百合枯萎病拮抗細菌的篩選

李潤根，李嘉妮，李 楠，黃 琪，艾芬婷，趙雅芳

(宜春學院 江西省作物生長發(fā)育調控重點實驗室，江西 宜春 336000)

百合(Liliumspp.)屬單子葉植物亞綱百合科百合屬多年生草本植物[1]，具有食用價值和藥用價值.食用方面，百合含有豐富的皂苷、生物堿類、酚酸甘油酯、磷脂類、微量元素以及糖類等化學成分；藥理方面，百合有抗疲勞、抗腫瘤、降血糖等作用[2].近年來百合連作障礙日益嚴重，對百合的產(chǎn)量、品質及市場價格影響很大.而百合枯萎病是引起連作障礙的重要病害，對產(chǎn)量和質量造成不同程度損失[3].百合枯萎病也稱根腐病、莖腐病，由致病性尖孢鐮刀菌侵染引起的植物枯萎病是世界性的土傳真菌病害之一[4]，也是百合病害中最嚴重、造成經(jīng)濟損失最大的病害之一.目前防治措施主要有農(nóng)業(yè)防治、化學防治、生物防治[5].在大力倡導環(huán)境保護和食品安全的今天，生防發(fā)揮的作用越來越明顯.目前已報道的對枯萎病具有拮抗效果的生防細菌主要為芽孢桿菌.賈熙超等[6]發(fā)現(xiàn)多粘類芽孢桿菌JNJX-2對棉花枯萎病有良好的生防效果；李晉等[7]發(fā)現(xiàn)暹羅芽孢桿菌ZJT2在正常土壤中該菌株對西瓜枯萎病病菌的防治效果高達100%.武志江等[8]報道了枯草芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌為東方百合枯萎病拮抗細菌；楊謝斌[9]分離篩選出對龍牙百合枯萎病有顯著抑制作用的拮抗菌株枯草芽孢桿菌Y35.但目前有關百合枯萎病拮抗細菌為貝萊斯芽孢桿菌相關報道比較少.

本研究擬采用土壤稀釋法和平板對峙法等方法，篩選和鑒定龍牙百合枯萎病病菌的拮抗細菌，利用Salkowski比色法和鉬銻抗比色法測定拮抗細菌抗病能力、分泌IAA及其溶磷能力.獲取具有拮抗和促生雙重功能的優(yōu)良菌株，并通過形態(tài)學和分子生物學鑒定其菌株，以期為百合尖孢鐮刀菌的生防應用提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 百合植株根際土壤及病原菌

1)連根帶土的挖取連作且健康的卷丹百合、龍牙百合和鐵炮百合，將植株“抖根”后，用刷子將根上剩余的土壤輕輕刷下來，得到根際土壤，放在4 ℃的冰箱保存?zhèn)溆?

2)病原菌為實驗室從龍牙百合發(fā)病的鱗片上分離純化而來，為尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum.

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基[10]、King培養(yǎng)基、PKO無機磷培養(yǎng)基(pH=7.1)、孟金娜培養(yǎng)基(pH=7.2)[11].

1.2 方法

1.2.1 拮抗細菌的分離、純化與篩選

1)菌株的分離：根際土壤樣品菌株的分離采取土壤稀釋法[12].10 g土樣加90 ml無菌水，200 r/min振蕩30 min，制成初始土壤懸浮液.分別稀釋至10-3、10-4、10-5和10-6這4個梯度，取100 μL各質量濃度菌液分別涂布于添加重鉻酸鉀的LB培養(yǎng)基，3次重復，28 ℃培養(yǎng)2～3 d，記錄菌株生長情況，挑取形態(tài)差異明顯的單個菌落.

2)菌株的純化：對形態(tài)差異明顯的菌落進行純化培養(yǎng)，純化3～4次.

3)菌株的篩選：平板對峙法篩選出具有活性的菌株，觀察和培養(yǎng)，并用革蘭氏染色液試劑盒對其進行染色.

1.2.2 抗病能力的測定

將病原菌用5 mm打孔器制成菌餅倒接于PDA平板中央，活化1 d后，在病原菌左右兩側(距病原菌2.5 cm)接種待測菌.3次重復，以不接種待測菌為對照.28 ℃下培養(yǎng)7 d，觀察病原菌的形態(tài)，記錄抑菌帶寬和抑菌率并判斷有無抗菌活性[13].計算方式如下：

1.2.3 細菌分泌IAA特性測定

1)采用S2比色液[14]，其測定范圍為5～200 μg/mL，超過100 μg/mL需要稀釋.

2)IAA標準曲線的制作：將純的3-IAA配置濃度為2，4，6，8，10，15，20，25，30，35，40，45，50 mg/L的IAA梯度標準溶液，溶液與S2試劑按1∶1體積混合，室溫下避光放置30 min，分別測定各濃度標準液OD530(在波長530 nm下的吸光值)，以IAA濃度為橫坐標，OD530值為縱坐標得到IAA標準曲線.

3)定量測定：采用Salkowski比色法.將培養(yǎng)12 d的培養(yǎng)液在4 ℃環(huán)境下，10 000 r/min離心15 min，取上清液4 ml加S2比色液4 ml，黑暗下靜置30 min后，然后用紫外分光光度計測定OD530，在標準曲線上查出各待測菌液的IAA濃度.

1.2.4 溶磷能力的測定

將500 μL各菌株的菌懸液分別接種于PKO無機磷培養(yǎng)液和蒙金娜培養(yǎng)液中，每個處理3次重復，放置于28 ℃、160 r/min搖床上培養(yǎng)10 d.用pH計測定培養(yǎng)10 d后的各菌株培養(yǎng)液pH值的變化情況.培養(yǎng)10 d后加入無磷活性炭1 g，150 r/min震蕩30 min.再將培養(yǎng)液在4 ℃環(huán)境下，15 000 r/min離心 15 min，取上清液用鉬銻抗比色法測定有效磷增量[15].計算公式如下：

P=K×V/V1，

式中：P為有效磷增量；K為標準曲線上顯色液的磷質量濃度(mg/L)；V1為顯色時吸取上清液的體積(mL)；V為顯色時溶液定容的體積(mL).

1.2.5 拮抗菌株分子生物學鑒定

將上述分離純化得到的優(yōu)良菌株進行DNA的提取，然后選用通用引物16s(27F/1492R)和專用引物gyrA(gyrA-R/gyrA-F)[16]進行基因序列擴增，擴增后的產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，測得的序列利用MEGA 6.0軟件進行聚類分析，進而初步鑒定出所分離的菌株.

2 研究結果

2.1 百合根際土壤拮抗細菌的形態(tài)特征

菌株來源于龍牙、鐵炮、卷丹百合的根際土壤，通過土壤稀釋法，共分離了200余株細菌，其中具有拮抗作用的菌株有5株，分別為：假35、J45、TP54、TP58、J67.對這5種細菌進行純化培養(yǎng)，通過培養(yǎng)和觀察，5株細菌菌落均為近白色(圖1).其中J67、TP58、TP54為革蘭氏陽性菌株，J45、假35為革蘭氏陰性菌株(圖2).

(a)TP58 (b)J67 (c)J 45 (d)假35 (e)TP54

(a)TP58 (b)J67 (c)TP54 (d)J45 (e)假35

2.2 拮抗細菌抗病能力

28 ℃培養(yǎng)7 d后，觀察菌株與病原菌的抑菌情況(圖3).測量各菌株平板里病原菌菌落的直徑和病原菌菌落與各拮抗菌株的距離，計算其抑菌率和抑菌帶寬(表1).5種拮抗細菌對病原菌(LD12)都有一定的抗病能力，抑菌率有所不同.其中J67的抗病能力最好，達到52.47%，TP54和TP58的抑菌率也在40%以上，顯著高于假35和J45.

(a)J67 (b)TP58 (c)TP54 (d)J45 (e)假35

表1 各株拮抗細菌抑菌率和抑菌帶

2.3 拮抗細菌分泌IAA的能力

定量測定時用Salkowski比色法，以IAA質量濃度為橫坐標，OD530值為縱坐標，得到IAA標準曲線方程：

YOD530=0.040XIAA+0.014，(R2=0.998).

測得5株菌株分泌IAA的量為4.87～10.05 mg/L(圖4)，其中TP54、TP58、J67分泌IAA量較多，分別為10.05，8.65，8.97 mg/L，顯著高于假35和J45，說明此3株菌株有很好的促生作用.

圖4 各株拮抗細菌分泌IAA測定結果

2.4 各菌株溶磷能力測定

微生物溶磷可以通過酶解作用和有機酸酸解作用，酸性物質可使磷酸鹽溶解，但當菌株處于磷酸鹽饑餓狀態(tài)時，會合成堿性的磷酸酶[17].孟金娜培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后，對各菌株的有效磷進行測定，5株菌株中有效磷增量為0.35～0.89 mg/L(表2)，而PKO無機磷培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d后，菌株的有效磷增量為0.32～1.17 mg/L(表3).無論是無機磷還是有機磷，有效磷增加量均較少，說明溶磷效果較差.假35在PKO無機磷培養(yǎng)基和蒙金娜培養(yǎng)基中pH有上升的趨勢，其余菌株pH均下降.實驗結果表明5株菌株中培養(yǎng)液pH變化與菌株有效磷增量沒有很好的線性關系.

表2 各菌株在孟金娜培養(yǎng)液中 10 d后有效磷增量、pH值變化

表3 各菌株在PKO培養(yǎng)液中 10 d后有效磷增量、pH值變化

2.5 細菌分子生物學鑒定

通過對菌株抗病能力、分泌IAA能力的測定，最終篩選出了3株抗性活性菌株.使用細菌基因組DNA快速抽提試劑盒分別提取這3株細菌的DNA，經(jīng)通用引物16S和專用引物gyrA擴增后，對擴增片段進行回收.將回收的片段送至上海生工測序.測序得到J67、TP54和TP58分別為1 489，1 489，1 490 bp和940，934，929 bp 的片段.將所測的16SrDNA序列與NCBI數(shù)據(jù)庫收錄的序列進行基因比對和同源性分析，構建系統(tǒng)進化樹(圖5、圖6)，確定分離的菌株為貝萊斯芽孢桿菌(Bacillusvelezensis).

3 小結與討論

徐劉平等[18，19]發(fā)現(xiàn)拮抗細菌對病原菌可以起到抗生、與病原菌競爭營養(yǎng)以及寄生和降解植物病原菌細胞的能力，也可以分泌一些生長物質來促進植株的生長.宋文欣[20]等篩選出一株枯草芽孢桿菌可以同時產(chǎn)生纖維素酶、蛋白質酶和β-1，3-葡聚糖酶來抑制病原菌的生長，防治桑枝枯菌核病病菌效果達85.71%.本試驗從鐵炮百合和卷丹百合等根際土中分離到TP54、TP58、J67等菌株，對百合尖孢鐮刀菌抑制作用較好，且具有分泌IAA和溶磷能力，通過形態(tài)學和分子生物學鑒定3個菌株為貝萊斯芽孢桿菌Bacillusvelezensis，3個菌株具有較好的生防潛力，其作用機理有待進一步研究.

圖5 TP54、TP58、J67基于16s序列采用最大擬然法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

圖6 TP54、TP58、J67基于gyrA序列采用最大擬然法構建的系統(tǒng)發(fā)育樹

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