降糖舒心方混懸液灌胃對大鼠糖尿病心力衰竭的治療作用及其機(jī)制

蔣曉鳳，陳佳俊，黃光明，申亞亞，符顯昭

1 右江民族醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院，廣西百色 533000；2 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院康復(fù)醫(yī)學(xué)科；3 右江民族醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中醫(yī)科

糖尿?。―M）是一組由遺傳因素和環(huán)境因素共同引起的代謝性疾病，隨著生活方式的改變以及人口老齡化的加快，DM 的患病率呈上升趨勢，據(jù)世界衛(wèi)生組織預(yù)測，到2030 年DM 將成為第七大死亡原因［1］。研究［2］表明，DM 是心力衰竭（HF）的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，使患HF 的風(fēng)險(xiǎn)增加2～5 倍。DM 引起HF 的病因病機(jī)包括高血糖、高血脂、炎癥反應(yīng)、心臟自主神經(jīng)失調(diào)等［3］。目前，針對DHF的治療尚無特效藥，西藥治療主要集中在降糖方面，通過控制血糖緩解疾病，但西藥治療存在較多不良反應(yīng)，存在容易產(chǎn)生藥物依賴性等缺點(diǎn)。中藥治療具有多靶點(diǎn)、多途徑和不良反應(yīng)相對較小的優(yōu)勢，因此探索中醫(yī)藥治療DHF具有重要意義。降糖舒心方具有“滋陰益氣、活血解毒”的作用，可改善DM 代謝紊亂，提高抗氧化應(yīng)激能力，通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡通路緩解心肌細(xì)胞凋亡，對DM 大鼠心肌損傷具有保護(hù)作用［4］。2022 年7 月—2023 年2 月，我們觀察了降糖舒心方混懸液灌胃對大鼠DHF 的治療作用，并探討其可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD 雄性大鼠50 只，體質(zhì)量（230 ±10）g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證編號為SCXK（桂）2014-002。飼養(yǎng)于右江民族醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，溫度（23 ± 2）℃，濕度45%～60%，光照/黑暗各12 h循環(huán)，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d。

1.2 主要試劑與儀器 鏈脲佐菌素（北京華越洋生物公司），血糖測試儀（上海玉研科學(xué)儀器有限公司），高脂飼料（江蘇省協(xié)同生物工程有限公司），格列喹酮（北京萬輝雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司），貝那普利（北京諾華制藥有限公司），CRP、IL-6、TNF-α試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），LDH、CK-MB檢測試劑盒（南京建成科技有限公司），HE 染色試劑盒（碧云天生物技術(shù)有限公司），Western blot 試劑盒（武漢三鷹有限公司），全自動(dòng)生化儀（深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司），酶標(biāo)儀（深圳市匯松科技發(fā)展有限公司），光學(xué)顯微鏡（日本奧林巴斯公司），凝膠成像系統(tǒng)（廣州市科之藍(lán)儀器公司）。

1.3 降糖舒心方浸膏制備 取人參10 g、麥冬12 g、五味子10 g、黃芪18 g、生地15 g、山藥15 g、山茱萸10 g、大黃5 g、黃連8 g、丹參12 g，浸泡半小時(shí)，煎煮1.5h，將濃縮藥液轉(zhuǎn)移至烘干箱中，90 ℃烘干36 h，制成浸膏，每1 g 相當(dāng)于原生藥10 g，滅菌后保鮮膜密封放入-20 ℃冰箱保存。

1.4 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組、DHF 模型制備及降糖舒心方混懸液灌胃方法 將50 只SD 大鼠隨機(jī)分為5 組各10 只，低劑量組、高劑量組、西藥組、模型組制備DHF模型，對照組不制備DHF模型。DHF模型制備方法：低劑量組、高劑量組、西藥組、模型組一次性腹腔注射鏈脲佐菌素50 mg/kg，72 h 后檢測大鼠空腹血糖值，連續(xù)兩次FBG≥16.7 mmol/L 表明DM 大鼠造模成功。隨后DM 大鼠禁食12 h，不禁水。HF 的制模方法參照文獻(xiàn)［5］，腹腔注射8%戊巴比妥鈉2 mL/kg，麻醉DM 大鼠，打開腹腔，暴露腹主動(dòng)脈，在腹主動(dòng)脈上放置7 號針，用手術(shù)線結(jié)扎腹主動(dòng)脈和7 號針，然后將7 號針拔出，縮窄腹主動(dòng)脈60%～70%，術(shù)后進(jìn)行3 天青霉素腹腔注射抗感染治療。8周后進(jìn)行超聲檢查大鼠左室射血分?jǐn)?shù)（LVEF），LVEF<45%即為DHF模型建立成功。室溫下解凍浸膏，將其至于EP管中，加入生理鹽水，經(jīng)渦旋震蕩配置成2 mL 混懸液。低劑量組灌胃給予1.0 g/（kg·d）的降糖舒心方混懸液，高劑量組灌胃給予1.5 g/（kg·d）的降糖舒心方混懸液，西藥組灌胃給予格列喹酮和貝那普利（二藥配成等體積溶液），連續(xù)灌胃2個(gè)月，高脂飼料喂養(yǎng)；對照組給予普通飼料喂養(yǎng)。

1.5 大鼠FBG及血清TG、LDL-C、HDL-C、CRP、IL-6、TNF-α、CK-MB、LDH 檢測 每組取10 只大鼠，末次給藥后，禁食12 h，可飲水，用8%戊巴比妥鈉，按照2 mL/kg 麻醉大鼠，用注射器抽取腹主動(dòng)脈血，4 ℃低溫靜置后，3 000 r/min 離心15 min，取上清。分裝、標(biāo)記后置于-80 ℃冰箱。采用血糖測試儀檢測FBG，全自動(dòng)生化儀測定血清TG、LDL-C、HDL-C，按照ELISA 試劑盒說明書檢測血清CK-MB、LDH、CRP、IL-6、TNF-α。

1.6 大鼠心肌組織病理形態(tài)觀察 采用HE 染色方法?！?.5”中的大鼠取血完成后處死，冰上迅速進(jìn)行心臟取材，0.9%氯化鈉溶液漂洗，洗凈血液，濾紙擦干，一部分用于HE 染色，即心肌組織按4%多聚甲醛固定，制作石蠟切片，厚度為4 μm，切片經(jīng)二甲苯、無水乙醇和95%、80%、70%乙醇依次處理后，經(jīng)蘇木精染液浸染5 min，自來水沖洗約1～2 min，1%HCI 溶液分化10 s，自來水沖洗藍(lán)化10～30 min，伊紅浸染2～5 min；再次進(jìn)行梯度酒精、二甲苯脫水、透明，最后中性樹膠封片，每只大鼠取3張切片，每張切片隨機(jī)選取5 個(gè)視野在顯微鏡下觀察；細(xì)胞核呈藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)、肌纖維、膠原纖維等呈深淺不同的紅色。另一部分，用眼科剪剪碎心肌組織，用RIPA 裂解液提取蛋白，定量、分裝、標(biāo)記后置于-80 ℃冰箱，用于蛋白的測定。

1.7 大鼠心肌組織NF-κB p65、IκBα 蛋白檢測采用Western blot 法。取“1.6”中的另一部分心肌組織，充分裂解勻漿后，在冰上靜置0.5 h，用離心機(jī)以12 000 r/min 速度離心15 min，取上清，準(zhǔn)備蛋白標(biāo)準(zhǔn)品、配置BCA 工作液進(jìn)行蛋白含量測定，將50 μg 蛋白樣品上樣，進(jìn)行SDS-PAGE 電泳和轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，先于一抗4 ℃孵育過夜，TBST 清洗3 次，再進(jìn)行二抗孵育1～2 h，TBST 清洗3 次，加入ECL 顯影液進(jìn)行顯影，以GAPDH 為內(nèi)參，用Image J 軟件分析膜上目的蛋白相對表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS24.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠FBG 及血清TG、LDL-C、HDL-C 水平比較 大鼠FBG 及血清TG、LDL-C、HDL-C 水平比較見表1。

表1 各組FBG及血清TG、LDL-C、HDL-C水平比較（mmol/L，± s）

表1 各組FBG及血清TG、LDL-C、HDL-C水平比較（mmol/L，± s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與西藥組比較，cP<0.05。

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2.2 各組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平比較 大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平比較見表2。

表2 各組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平比較（± s）

表2 各組大鼠血清CRP、TNF-α、IL-6水平比較（± s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與西藥組比較，cP<0.05。

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2.3 各組大鼠血清CK-MB、LDH 水平比較 大鼠血清CK-MB、LDH水平比較見表3。

表3 各組大鼠血清CK-MB、LDH水平比較（U/L，± s）

表3 各組大鼠血清CK-MB、LDH水平比較（U/L，± s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05；與西藥組比較，cP<0.05。

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2.4 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)比較 對照組大鼠心肌組織心肌細(xì)胞形態(tài)正常，排列整齊，細(xì)胞間隙正常，邊界清晰，未見明顯的炎細(xì)胞及纖維化；與對照組比較，模型組大鼠心肌組織損傷嚴(yán)重，心肌細(xì)胞排列雜亂無序，細(xì)胞腫脹和壞死，間隙模糊，部分可見炎性細(xì)胞聚集；與模型組比較，低劑量組、高劑量組、西藥組大鼠心肌損害均不同程度緩解，其中高劑量組大鼠心肌損害程度明顯降低，心肌細(xì)胞形態(tài)較正常，炎癥細(xì)胞浸潤明顯減輕，心肌細(xì)胞排列較整齊。見圖1。

圖1 各組大鼠心肌組織病理形態(tài)比較（×400）

2.5 各組大鼠心肌組織NF-κB p65、IκBα 蛋白表達(dá)比較 大鼠心肌組織NF-κB p65、IκBα 蛋白表達(dá)比較見表4。

表4 各組大鼠心肌組織NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)比較（± s）

表4 各組大鼠心肌組織NF-κB p65、IκBα蛋白表達(dá)比較（± s）

注：與對照組比較，aP<0.05；與模型組比較，bP<0.05。

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3 討論

研究［6］表明，DM 會(huì)增加患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，約為非DM 人群的2.5 倍。HF 是DM 心血管并發(fā)癥之一，是由多種原因?qū)е滦呐K結(jié)構(gòu)和（或）功能的異常改變，使心室收縮和（或）舒張功能發(fā)生障礙，從而引起的一組復(fù)雜臨床綜合征，代表了大多數(shù)心血管疾病的終末階段，主要表現(xiàn)為呼吸困難、疲勞、和液體潴留（肺淤血、體循環(huán)淤血及外周水腫）等［7］。研究［8］發(fā)現(xiàn)，DM 引起心肌損害導(dǎo)致HF 的發(fā)生其演變過程包括三個(gè)階段，第一階段無明顯臨床癥狀，其特征為代謝信號傳導(dǎo)受損和心臟能量利用改變；第二階段通過臨床影像學(xué)檢查可發(fā)現(xiàn)左心室肥厚、心肌纖維化等心肌結(jié)構(gòu)重塑表現(xiàn)，無典型的HF 癥狀；第三階段出現(xiàn)收縮功能障礙及明顯的心衰癥狀。目前，臨床上用于治療DHF 的降糖藥物如噻唑烷二酮類、磺酰脲類、胰島素等可降低血糖，但同時(shí)可引發(fā)和加重HF的發(fā)展［9］，由此可知西藥干預(yù)DHF具有局限性。中醫(yī)藥在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，具有多方面、多層次的調(diào)節(jié)作用，因此探索中醫(yī)藥治療DHF 具有重要意義。

降糖舒心方由黃芪、人參、地黃、麥冬、山茱萸、丹參、大黃、黃連、五味子、山藥等中藥組成，其中人參、麥冬、五味子是生脈散成分，山藥、山茱萸、地黃是左歸丸成分，兩方皆為補(bǔ)益方劑，具有補(bǔ)腎陰、補(bǔ)心氣、滋陰生津的作用；大黃、黃連是泄心湯的主要成分，具有清熱解毒的功效，丹參清心除煩、活血化瘀，黃芪健脾補(bǔ)氣、益衛(wèi)固表，全方滋陰益氣、活血解毒、扶正祛邪、攻補(bǔ)兼施［10］。DM 狀態(tài)下，可出現(xiàn)高糖、高脂表現(xiàn)，本次研究發(fā)現(xiàn)模型組中FBG、TG、LDL-C 水平升高，HDL-C 水平下降，與DM 的一般表現(xiàn)相符。文獻(xiàn)［11-12］報(bào)道，CRP、IL-6、TNF-α 炎癥因子反應(yīng)體內(nèi)炎癥水平，其水平增加可誘導(dǎo)并反映DM 大鼠心肌損傷。CK-MB、LDH 是心肌損傷標(biāo)志物，與心肌損傷呈正相關(guān)［13］。

本研究顯示，與對照組比較，其余4 組大鼠FBG及血清TG、LDL-C、CRP、IL-6、TNF-α、CK-MB、LDH水平升高，血清HDL-C 水平下降，心肌組織損傷嚴(yán)重；與模型組比較，低劑量組、高劑量組、西藥組FBG及血清TG、LDL-C、CRP、IL-6、TNF-α、CK-MB、LDH水平下降，血清HDL-C 水平升高，心肌組織損傷減輕；與西藥組比較，高劑量組FBG及血清TG、LDL-C、CRP、IL-6、TNF-α、CK-MB、LDH 水平下降，血清HDL-C 水平升高，心肌組織損傷減輕。表明降糖舒心方具有改善DHF 大鼠高糖、高脂狀態(tài)、減輕炎癥反應(yīng)、緩解心肌損害的作用，其中高劑量組的治療效果優(yōu)于西藥組。

核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB由兩個(gè)亞基p50和p65組成，是炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵介質(zhì)，靜息狀態(tài)下IκB 蛋白與二聚體NF-κB 緊密結(jié)合，阻止NF-κB 與DNA 結(jié)合，使其處于失活狀態(tài)［14-15］。研究［16］表明，DM 狀態(tài)下高血糖、高血脂、晚期糖基化終產(chǎn)物、氧化應(yīng)激、炎癥因子等可通過經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑激活NF-κB信號通路，NF-κB 的激活可誘導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙、心肌纖維化、肥大、細(xì)胞凋亡，促進(jìn)糖尿病心肌?。―CM）的發(fā)生。WANG等［17］通過對1型糖尿?。═1DM）小鼠心臟組織進(jìn)行RNA 測序和KEGG 富集分析，發(fā)現(xiàn)NF-κB信號通路在T1DM 模型中表達(dá)上調(diào)，基于這些結(jié)果，利用Western blot 檢測小鼠心臟組織中NF-κB P65和IκBα 的蛋白表達(dá)，結(jié)果標(biāo)明NF-κB P65 蛋白表達(dá)升高，IκBα 蛋白表達(dá)下降，抑制NF-κB 信號通路的活化，可減輕炎癥反應(yīng)，減輕DCM 的心臟肥大、纖維化。同樣的結(jié)果在高脂飼養(yǎng)的2 型糖尿病模型和高糖處理的H9c2 細(xì)胞中也得到了證實(shí)。張弛等［18］通過體內(nèi)體外實(shí)驗(yàn)亦證實(shí)鳶尾素通過抑制NF-κB信號通路的活化，可發(fā)揮保護(hù)DM 心肌損傷的作用。由此可知，NF-κB 信號通路在DM 心臟病中扮演重要角色。本研究顯示，與對照組比較，NF-κB p65 蛋白表達(dá)升高，IκBα 蛋白表達(dá)下降；與模型組比較，低劑量組、高劑量組、西藥組NF-κB p65 蛋白表達(dá)下降，IκBα 蛋白表達(dá)升高；表明降糖舒心方能夠抑制NF-κB 信號通路，進(jìn)而改善DHF大鼠的心肌損傷?？傊?，降糖舒心方具有降糖、降脂、減輕炎癥反應(yīng)，改善心肌損傷，對DHF 具有治療作用，其機(jī)制可能為抑制NF-κB信號通路有關(guān)。