強骨通痹膠囊對大鼠骨關節(jié)炎炎癥因子的影響及作用機制*

李 浩, 何承建, 張?zhí)斐?/p>

湖北中醫(yī)藥大學第一臨床學院,武漢 430074

骨關節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是由于局部退化和環(huán)境改變等因素引起的一種骨關節(jié)退行性病變[1]。目前西藥治療OA具有起效快和延緩關節(jié)軟骨破壞等優(yōu)勢,但具有較多的不良反應[2]。手術治療的方法雖然能夠矯正關節(jié)畸形并恢復關節(jié)功能,但因為其較高的醫(yī)療費用和感染等風險并沒有得到廣泛的普及[3]。而目前中醫(yī)藥治療OA則有經(jīng)濟簡便、不良反應少和療效顯著等優(yōu)勢[4]。已有研究顯示,多種健骨方可以顯著緩解OA的癥狀并緩解軟骨損傷[5]。其中組方為骨碎補、牛膝、獨活、續(xù)斷、川芎和白芍的強骨通痹膠囊則是治療方法之一。但目前強骨通痹膠囊的組方對骨關節(jié)炎的治療機理尚不清楚。

OA和其他炎癥相似,受到Toll樣受體4(Toll-like receptors 4,TLR4)和核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)調控[6],而其受累的關節(jié)中也存在多種炎性因子的過度表達,這些炎癥因子在OA發(fā)生及發(fā)展的過程中發(fā)揮著至關重要的作用[7]。其中,白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)和白介素6(interleukin-6,IL-6)是關鍵的炎性因子[7]。

許多中藥都被發(fā)現(xiàn)具有影響促炎癥因子表達的作用[8-10],本文猜測,強骨通痹膠囊能夠通過調節(jié)促炎癥因子進而對OA起到治療作用。基于此,本研究構建大鼠骨關節(jié)炎模型,使用強骨通痹膠囊進行治療,探討強骨通痹膠囊對大鼠骨關節(jié)炎炎癥因子的影響和作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康的雄性4～6周齡SPF級SD大鼠42只,實驗動物使用許可證號:SYXK(鄂)2018-0104,于溫度22～26 ℃,相對濕度50%～60%的飼養(yǎng)條件下進行飼養(yǎng),人工光照明暗各12 h。在本次實驗過程中,按照《實驗動物管理條例》等相關文件標準進行飼養(yǎng)與處置。

1.2 試劑

戊巴比妥鈉(貨號P3761,Sigma公司);葡萄糖胺(貨號G1514,Sigma公司);生理鹽水(貨號YM-S2134,上海遠慕生物科技公司);Trizol(貨號15596026,Ambion公司);中性樹脂(貨號為213,上海國藥公司);甲苯胺藍染色液(貨號G1032,Servicebio公司);DAB濃縮型試劑盒,封閉山羊血清(貨號分別為DA1010,SL038,Solarbio公司);蘇木精,20× Tris-EDTA修復液pH 9.0(貨號分別為G1004,G1203,Servicebio公司);IL-1β酶聯(lián)免疫試劑盒,TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒,IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒,TLR4蛋白一抗(貨號分別為RA20020,RA20035,RA20607,PAB33926,Bioswamp公司);大鼠磷酸化核因子(p-NF-κB)蛋白一抗(貨號為Ab32360,Abcam公司);MaxVisionTMHRP-Polymer anti-Mouse/Rabbit IHC Kit(貨號KIT-5020,邁新公司)。

1.3 儀器

熒光定量PCR儀(型號CFX-Connect 96,Bio-Rad公司);正置顯微鏡(型號V116295,尼康公司);正置顯微鏡(型號JZYQ,皆準公司);石蠟切片機(型號API-365,艾普公司);攤片烤片機,生物組織包埋機-冷凍機(型號分別為TK7218,HS-B,恒松公司);生物組織包埋機(型號KH-BL1,孝感闊海公司);自動組織脫水機(型號ZT-12 P2,亞光病理公司);全自動化學發(fā)光分析儀(型號FST-I-05,普力菲爾公司)

1.4 大鼠骨性關節(jié)炎模型的構建

根據(jù)前交叉韌帶切除模型中類似骨關節(jié)炎早期或中期的特點,進行模型構建[11]。采用抽簽法將42只SD大鼠隨機分為2組,對照組6只,造模組36只。用戊巴比妥鈉對SD大鼠腹腔麻醉后,經(jīng)膝關節(jié)內側縱向切口,切斷前交叉韌帶,避開關節(jié)軟骨面,逐層縫合關閉創(chuàng)口。術后每天向每只大鼠手術部位注射丁胺卡那霉素,連續(xù)3 d,籠內自由活動。術后6周大鼠膝骨性關節(jié)炎模型建立。使用HE染色觀察大鼠膝關節(jié)軟骨組織形態(tài)進行模型鑒定。

1.5 動物分組和藥物干預

按抽簽法取造模成功的大鼠18只,隨機分為模型組、強骨通痹膠囊組、葡萄糖胺組,每組6只。對照組和模型組每天灌胃生理鹽水,強骨通痹膠囊組用強骨通痹膠囊水溶液(7.2 mg每公斤體重)灌胃,葡萄糖胺組作為陽性對照組,用葡萄糖胺水溶液(90 mg每公斤體重)灌胃。每天給藥1次,連續(xù)給藥12周后,經(jīng)戊巴比妥鈉麻醉處死,取軟骨組織。

1.6 HE染色觀察大鼠關節(jié)炎軟骨組織形態(tài)

使用蘇木精-伊紅(HE)染色法對OA大鼠進行模型鑒定。取模型大鼠膝關節(jié)于10%中性甲醛中固定48 h后放入脫鈣液中脫鈣,5～7 d更換一次脫鈣液,45 d后查看骨組織脫鈣情況,若骨能用刀切割成片時,說明脫鈣已完成,否則需放入脫鈣液中繼續(xù)脫鈣。脫鈣結束的骨組織用自來水沖洗24 h后常規(guī)步驟脫水浸蠟包埋,切片厚度為3 μm,水浴展片后將切片貼附于載玻片上,然后將切片放入展片器展片,貼平粘緊后烤片。根據(jù)HE染色法對組織切片進行染色,顯微鏡下拍照,Leica Application Suite系統(tǒng)采集樣本相關部位圖片。

1.7 甲苯胺藍染色觀察大鼠關節(jié)炎軟骨組織形態(tài)

同1.6中方法獲取膝關節(jié)切片,以甲苯胺藍染色法對組織切片進行染色,通過顯微鏡拍照,Leica Application Suite圖像系統(tǒng)采集樣本相關部位圖片。

1.8 qRT-PCR法檢測大鼠關節(jié)炎軟骨組織中TLR4、NF-κB的mRNA水平

取大鼠關節(jié)炎軟骨組織100 mg于放有1 mL Trizol的勻漿管中,勻漿機勻漿20 s后放于冰上裂解細胞,抽提總RNA進行反轉錄。再按照SYBR GREEN PCR Kit說明書進行qRT-PCR。引物序列見表1。以GAPDH作為內參,用2-ΔΔCt計算目的基因的相對表達量。

表1 引物序列信息

1.9 免疫組化法檢測關節(jié)炎軟骨組織中TLR4、p-NF-κB水平

同1.6獲取膝關節(jié)切片,二甲苯中脫蠟,水化抗原修復后進行阻斷,用10%山羊血清進行封閉,先后孵育一抗(TLR4、p-NF-κB)、二抗(maxvision),經(jīng)DAB和蘇木精染色后,脫水、透明、封片并通過顯微鏡拍照,Leica Application Suite圖像系統(tǒng)采集樣本相關部位,蘇木精染細胞核為藍色,DAB陽性為棕黃色。

1.10 ELISA檢測大鼠關節(jié)炎軟骨組織中IL-1β、TNF-α、IL-6水平

根據(jù)IL-1β酶聯(lián)免疫試劑盒,TNF-α酶聯(lián)免疫試劑盒以及IL-6酶聯(lián)免疫試劑盒的說明書,對各組大鼠關節(jié)炎軟骨組織中IL-1β、TNF-α、IL-6水平進行檢測。

1.11 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料以均數(shù)±標準差表示,組間均數(shù)比較采用t檢驗,多組間均數(shù)比較使用單因素方差分析,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 OA大鼠模型鑒定

術后6周可觀察到對照組大鼠自主活動和行走正常,模型組大鼠均可正常行走、活動,但自主活動明顯較少。取大鼠關節(jié)軟骨組織進行HE染色,結果(圖1)顯示,與對照組相比,模型組膝關節(jié)可見大量炎性細胞浸潤,滑膜組織明顯增厚,表明OA模型建立成功。

圖1 大鼠膝關節(jié)軟骨組織(HE染色,×200)

2.2 軟骨組織的甲苯胺藍染色結果

圖2顯示,與對照組相比,模型組軟骨組織中的硫酸軟骨素明顯減少,呈現(xiàn)明顯的軟骨素流失狀態(tài),而強骨通痹膠囊組的硫酸軟骨素雖然沒有達到對照組的水平,但相比模型組有一定程度的增加。葡萄糖胺組的硫酸軟骨素比起模型組則增加明顯。

圖中黃色箭頭指向區(qū)域表示硫酸軟骨素被甲苯胺藍異染呈紫紅色

2.3 軟骨組織中NF-κB、TLR4 mRNA表達水平比較

各組軟骨組織中的NF-κB和TLR4的表達水平均有顯著差異(P<0.05)。和對照組相比,模型組的NF-κB、TLR4 mRNA表達水平都明顯上升(均P<0.05);而強骨通痹膠囊組和葡萄糖胺組的NF-κB和TLR4的表達水平比起模型組則明顯下降(均P<0.05),但都明顯高于對照組(均P<0.05)(表2)。

表2 軟骨組織中NF-κB和TLR4 mRNA表達水平比較

2.4 軟骨組織的免疫組化染色結果

圖3和表3顯示,對照組的NF-κB和TLR4的免疫組化染色幾乎呈陰性,而模型組染色明顯(均P<0.05);強骨通痹膠囊組和葡萄糖胺組的NF-κB和TLR4的免疫組化染色強度比起模型組有明顯減弱(均P<0.05)。

圖3 各組的TLR4、NF-κB免疫組化染色結果(×200)

表3 各組免疫組化染色的平均吸光度

2.5 軟骨組織中IL-1β、TNF-α、IL-6濃度比較

和對照組相比,模型組的IL-1β、TNF-α、IL-6濃度都明顯上升(均P<0.05);而強骨通痹膠囊組和葡萄糖胺組的IL-1β、TNF-α、IL-6濃度比起模型組則明顯下降(均P<0.05),但都明顯高于對照組(均P<0.05)(表4)。

表4 軟骨組織中IL-1β、TNF-α、IL-6濃度比較

3 討論

OA屬于中醫(yī)學的骨痹、痹證、筋痹等范疇[12]。骨碎補氣味苦、性溫,歸屬于肝、腎經(jīng),具有補腎強骨、療傷止痛的功效;獨活則能夠祛濕散寒,除痹活絡止痛;而牛膝則能夠強筋健骨固肝腎,這幾種藥材對于OA均有一定的治療效果[13-15]。本次實驗結果顯示,和對照組相比,軟骨組織炎癥模型的硫酸軟骨素明顯減少,但經(jīng)過強骨通痹膠囊和葡萄糖胺分別處理后,硫酸軟骨素明顯增多,說明強骨通痹膠囊的藥效和葡萄糖胺相似,能夠讓軟骨組織的硫酸軟骨素增加,對OA有一定的治療效果,與之前報道的中藥方對關節(jié)炎的治療效果[16]一致。

TLRs被認為是先天免疫和缺血誘導性炎癥的主要因素,是組織損害的關鍵傳感器。氧化應激會通過提高NF-κB mRNA的活性增強TLR-8介導的中性粒細胞的炎癥反應[17]。氧化應激會先提高NF-κB的活性并激活其信號通路,使MyD88激活并介導TLR4胞內信號通路,最終產(chǎn)生促炎因子[6]。OA的發(fā)生發(fā)展與TLR4/NF-κB通路的激活關系密切,該通路的激活顯著促進軟骨細胞的凋亡和炎癥反應[18]。當炎癥因子進入細胞時,TLR4促進MyD88,進而促進NF-κB磷酸化,進一步激活炎癥因子的表達[19]。本次研究發(fā)現(xiàn),模型組的TLR4和NF-κB mRNA的表達水平都顯著高于對照組;但在經(jīng)過強骨通痹膠囊和葡萄糖胺分別處理后,TLR4和NF-κB mRNA的表達水平相較于模型組均有顯著下降;免疫組化結果與之類似,模型組的TLR4和NF-κB染色明顯強于對照組,但強骨通痹膠囊組和葡萄糖胺組的染色則都弱于模型組,表明強骨通痹膠囊和葡萄糖胺的功效相似,能夠抑制TLR4和NF-κB的表達。

除此之外,OA的病癥和與炎癥相關mRNA調控的細胞因子也密切相關。根據(jù)細胞因子在軟骨細胞代謝中所發(fā)揮的作用可將其分為分解性因子和合成性因子,兩種因子之間維持著一種平衡,當這種平衡被打破就會導致骨關節(jié)的軟骨基質被降解、破壞,從而形成骨性關節(jié)炎[20]。研究表明,TLRs被激活后,可通過MyD88活化IL-1受體相關激酶、TGF-β活化激酶,進而激發(fā)IκB激酶級聯(lián)反應,激活核轉錄因子,從而啟動與炎癥免疫有關的IL-1β、TNF-α等基因的表達,產(chǎn)生大量IL-1β、TNF-α等炎性細胞因子[21]。IL-1β和TNF-α是軟骨損傷病變位置分泌的主要細胞因子,主要促進降解軟骨基質的蛋白酶的合成與釋放,參與了軟骨損傷過程[22]。TNF-α還可參與腸道微生物紊亂造成TLR4升高的過程[23]。IL-6是一種由單核吞噬細胞分泌的具有多重生物活性的細胞因子,不但能夠刺激關節(jié)滑膜內的B淋巴細胞,激活自身免疫引導,導致滑膜內發(fā)生炎性反應,還能夠促進軟骨基質降解破壞和抑制軟骨細胞修復合成[24]。且IL-6可被TLR4的下行信號MyD88調控[19]。本次研究發(fā)現(xiàn),和對照組相比,模型組的IL-1β、TNF-α、IL-6濃度明顯上升;而強骨通痹膠囊組和葡萄糖胺組的IL-1β、TNF-α、IL-6濃度比起模型組則明顯下降,表明強骨通痹膠囊和葡萄糖胺的藥效相似,均能夠抑制其中炎癥因子的表達,和早前報道[25]的中藥方對細胞因子的抑制效果相一致。

綜上所述,強骨通痹膠囊能夠通過抑制TLR4和NF-κB的表達,從而抑制炎癥因子的產(chǎn)生,達到治療骨關節(jié)炎的效果。提示了強骨通痹膠囊有作為治療骨關節(jié)炎的藥物的潛力,且其對于炎癥因子誘發(fā)的疾病有一定的治療效果。