(gòu)象高度相似[38](Fig.3F)。而不同科的病毒,其NP序列和結(jié)構(gòu)的同源性較小,甚至幾乎無同源性。這表明,布尼亞病毒同一科的病毒NP包裹其基因組RNA并形成RNP的機(jī)制相似。這些結(jié)果對(duì)于進(jìn)一步認(rèn)識(shí)布尼亞病毒轉(zhuǎn)錄復(fù)制復(fù)合體形成的分子機(jī)制,以及針對(duì)布尼亞病毒引起的重大傳染性疾病防控都具有重要的意義。

5 核蛋白抗病毒藥物靶點(diǎn)的預(yù)測

布尼亞病毒目中大多數(shù)病毒都缺乏有效的疫苗和抗病毒藥物,因此,揭示NP上的潛在靶點(diǎn),以開發(fā)抗病毒藥物和有效的疫苗,對(duì)于解決布尼亞病毒的感染問題至關(guān)重要。

NP是一種多功能和高保守的蛋白質(zhì),在尋找抗病毒藥物靶點(diǎn)方面具有重要意義。甲型流感病毒中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了具有不同作用機(jī)制的靶向NP抑制劑[39],目前發(fā)現(xiàn)的布尼亞病毒科的靶向NP抑制劑仍很少。由于布尼亞病毒的研究實(shí)驗(yàn)需要在生物安全等級(jí)為3級(jí)或4級(jí)的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行,許多實(shí)驗(yàn)室不具備研究條件,阻礙了疫苗的研發(fā)[40]。因此,保守的抗病毒藥物靶點(diǎn)對(duì)于布尼亞病毒的防治具有重要意義。

5.1 以NP的末端臂為靶標(biāo)

NP寡聚是通過其末端臂來介導(dǎo)的,末端臂可以與相鄰NP相互作用進(jìn)而形成寡聚體。通過對(duì)RNP的負(fù)染結(jié)果分析發(fā)現(xiàn),與相鄰單元相互作用的末端臂是影響RNP構(gòu)象的關(guān)鍵因素[31]。許多突變研究表明,打破2個(gè)NP單體之間的相互作用不僅對(duì)NP形成寡聚有影響,而且對(duì)RNP活性也有影響[41]。SFTSV NP通過其N-端臂的疏水鍵和氫鍵與相鄰分子相互作用,NP寡聚體是通過1個(gè)NP單體結(jié)合另1個(gè)NP單體的N-端臂實(shí)現(xiàn)的。刪除SFTSV NP的N-端或?qū)㈥P(guān)鍵位點(diǎn)突變,會(huì)使得環(huán)形寡聚體無法形成[42, 43]。突變或刪除BUNV NP的前10個(gè)殘基,刪除RVFV NP的N-端,都可以減弱NP的寡聚作用[33]。

由此可見,將NP形成寡聚的關(guān)鍵位點(diǎn)突變或者用末端臂的類似物進(jìn)行抑制可以阻止NP的組裝。甲型流感病毒的NP抑制劑是一種包含尾環(huán)區(qū)域的環(huán)形肽,作用于NP尾環(huán)結(jié)合口袋,可以破壞NP的三聚體化進(jìn)而抑制病毒的復(fù)制[44]。布尼亞病毒也可以根據(jù)同樣的機(jī)制設(shè)計(jì)抑制劑。CCHFV NP與短單鏈RNA孵育會(huì)導(dǎo)致構(gòu)象發(fā)生變化并解聚成單體NP。因?yàn)榕c短單鏈RNA的孵育會(huì)引起NP莖部結(jié)構(gòu)域(參與寡聚體的形成)的旋轉(zhuǎn),導(dǎo)致二聚體界面的空間位阻,破壞聚合[45]。由此表明,能夠改變CCHFV NP構(gòu)象的短單鏈RNA片段可能是CCHFV復(fù)制和組裝的理想抑制劑。最近研究發(fā)現(xiàn),莫羅尼白血病病毒10(Moloney leukemia virus 10,Mov10)可以通過與布尼亞病毒NP的N-端臂結(jié)合,阻斷NP形成寡聚體,進(jìn)而抑制NP與RNA或RdRp相互作用,從而抑制RNP的組裝[46](Fig.4A)。這為以NP的末端臂為靶標(biāo)開發(fā)抗病毒藥物提供了新的見解。

Fig.4 Pattern of antiviral targets on NP (A) Diagram of MOV10 interaction with NP. (B) NP cannot bind RNA in its RNA-binding groove in the presence of suramin

由此可見,NP的末端臂可以作為小分子藥物的作用靶點(diǎn)。布尼亞病毒各個(gè)科的序列和結(jié)構(gòu)的保守性有利于針對(duì)此作用靶點(diǎn)的理想藥物的開發(fā)。

5.2 以NP與RNA的結(jié)合口袋為靶標(biāo)

NP最重要的功能之一是保護(hù)基因組RNA不被宿主細(xì)胞消化[47]。每個(gè)NP亞基都有一個(gè)深而窄的RNA結(jié)合口袋,這個(gè)結(jié)合口袋富含正電殘基,口袋會(huì)隨著NP的聚合在環(huán)內(nèi)側(cè)表面形成RNA結(jié)合槽[33]。布尼亞病毒目同科中的病毒可能具有相似的RNA結(jié)合位點(diǎn),并且有類似RNA結(jié)合機(jī)制。白纖病毒科中RVFV的RNA結(jié)合在NP上17個(gè)氨基酸的正電荷區(qū)。將RVFV NP-RNA復(fù)合物結(jié)構(gòu)與白纖病毒科中的其他病毒,例如SFTSV NP比對(duì),發(fā)現(xiàn)存在一個(gè)相似的RNA結(jié)合口袋,這個(gè)結(jié)合口袋的多個(gè)殘基高度保守[48]。將SFTSV NP的RNA結(jié)合口袋上的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行突變,導(dǎo)致NP幾乎喪失了結(jié)合核酸的能力,無法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和復(fù)制[49]。內(nèi)羅病毒科的CCHFV NP的RNA結(jié)合位點(diǎn)中發(fā)現(xiàn)的關(guān)鍵殘基,在整個(gè)科中都是保守的[50]。因此,針對(duì)NP的RNA結(jié)合口袋為靶標(biāo)設(shè)計(jì)藥物,以阻礙RNA與NP的結(jié)合,是非常有前景的。

研究通過虛擬篩選發(fā)現(xiàn)的萘普生,是甲型流感病毒的NP抑制劑。抑制機(jī)制是通過與流感病毒NP的RNA結(jié)合口袋結(jié)合,誘導(dǎo)靠近其結(jié)合位點(diǎn)的關(guān)鍵殘基發(fā)生構(gòu)象變化,干擾了RNP的自組裝,阻止NP在病毒的生命周期中發(fā)揮作用[51-53]。近年來,蘇拉明的發(fā)現(xiàn)證實(shí)了RNA結(jié)合位點(diǎn)在抗病毒感染中的重要意義。蘇拉明是在抑制劑篩選研究中發(fā)現(xiàn)的非核苷類抑制劑,是首個(gè)報(bào)道的針對(duì)布尼亞病毒NP的RNA結(jié)合口袋的抑制劑,通過與SFTSV NP共結(jié)晶得到證實(shí)[54]。蘇拉明位于SFTSV NP的RNA結(jié)合位點(diǎn)上,該位點(diǎn)與RVFV NP的RNA結(jié)合位點(diǎn)有相似的特征[55]。蘇拉明通過氫鍵和靜電作用與NP相互作用,結(jié)合部位由高度保守的殘基組成。功能研究表明,SFTSV感染宿主細(xì)胞后添加蘇拉明,對(duì)體外細(xì)胞中的病毒復(fù)制產(chǎn)生了明顯的抑制作用。另外的研究顯示,蘇拉明能夠抑制病毒復(fù)制過程中起始的特異性NP-RNA結(jié)合,以及抑制尚未確定的一個(gè)或多個(gè)后續(xù)步驟,并且蘇拉明能夠通過直接與RNA結(jié)合口袋結(jié)合來滲透并破壞NP-RNA復(fù)合物(Fig.4B)。這些結(jié)果證明,蘇拉明可能對(duì)大多數(shù)布尼亞病毒的復(fù)制有抑制作用[56]。

由此可見,抑制RNA與病毒NP的結(jié)合是一種有吸引力的抗病毒治療策略,因?yàn)樵诟腥具^程中,NP執(zhí)行的所有功能都涉及到與RNA的結(jié)合。因此,NP的RNA結(jié)合位點(diǎn)是臨床治療中尋找抗病毒藥物的關(guān)鍵靶點(diǎn),具有很大的潛力,可能對(duì)遏制布尼亞病毒的爆發(fā)具有重大意義。

6 核蛋白的應(yīng)用

在布尼亞病毒的生命周期中,NP有著不可或缺的地位。針對(duì)NP的結(jié)構(gòu)和功能方面進(jìn)行的研究,能幫助人們更好的認(rèn)識(shí)和了解布尼亞病毒復(fù)雜的生命周期和致病機(jī)制。所以研究布尼亞病毒的NP,不僅有基礎(chǔ)層面的意義,還擁有更大的應(yīng)用價(jià)值,例如疾病的診斷、疫苗的研發(fā)、靶向NP抗病毒藥物的開發(fā)以及疾病的治療等(Table 1)。

6.1 NP在疾病診斷中的應(yīng)用

對(duì)于布尼亞病毒的檢測已經(jīng)有很多方法,包括通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)檢測IgM和IgG、病毒中和試驗(yàn)、具有高特異性和靈敏度的定量逆轉(zhuǎn)錄PCR以及進(jìn)行病原體分離等[57]。但這些方法都存在某些不足,核酸檢測儀器設(shè)備價(jià)格昂貴,極易引起交叉污染;IgM抗體一般需要在感染后5～6 d后才出現(xiàn)。膠體金免疫層析(immunochromatographic assay,ICA)使用膠體金標(biāo)記的抗原或抗體作為示蹤劑,分別檢測抗體或抗原[58]。雖然膠體金技術(shù)檢測方法簡單快速,不需要儀器設(shè)備,但是不能做到定量檢測,靈敏度還有待提高。

Table 1 Applications of NP and their characteristics

SFTSV NP的抗體在感染后早期可以檢測出來,表明NP是早期診斷SFTSV感染的一個(gè)候選靶抗原。迄今為止,重組抗原已被用于準(zhǔn)確、特異地檢測布尼亞病毒的一些病毒的抗體。研究通過使用熒光碳點(diǎn)/SiO2實(shí)現(xiàn)了對(duì)SFTSV的超靈敏檢測,該測定法對(duì) SFTSV表現(xiàn)出快速、靈敏和高度選擇性的反應(yīng),并用于檢測實(shí)際樣品,為 SFTSV 檢測開辟了新的可能性[59]。目前,已經(jīng)利用SFTSV的重組NP建立了一種間接ELISA方法,用于特異、敏感、安全和快速的檢測SFTSV[60]。CCHFV NP可以在昆蟲、細(xì)菌和哺乳動(dòng)物、植物細(xì)胞中表達(dá),能作為蛋白質(zhì)抗原來檢測病毒的特異性抗體[61]?；贑CHFV NP的ELISA檢測病毒感染的方法亦可能在全球范圍內(nèi)應(yīng)用[62]。

6.2 NP在疫苗研發(fā)中的應(yīng)用

NP是最豐富的高免疫原性的病毒蛋白質(zhì)。在一些動(dòng)物模型中,NP靶向的疫苗可以誘發(fā)提供基礎(chǔ)保護(hù)的細(xì)胞免疫反應(yīng)。NP似乎在加強(qiáng)或激發(fā)某種程度的保護(hù)方面有一定的作用。

近年來,研究的重點(diǎn)是將布尼亞病毒的NP作為疫苗開發(fā)的潛在目標(biāo)。NP是布尼亞病毒的高免疫原性的蛋白質(zhì),能刺激特異性抗體的產(chǎn)生,具有出現(xiàn)早、滴度高和時(shí)間長的特點(diǎn),尤其是它還能誘發(fā)保護(hù)性體液免疫和細(xì)胞免疫[1]。RVFV、CCHFV和HTNV的DNA疫苗在各種組合的小鼠模型中都進(jìn)行過試驗(yàn)。漢坦病毒科的普馬拉病毒 (puumala virus,PUUV)NP顯示了一個(gè)特殊的N-端區(qū)域,這個(gè)區(qū)域有助于保護(hù)模型免受后續(xù)PUUV的感染。在80%動(dòng)物中,誘導(dǎo)保護(hù)的PUUV NP的N-端區(qū)域?yàn)?～45aa,而且更有助于免疫反應(yīng)的區(qū)域被確定[63]。更重要的是,NP可以誘導(dǎo)高度交叉反應(yīng)的抗體反應(yīng)。免疫反應(yīng)的選擇性壓力低于GP。此外,已經(jīng)證明RVFV NP是一種有效的人類T細(xì)胞免疫原,可以誘導(dǎo)廣泛的免疫優(yōu)勢(shì)的CD8+T細(xì)胞反應(yīng)[64]。將構(gòu)建的質(zhì)粒DNA進(jìn)行泛素化修飾可增強(qiáng)DNA疫苗的效力,這可能會(huì)解決未修飾的抗原與NP顯示出較弱的細(xì)胞反應(yīng)的問題。與編碼RVFV GP的重組DNA疫苗相比,用pCMV-Ub-N(一種可編碼泛素化NP的質(zhì)粒)免疫小鼠,可顯著提高干擾素受體基因敲除的小鼠的存活率[65]。在CCHFV中也觀察到了類似的現(xiàn)象,即編碼泛素連接的CCHFV GP和NP的DNA質(zhì)粒,可更有效地促進(jìn)細(xì)胞反應(yīng),對(duì)干擾素受體基因敲除的小鼠的致命CCHFV感染,表現(xiàn)出100%預(yù)防性免疫力[66]。由此表明,NP靶向DNA疫苗是一種潛在的候選疫苗,并為針對(duì)某些布尼亞病毒的疫苗設(shè)計(jì)提供了新策略。

7 問題與展望

布尼亞病毒引發(fā)一些人類疾病綜合癥,例如出血熱、腦炎和致命的呼吸道綜合癥等,通過節(jié)肢動(dòng)物和嚙齒動(dòng)物傳播。布尼亞病毒種類繁多的原因在于它的基因組容易發(fā)生突變,且基因組的分段性質(zhì)增加了病毒成員之間基因重排的可能性。隨著病毒的進(jìn)化,可通過與陽性患者直接接觸而在人與人之間傳播。由于病毒的傳播途徑越來越廣,傳播速度在不斷加快,所以對(duì)人類和牲畜的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。另一方面,由于許多布尼亞病毒主要是以宿主動(dòng)物為載體進(jìn)行傳播,因此,徹底消滅這些病毒是非常困難的。傳統(tǒng)的減毒疫苗也可能由于與自然界的野生型毒株進(jìn)行基因重排而恢復(fù)或增加其致病性。目前,抗病毒藥物主要有兩種類型,包括病毒靶標(biāo)和宿主靶標(biāo)。病毒靶標(biāo)類型的藥物可能對(duì)不同血清型的病毒產(chǎn)生不同的抑制作用。盡管利巴韋林和法匹拉韋已被證明對(duì)某些布尼亞病毒有抗病毒作用,但其抗病毒作用是有限的[67, 68]。所以,尋找有效的保守的布尼亞病毒疫苗或抗病毒藥物是非常迫切的。

NP是一種多功能與高序列保守的蛋白質(zhì),是一種理想的抗病毒靶標(biāo)蛋白,已廣泛應(yīng)用于病毒抗病毒藥物的開發(fā)。NP為病毒的治療提供了許多機(jī)會(huì),并正在發(fā)展成為一個(gè)高度特異的抗病毒靶點(diǎn)。在本綜述中,我們討論了布尼亞病毒NP預(yù)防或治療的潛在藥物靶點(diǎn)。正如所討論的那樣,布尼亞病毒中同科的NP結(jié)構(gòu)最為相似,特別是白纖病毒科和泛布尼亞病毒科,有利于這種理想的藥物靶點(diǎn)的開發(fā)。另外,蘇拉明也被證明可以分別與RVFV NP和SFTSV NP結(jié)合,通過與RNA結(jié)合口袋相互作用,破壞RNP的組裝,干擾病毒的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制。這進(jìn)一步證實(shí)了NP可以作為理想的抗病毒靶蛋白,針對(duì)布尼亞病毒NP的研究,將有望有效的控制布尼亞病毒的感染和爆發(fā)。