人OC細(xì)胞系細(xì)胞miR-211-5p表達(dá)、轉(zhuǎn)染miR-211-5p模擬物后的增殖及遷移侵襲和EMT觀察

楊立芬，何建清，尹立新

1 唐山市婦幼保健院婦產(chǎn)科，河北唐山 063000；2 唐山市南湖醫(yī)院外科

卵巢癌（OC）是世界上最常見(jiàn)的婦科惡性腫瘤之一，早期患者經(jīng)治療預(yù)后相對(duì)較好，但由于早期診斷準(zhǔn)確率較低，大多數(shù)患者明確診斷時(shí)已經(jīng)處于晚期，因此病死率較高［1］。近年來(lái)，雖然在包括手術(shù)、放化療在內(nèi)的OC 治療取得了巨大進(jìn)展，但OC 患者的5年生存率仍不能令人滿意［2］。因此，迫切需要探索OC 發(fā)病進(jìn)展的分子機(jī)制，尋找潛在的治療靶點(diǎn)，以提高晚期OC 患者的生存率。SKOV3、A2780、HO8910 細(xì)胞是人OC 細(xì)胞系，為目前較常見(jiàn)的應(yīng)用于OC 實(shí)驗(yàn)研究的細(xì)胞株，其中SKOV3 是從一位OC患者的腹腔積液分離得到，廣泛應(yīng)用于OC 的細(xì)胞學(xué)功能研究。研究［3-4］顯示，miRNA 的異常表達(dá)、分布與許多疾病的發(fā)病及進(jìn)展密切相關(guān)，miRNA 的發(fā)現(xiàn)被認(rèn)為給腫瘤治療帶來(lái)更好的前景。微小RNA-211-5p（miR-211-5p）是近年發(fā)現(xiàn)的與癌癥相關(guān)的miRNA 家族成員之一，其在許多惡性腫瘤組織和細(xì)胞中表達(dá)降低，發(fā)揮抑癌基因作用［5］。但至今miR-211-5p在OC中的研究甚少，且機(jī)制尚不明確。2022年6—12 月，我們觀察了人OC 細(xì)胞系細(xì)胞miR-211-5p 表達(dá)，以及轉(zhuǎn)染miR-211-5p 模擬物（miR-211-5p mimics）后的增殖及遷移侵襲和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系及主要試劑 人OC 細(xì)胞系SKOV3、A2780、HO8910 細(xì)胞及人正常卵巢上皮IOSE80 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC 公司。TRIzol 抽取試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；Prime ScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Master Mix 試劑盒購(gòu)自日本TAKARA 公司；Transwell 小室購(gòu)自美國(guó)Corning 公司；基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD 公司；所有PCR 引物、miR-211-5p mimics、miR-NC、殼多糖酶3 樣蛋白1（CHI3L1）-wt、CHI3L1-mut購(gòu)自上海吉瑪制藥公司；Lipofectamine 3000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司；雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；CHI3L1、E-Cadherin、N-cadherin、Fibronectin、GAPDH 一抗及二抗IgG 購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司。

1.2 SKOV3、A2780、HO8910、IOSE80 細(xì)胞中miR-211-5p 檢測(cè) SKOV3、A2780、HO8910、IOSE80 細(xì)胞均在含10%胎牛血清（FBS）的DMEM/F12培養(yǎng)基中培養(yǎng)（37 ℃、95%濕度、5%CO2環(huán)境），待細(xì)胞融合度為70%～80%時(shí)，應(yīng)用胰蛋白酶消化細(xì)胞，取傳3 代的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞miR-211-5p。用TRIzol 試劑提取SKOV3、A2780、HO8910、IOSE80 細(xì)胞總RNA，分光光度計(jì)檢測(cè)RNA 質(zhì)量和濃度復(fù)合要求，應(yīng)用Prime-ScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以合成的cDNA 為模板，加入相關(guān)引物，應(yīng)用SYBR Green Master Mix 試劑盒配置反應(yīng)體系，進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)并檢測(cè)。PCR 引物序列如下：miR-211-5p 上游序列：5'-CTCGAGTAACCGTATTGTTCGCGTCATGCCAGCA-3'，下游序列：5'-GCGGCCGCCAGACCATGTGTCCCATTTG-3'；U6 上游序列：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，下游序列：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、30 s，一共進(jìn)行40 個(gè)循環(huán)。U6 作為內(nèi)參基因，以2-ΔΔCt法計(jì)算miR-211-5p 的表達(dá)水平。選擇miR-211-5p 表達(dá)水平最低的OC 細(xì)胞系進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)。

1.3 SKOV3 細(xì)胞分組、轉(zhuǎn)染及轉(zhuǎn)染效率檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SKOV3 細(xì)胞，接種于6 孔板，細(xì)胞密度為1×104個(gè)/孔，根據(jù)轉(zhuǎn)染物的不同分為高表達(dá)組和對(duì)照組，高表達(dá)組SKOV3 細(xì)胞應(yīng)用Lipofectamine 3000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將miR-211-5p 模擬物miR-211-5p mimics轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，對(duì)照組應(yīng)用Lipofectamine 3000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將陰性對(duì)照miRNC 轉(zhuǎn)染至細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染后6 h 更換培養(yǎng)液，轉(zhuǎn)染后24 h 收集細(xì)胞，qRT-PCR 法檢測(cè)各組細(xì)胞中miR-211-5p 水平，確定miR-211-5p 模擬物轉(zhuǎn)染效率。高表達(dá)組和對(duì)照組細(xì)胞中miR-211-5p 的表達(dá)水平分別為3.58 ± 0.29、1.01 ± 0.03，高表達(dá)組細(xì)胞中miR-211-5p 的表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P<0.05），證明miR-211-5p 模擬物轉(zhuǎn)染效率較高，細(xì)胞符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

1.4 轉(zhuǎn)染miR-211-5p 模擬物的SKOV3 細(xì)胞增殖活性檢測(cè) 采用CCK-8 實(shí)驗(yàn)。將SKOV3 細(xì)胞按照“1.3”所述方法分組及轉(zhuǎn)染24 h 后，收集兩組SKOV3 細(xì)胞，以5×103個(gè)/孔的細(xì)胞密度均勻接種于96 孔板，繼續(xù)培養(yǎng)每隔24 h 向每孔加入10 μL 的CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育2 h 后，用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm處的光密度（OD）值。細(xì)胞增殖活性以O(shè)D值表示。

1.5 轉(zhuǎn)染miR-211-5p 模擬物的SKOV3 細(xì)胞遷移能力檢測(cè) 采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)。將SKOV3 細(xì)胞按照“1.3”所述方法分組及轉(zhuǎn)染24 h 后，收集兩組SKOV3 細(xì)胞，無(wú)血清培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，各組取等量細(xì)胞接種至6 孔板，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞至鋪滿整個(gè)細(xì)胞板孔面，用規(guī)格200 μL 的無(wú)菌移液槍頭垂直于細(xì)胞板自上而下做“1”字形直線劃痕，PBS 將因劃掉的細(xì)胞沖洗干凈，加入無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基同樣條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察并計(jì)算細(xì)胞移動(dòng)距離百分比，細(xì)胞移動(dòng)距離百分比=（0 h 劃痕間距-24 h 劃痕間距）/0 h 劃痕間距×100%。細(xì)胞遷移能力以細(xì)胞劃痕移動(dòng)距離百分比表示。

1.6 轉(zhuǎn)染miR-211-5p 模擬物的SKOV3 細(xì)胞侵襲能力檢測(cè) 采用Transwell 侵襲實(shí)驗(yàn)。將SKOV3 細(xì)胞按照“1.3”所述方法分組及轉(zhuǎn)染24 h 后，收集兩組SKOV3 細(xì)胞，無(wú)血清細(xì)胞培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制備細(xì)胞密度為1×105個(gè)/mL的細(xì)胞懸液，將含20%胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)基加入Transwell 下室，在預(yù)先包被Mgtrigel 基質(zhì)膠的Transwell 上室中加入300 μL 兩組細(xì)胞懸液，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h后取出小室，去除小室膜上表面的未侵入細(xì)胞，4%甲醛固定小室膜下表面的侵入細(xì)胞，結(jié)晶紫溶液染色細(xì)胞，倒置高倍顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)侵入細(xì)胞的數(shù)。細(xì)胞侵襲能力以侵入細(xì)胞數(shù)表示。

1.7 轉(zhuǎn)染miR-211-5p 模擬物的SKOV3 細(xì)胞CHI3L1 及EMT 相關(guān)蛋白檢測(cè) 采用Western blotting 法檢測(cè)。將SKOV3 細(xì)胞按照“1.3”所述方法分組及轉(zhuǎn)染24 h 后，收集兩組SKOV3 細(xì)胞，RIPA 裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白，BCA 法檢測(cè)蛋白濃度。蛋白樣品行SDS-PAGE電泳（120 V，90 min），將蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)至PVDF 膜上（50 V，120 min），將膜放置于含5%脫脂奶粉的封閉液中封閉1 h，然后加入CHI3L1抗體（1︰1 000 稀釋）、E-Cadherin 抗體（1︰2 000 稀釋）、N-Cadherin 抗體（1︰2 000 稀釋）、Fibronectin 抗體（1︰2 000 稀釋）、GAPDH 抗體（1︰10 000 稀釋），4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜后加入二抗IgG，室溫繼續(xù)孵育1 h，ECL 發(fā)光、顯影，拍照，Gel-Pro Analyzer 凝膠圖像處理軟件分析蛋白條帶的灰度值。蛋白的表達(dá)水平以灰度值比值表示。

1.8 miR-211-5p與CHI3L1負(fù)向調(diào)控靶向匹配關(guān)系驗(yàn)證 采用雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。將SKOV3細(xì)胞種于96 孔細(xì)胞板上，應(yīng)用Lipofectamine 3000 脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑將miR-211-5p mimics 或miR-NC 與CHI3L1 野生型雙熒光素酶報(bào)告載體CHI3L1-wt 或CHI3L1 突變型雙熒光素酶報(bào)告載體CHI3L1-mut 共轉(zhuǎn)染入SKOV3 細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后細(xì)胞分為miR-211-5p mimics + CHI3L1-wt 組、miR-NC + CHI3L1-wt 組、miR-211-5p mimics + CHI3L1-mut 組、miR-NC +CHI3L1-mut 組，轉(zhuǎn)染24 h 后收集并裂解細(xì)胞，應(yīng)用熒光素酶試劑盒檢測(cè)各組細(xì)胞的熒光素酶活性。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人OC細(xì)胞系及正常卵巢上皮細(xì)胞miR-211-5p相對(duì)表達(dá)量比較 SKOV3、A2780、HO8910、IOSE80細(xì)胞miR-211-5p 相對(duì)表達(dá)量分別為0.56 ± 0.11、0.68± 0.13、0.64 ± 0.09、1.04 ± 0.05，SKOV3、A2780、HO8910 細(xì)胞分別與IOSE80 細(xì)胞比較（P均<0.05）。人OC 細(xì)胞系中SKOV3 細(xì)胞miR-211-5p 表達(dá)水平最低，因此選擇SKOV3 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 兩組不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞OD 值比較 不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞OD值比較見(jiàn)表1。

表1 兩組不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞OD值比較（± s）

表1 兩組不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞OD值比較（± s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

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2.3 兩組細(xì)胞移動(dòng)距離百分比比較 高表達(dá)組和對(duì)照組細(xì)胞移動(dòng)距離百分比分別為52.4% ± 3.9%、83.6% ± 3.7%，兩組比較，P<0.05。

2.4 兩組侵入細(xì)胞數(shù)比較 高表達(dá)組和對(duì)照組侵入細(xì)胞數(shù)分別為（126 ± 21）個(gè)、（268 ± 39）個(gè)，兩組比較，P<0.05。

2.5 兩組EMT 相關(guān)蛋白灰度值比值比較 EMT 相關(guān)蛋白灰度值比值比較見(jiàn)表2。

表2 兩組EMT相關(guān)蛋白灰度值比值比較（± s）

表2 兩組EMT相關(guān)蛋白灰度值比值比較（± s）

注：與對(duì)照組比較，*P<0.05。

?

2.6 miR-211-5p對(duì)CHI3L1的靶向匹配關(guān)系驗(yàn)證結(jié)果 高表達(dá)組和對(duì)照組SKOV3 細(xì)胞中CHI3L1 蛋白表達(dá)水平分別為0.33 ± 0.08、0.68 ± 0.11，兩組比較，P<0.05。miR-211-5p mimics + CHI3L1-wt 組、miR-NC + CHI3L1-wt組、miR-211-5p mimics + CHI3L1-mut組、miR-NC + CHI3L1-mut 組細(xì)胞相對(duì)熒光素酶活性分別為0.44 ± 0.08、0.98 ± 0.04、0.99 ± 0.03、1.02 ± 0.04，miR-211-5p mimics + CHI3L1-wt 組和miR-NC + CHI3L1-wt組比較，P<0.05。

3 討論

OC是全球女性相關(guān)死亡的主要原因之一，常見(jiàn)于50 歲以上的女性，其發(fā)病率在婦科惡性腫瘤中排名第4，病死率在婦科癌癥中排名第二，并且近年來(lái)其發(fā)病率有上升趨勢(shì)，是目前世界范圍內(nèi)嚴(yán)重影響女性健康和生命的常見(jiàn)婦科惡性腫瘤。手術(shù)、化療和放療是目前OC 最常見(jiàn)的傳統(tǒng)治療方法，但由于OC早期缺乏特異性癥狀，很多患者確診時(shí)已經(jīng)處于晚期，目前的診療方法效果較差，患者預(yù)后不能令人滿意。SKOV3、A2780、HO8910 細(xì)胞是目前較常應(yīng)用于OC 實(shí)驗(yàn)研究的細(xì)胞株，其中SKOV3 是從一位OC 患者的腹腔積液分離得到，是良好轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，適合OC 的細(xì)胞學(xué)功能研究。OC 的發(fā)生和進(jìn)展是一個(gè)復(fù)雜而漸進(jìn)的過(guò)程，與基因突變和信號(hào)通路異常等多種因素有關(guān)。隨著基礎(chǔ)和臨床研究的進(jìn)展，人們對(duì)OC 的發(fā)展和進(jìn)展機(jī)制有了更深入的了解，但近幾十年來(lái)OC 患者的生存和預(yù)后并沒(méi)有明顯改善。因此，OC患者的治療仍然是一個(gè)重大的臨床挑戰(zhàn)，尚需要在分子水平上對(duì)腫瘤發(fā)生和新療法進(jìn)行進(jìn)一步研究。

miRNA 是一種長(zhǎng)度為20～22 個(gè)核苷酸非編碼單鏈RNA，在進(jìn)化上具有高度保守性，能夠調(diào)控下游靶基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、凋亡和增殖等生命活動(dòng)，參與機(jī)體的生理病理活動(dòng)［6］。近年來(lái)越來(lái)越多的轉(zhuǎn)錄組學(xué)和基因組學(xué)研究證據(jù)表明，miRNA 的異常表達(dá)與OC 腫瘤發(fā)生之間存在相關(guān)性［7］。DIRIMTEKIN 等［8］報(bào)道，miR-34a 可能作為提高OC 早期診斷效率的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，并且過(guò)表達(dá)miR-34a 可能通過(guò)靶向FOXP1 來(lái)抑制OC 的發(fā)病及進(jìn)展。miR-590-5p 被發(fā)現(xiàn)通過(guò)靶向hMSH2基因促進(jìn)OC 對(duì)順鉑的耐藥性［9］。miR-211-5p 是近期發(fā)現(xiàn)的腫瘤相關(guān)miRNA 家族重要成員之一，研究發(fā)現(xiàn)其在膀胱癌［10］、腎癌［11］、甲狀腺癌［12］、肝細(xì)胞癌［13］等多種惡性腫瘤中均表達(dá)異常，可能參與腫瘤的發(fā)生進(jìn)展。近年來(lái)研究［14-15］顯示，miR-211-5p 在調(diào)控惡性腫瘤EMT 過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。EMT過(guò)程是上皮細(xì)胞喪失上皮特性，獲得間充質(zhì)表型的過(guò)程，是腫瘤細(xì)胞獲得生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移等腫瘤惡性表型的關(guān)鍵過(guò)程，為惡性腫瘤發(fā)生進(jìn)展的重要環(huán)節(jié)［16］。并且近期研究發(fā)現(xiàn)，miR-211-5p 能夠靶向調(diào)控CHI3L1 基因表達(dá)從而調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為［17］。CHI3L1 是一種分泌型糖蛋白，位于人1 號(hào)染色體q32 的高度保守區(qū)域。近期研究［18-20］表明，CHI3L1在包括OC在內(nèi)的眾多腫瘤中表達(dá)異常高表達(dá)，并且其高表達(dá)與患者轉(zhuǎn)移、化療藥物抵抗及不良預(yù)后有關(guān)。LIN 等［21］發(fā)現(xiàn)OC 患者CHI3L1 高表達(dá)與患者的不良結(jié)局和化療耐藥性相關(guān)，CHI3L1顯著增強(qiáng)OC 細(xì)胞的干細(xì)胞特性。較多的既往研究及本課題組前期研究結(jié)果已證實(shí)，抑制CHI3L1表達(dá)能夠抑制OC 細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲、EMT 及腫瘤血管生成［22-24］。從以上研究結(jié)果可以看出，miR-211-5p 在多種腫瘤發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中調(diào)控著腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能，而且其對(duì)腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能的調(diào)控可能與靶向調(diào)控CHI3L1有關(guān)。但至今，miR-211-5p在OC中的研究較少，并且作用機(jī)制尚不清楚。

本研究顯示，miR-211-5p 在SKOV3、A2780、HO8910 細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯低于IOSE80 細(xì)胞，提示miR-211-5p 可能在OC 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著抑癌基因的作用；本研究還發(fā)現(xiàn)，上調(diào)SKOV3 細(xì)胞miR-211-5p 表達(dá)后，細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力均被明顯抑制，進(jìn)一步說(shuō)明miR-211-5p 作為抑癌基因在OC 的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用；上調(diào)SKOV3 細(xì)胞miR-211-5p 表達(dá)后，SKOV3 細(xì)胞上皮源性標(biāo)志物E-Cadherin 蛋白的表達(dá)明顯升高，而間質(zhì)源性標(biāo)志物N-Cadherin 和Fibronectin 蛋白的表達(dá)水平明顯降低，說(shuō)明高表達(dá)miR-211-5p 能抑制SKOV3 細(xì)胞的EMT過(guò)程；進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，上調(diào)SKOV3細(xì)胞miR-211-5p表達(dá)后，SKOV3 細(xì)胞中CHI3L1 蛋白的表達(dá)明顯降低；miR-211-5p可以與CHI3L1的3'UTR 區(qū)特異性結(jié)合從而使其熒光素酶活性明顯降低，證明miR-211-5p對(duì)CHI3L1 存在靶向調(diào)控關(guān)系；提示miR-211-5p對(duì)SKOV3 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲及EMT 等腫瘤生物學(xué)特性的影響，可能與其對(duì)CHI3L1基因的靶向調(diào)控有關(guān)。

總之，miR-211-5p 在OC 細(xì)胞系中表達(dá)降低，高表達(dá)miR-211-5p 可抑制SKOV3 增殖、遷移、侵襲及EMT，其機(jī)制是通過(guò)負(fù)向調(diào)控CHI3L1表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。