STAT4在急性髓系白血病患者中的表達(dá)特征及其臨床意義*

焦一帆, 王 昊, 劉宇辰, 谷振陽, 溫亞男, 王莉莉, 竇立萍

中國人民解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心血液病醫(yī)學(xué)部,北京 100071

急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)是一種以髓系原始細(xì)胞克隆性增殖為主,具有高度異質(zhì)性的血液系統(tǒng)惡性疾病[1-2]。AML是我國十大高發(fā)惡性腫瘤之一,其發(fā)病率在過去的幾十年間持續(xù)上升[3-4],AML患者的生存期在各類急性白血病患者中最短,五年生存率不足30%[5-6]?！?+3”方案、異基因造血干細(xì)胞移植及針對相關(guān)基因突變和表觀遺傳學(xué)異常的分子靶向藥物能夠改善患者臨床預(yù)后,延長患者的生存期,但AML發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性,使這種改善仍存在一定的局限性。因此尋找和發(fā)現(xiàn)新的AML分子靶點(diǎn),加深對AML的認(rèn)識,構(gòu)建針對分子靶點(diǎn)的新療法,對突破這一局限性,進(jìn)一步提高患者治愈率、生存率有極大幫助。

JAK/STAT通路是由激酶Janus(Janus kinase)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活子STAT(signal transducer and activator of transcription)共同構(gòu)成的信號通路,該通路中有用于傳遞抗凋亡、增殖和分化信號的受體,它們參與調(diào)節(jié)造血和造血干細(xì)胞的增殖、存活及自我更新[7-8]。此外,該通路的激活在多種癌細(xì)胞的發(fā)育、增殖、分化和存活中起到關(guān)鍵作用[9-10]。有研究表明,JAK/STAT通路激活參與AML發(fā)病,促進(jìn)白血病細(xì)胞的增殖,增加AML患者對化療藥物耐藥及復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)[11-15]。

本研究整合4個(gè)涵蓋AML患者信息的獨(dú)立研究隊(duì)列,通過對這些隊(duì)列中患者的基因表達(dá)信息、臨床信息、預(yù)后信息進(jìn)行綜合分析,發(fā)現(xiàn)在AML患者中,JAK/STAT通路處于激活狀態(tài)。STAT家族中,STAT4基因的表達(dá)上調(diào)與AML患者不良預(yù)后相關(guān),可以將其視為AML潛在靶標(biāo),為臨床預(yù)后評估和新療法的構(gòu)建提供幫助。

1 材料和方法

1.1 AML數(shù)據(jù)來源

本研究中患者信息來源于不同公共數(shù)據(jù)庫的4個(gè)AML獨(dú)立研究隊(duì)列,這些信息均可通過網(wǎng)絡(luò)下載。

從癌癥基因組圖譜(The Cancer Genome Atlas,TCGA)數(shù)據(jù)庫(https://portal.gdc.cancer.gov)中,選取163例接受轉(zhuǎn)錄組測序的非M3型初治AML患者,下載其基因表達(dá)數(shù)據(jù)和相對應(yīng)的臨床信息。該163例患者均采用阿糖胞苷7 d聯(lián)合去甲氧柔紅霉素或柔紅霉素3 d的“7+3”方案進(jìn)行誘導(dǎo)緩解,誘導(dǎo)緩解后以4～6個(gè)療程的化療或造血干細(xì)胞移植進(jìn)行鞏固治療。

從基因表達(dá)綜合(Gene Expression Omnibus,GEO)數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲取基于GPL96平臺的GSE9476(n=64)、GSE1159(n=121)、GSE6891(n=403)芯片數(shù)據(jù)與臨床信息,除去預(yù)后良好的M3型AML患者數(shù)據(jù)后,做差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs)分析與生存分析。

1.2 差異表達(dá)基因分析

用GEO2R工具(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)分析26例AML患者和38例健康人之間的差異表達(dá)基因(differentially expressed genes,DEGs),根據(jù)P值與差異倍數(shù)(fold change,FC)進(jìn)行篩選,選出Padj≤0.05且FC的對數(shù),|log2FC|≥0.5的基因視為DEGs。利用OmicShare在線工具(http://www.omicshare.com/tools)對DEGs進(jìn)行KEGG信號通路富集分析,篩選可能參與AML致病的信號通路。

1.3 生存分析

為評價(jià)特定基因的預(yù)后價(jià)值,將患者按TCGA和GEO數(shù)據(jù)庫中該基因表達(dá)的中位數(shù)或上四分位數(shù)分為兩組(高表達(dá)組與低表達(dá)組)。利用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn),以總生存期(overall survival,OS)和無事件生存期(event-free survival,EFS)為指標(biāo),在數(shù)據(jù)庫中評價(jià)某特定基因?qū)ML患者預(yù)后的影響。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

運(yùn)用SPSS 22.0(SPSS,美國)、GraphPad Prism 5(GraphPad公司,美國)或R軟件(V3.6.3)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。以STAT4基因表達(dá)量的中位數(shù)為界,將研究隊(duì)列分為高/低表達(dá)組,采用Fisher’s精確檢驗(yàn)和Wilcoxon秩和檢驗(yàn)進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn),使用Kaplan-Meier法和Log-rank檢驗(yàn)進(jìn)行生存分析。在所有統(tǒng)計(jì)結(jié)果中,以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AML患者與健康人差異表達(dá)基因分析

為尋找AML患者與健康個(gè)體間存在表達(dá)差異的基因,本研究對26例急性髓系白血病患者和38例健康人,外周血或骨髓樣本的基因芯片表達(dá)結(jié)果進(jìn)行對比分析,經(jīng)過GEO2R預(yù)處理,鑒定出1266個(gè)具有顯著表達(dá)差異的基因(Padj≤0.05,|log2FC|≥0.5),其中有426個(gè)基因在AML患者中顯著上調(diào),840個(gè)基因在AML患者中顯著下調(diào)(圖1A)。對這1266個(gè)DEGs進(jìn)行KEGG信號通路富集,發(fā)現(xiàn)這些基因主要富集在HTLV-Ⅰ感染、MAPK信號通路、急性髓系白血病、鉑類藥物耐藥、FOXO信號通路、JAK-STAT信號通路等69條通路上(均P<0.05,圖1B)。

A:差異表達(dá)基因的火山圖;B:差異表達(dá)基因的KEGG通路富集

2.2 AML患者JAK家族和STAT家族基因mRNA表達(dá)水平與健康人之間存在差異

分析GSE1159隊(duì)列基因芯片數(shù)據(jù),對比AML患者與健康人之間JAKs和STATs基因表達(dá)水平,發(fā)現(xiàn)AML患者JAK1(P=0.019)、JAK2(P=0.047)和STAT4(P<0.01)基因表達(dá)水平高于健康人,STAT5A(P=0.028)和STAT6(P=0.022)基因表達(dá)水平低于健康人(圖2A)。以各基因表達(dá)量中位數(shù)為界,將隊(duì)列分為高/低表達(dá)組,對每個(gè)基因的高、低表達(dá)組進(jìn)行對比可以發(fā)現(xiàn),所有基因的mRNA表達(dá)水平均存在差異(P<0.05;圖2B)。

A:GSE1159隊(duì)列中JAK/STAT通路關(guān)鍵基因的表達(dá)在AML患者與健康人間存在明顯差異;B:JAK/STAT通路關(guān)鍵基因的mRNA表達(dá)水平在GSE1159隊(duì)列中均存在差異;*P≤0.05,**P≤0.01,*** P≤0.001,****P≤ 0.0001,#P> 0.05

2.3 STAT4基因高表達(dá)的AML患者預(yù)后不良

為評估JAKs和STATs基因?qū)ML患者預(yù)后的影響,以這些基因表達(dá)量中位數(shù)/上四分位數(shù)為界,將TCGA/GSE6891隊(duì)列中的AML患者分為高/低表達(dá)組。經(jīng)單因素生存分析,發(fā)現(xiàn)TCGA數(shù)據(jù)庫中,STAT4高表達(dá)組患者較低表達(dá)組患者有更短的EFS(圖3A,P=0.01)和OS(圖3B,P=0.02);GSE6891隊(duì)列中,STAT4高表達(dá)組患者的EFS(圖3C,P=0.078)和OS(圖3D,P=0.044)也較低表達(dá)組患者短。

A:TCGA數(shù)據(jù)庫患者的EFS;B:TCGA數(shù)據(jù)庫患者的OS;C:GSE6891隊(duì)列患者的EFS;D:GSE6891隊(duì)列患者的OS

由此我們認(rèn)為STAT4高表達(dá)與AML患者較差的預(yù)后正相關(guān),而相較于STAT4,其他JAKs與STATs的mRNA表達(dá)水平與AML患者生存期無關(guān)(表1和表2)。

表1 TCGA數(shù)據(jù)庫中AML患者JAK/STAT通路相關(guān)基因表達(dá)水平的單因素生存分析

表2 GSE6891隊(duì)列中AML患者JAK/STAT通路相關(guān)基因表達(dá)水平的單因素生存分析

2.4 AML患者臨床基線數(shù)據(jù)信息

將163例急性髓系白血病患者以STAT4表達(dá)中位數(shù)為界,分為STAT4低表達(dá)組(n=82)和高表達(dá)組(n=81),兩組患者的臨床基線資料如表3所示。與低表達(dá)組相比,STAT4高表達(dá)組患者年齡更大(P=0.005),60歲以上老年人的STAT4表達(dá)更高(P=0.023);STAT4低表達(dá)組則具有更高的白細(xì)胞計(jì)數(shù)(P=0.006)、外周血原始細(xì)胞比例(P=0.003)和骨髓原始細(xì)胞比例(P=0.011)。在FAB分型中,STAT4在M5型AML患者中的表達(dá)更低(P=0.011),其余FAB分型、年齡及兩組間化療方案等無明顯差異。對比兩組患者間的融合基因與突變基因發(fā)現(xiàn),高表達(dá)組中FLT3-ITD(P=0.044),TP53(P<0.001)的出現(xiàn)率顯著增加,低表達(dá)組中FLT3-TKD(P<0.001),NPM1(P=0.044),NPM1Mut/FLT3-ITDWT(P=0.002)的出現(xiàn)率明顯增加(表3)。對比兩組基因表達(dá)譜可以發(fā)現(xiàn),在高表達(dá)組患者中,ERG(P=0.006),BAALC(P=0.034),MN1(P=0.015),LEF1(P<0.001),DNMT3B(P=0.006),ATP1B1(P=0.034),TCF4(P=0.002),MECOM(P=0.006),P2RY14(P=0.002),TET1(P=0.006),ITGA3(P<0.001)這些基因擁有高表達(dá)的可能性增加,與之相對的低表達(dá)組中INSR(P<0.01)基因的高表達(dá)概率增加(表3)。根據(jù)美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network,NCCN)指南中AML預(yù)后危險(xiǎn)度分級標(biāo)準(zhǔn)(http://www.nccn.org)對163例患者進(jìn)行危險(xiǎn)度分級發(fā)現(xiàn),STAT4在高危組中有更高表達(dá)水平(P=0.014),而在低危組中,STAT4的表達(dá)水平相對較低(P=0.015)。

表3 AML患者臨床信息在STAT4高、低表達(dá)組間存在差異

2.5 STAT4高表達(dá)與不同預(yù)后分組AML患者的關(guān)系

為進(jìn)一步討論STAT4高表達(dá)在不同預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)組的作用,以NCCN指南AML危險(xiǎn)度分級標(biāo)準(zhǔn),將患者分為預(yù)后良好(n=44)、預(yù)后中等(n=54)和預(yù)后不良(n=65)組。單因素生存分析提示,預(yù)后良好組中,STAT4高表達(dá)組較STAT4低表達(dá)組患者有更短的EFS(P=0.014)。在預(yù)后中等和預(yù)后不良組中,STAT4高、低表達(dá)組患者的EFS(P=0.751;P=0.459)和OS(P=0.886;P=0.147)無明顯差異,見圖4。

A:預(yù)后良好組患者的EFS;B:預(yù)后良好組患者的OS;C:預(yù)后中等組患者的EFS;D:預(yù)后中等組患者的OS;E:預(yù)后不良組患者的EFS;F:預(yù)后不良組患者的OS

2.6 STAT4表達(dá)水平對預(yù)后影響的多因素分析

為進(jìn)一步評估STAT4在AML患者中的預(yù)后意義,選取STAT4表達(dá)水平、STAT5B表達(dá)水平、年齡、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、骨髓原始細(xì)胞比例、NCCN指南危險(xiǎn)度分級、FLT3-ITD突變、DNMT3A突變、TP53突變、MECOM表達(dá)水平這些變量構(gòu)建多因素Cox回歸模型。結(jié)果提示,STAT4高表達(dá)與較短的EFS(HR=1.958,P=0.002)和OS(HR=1.556,P=0.036)顯著相關(guān)。高齡(EFS:HR=1.762,P=0.001;OS:HR=2.008,P<0.001)、高白細(xì)胞計(jì)數(shù)(EFS:HR=2.265,P<0.001)、危險(xiǎn)度分級為高危組(OS:HR=1.845,P=0.006)、DNMT3A突變(EFS:HR=1.740,P=0.007;OS:HR=1.734,P=0.007)、TP53突變(EFS:HR=2.085,P=0.025;OS:HR=2.338,P=0.012)為預(yù)后不良因素。STAT5B高表達(dá)(OS:HR=0.664,P=0.027)、危險(xiǎn)度分級為低危組(EFS:HR=0.598,P=0.043)與較好的預(yù)后相關(guān)(表4)。

3 討論

AML是一種常見的成人急性白血病,隨著新一代高通量測序技術(shù)的進(jìn)步,越來越多基因變異和表觀遺傳學(xué)修飾改變的發(fā)現(xiàn)讓我們對AML發(fā)病機(jī)理有了新認(rèn)識,基于新靶點(diǎn)開發(fā)的腫瘤藥物顯著改善了患者預(yù)后。但是AML患者目前的5年生存率仍不足30%[5-6]。為改變這一現(xiàn)狀,我們?nèi)孕璋l(fā)掘新的分子靶點(diǎn),探索發(fā)病機(jī)制以改善患者預(yù)后生存。本研究發(fā)現(xiàn)在AML患者中,JAK/STAT通路處于激活狀態(tài),AML患者體內(nèi)STAT4 mRNA水平明顯高于健康人群,而STAT4高表達(dá)提示患者擁有較短的總生存、無事件生存;在NCCN危險(xiǎn)度分級為預(yù)后良好的患者中,高表達(dá)STAT4同樣提示患者預(yù)后不良。

JAK/STAT通路是真核生物中普遍存在的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路[16],該通路與AML密切相關(guān)。JAK/STAT通路可引起G0/G1期阻滯并抑制AML細(xì)胞的增殖[17],阻斷JAK/STAT磷酸化可以抑制體內(nèi)外AML細(xì)胞的增殖[18-20]。JAK/STAT通路主要由細(xì)胞因子受體、JAKs和STATs組成。JAKs激酶是細(xì)胞內(nèi)非受體酪氨酸激酶家族,由JAK1、JAK2、JAK3和TYK2組成[21],JAK1、JAK2和TYK2普遍表達(dá),而JAK3主要在造血細(xì)胞中表達(dá)[22]。JAKs的過度激活和突變在惡性血液病的發(fā)生發(fā)展中具有關(guān)鍵作用?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn),AML細(xì)胞中JAK2磷酸化水平增加[23]。AF10融合基因可通過JAK1激活JAK/STAT通路導(dǎo)致AML的發(fā)生[12]。JAK1突變(JAK1V658F)使FLT3-ITD陽性AML對FLT3抑制劑產(chǎn)生抵抗[11],在T-ALL中JAK1突變是常見事件[24]。JAK3突變(JAK3A572V)與M7型AML相關(guān)[25],而JAK2突變(JAK2V617F)多見于骨髓增生性腫瘤患者。

STATs是一種核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子,該家族由STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B和STAT6組成[21],參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和凋亡[26]。STATs的高表達(dá)和持續(xù)激活,常與腫瘤惡性轉(zhuǎn)化有關(guān)?，F(xiàn)有研究已證實(shí),抑制STAT1可減少AML細(xì)胞增殖,抑制腫瘤生長[27]。AML細(xì)胞中STAT3處于激活狀態(tài)[28-29],選擇性抑制STAT3,可在不損害正常造血細(xì)胞的情況下導(dǎo)致AML干/祖細(xì)胞死亡[30-31]。而STAT5可同時(shí)參與髓系和淋巴系惡性腫瘤的發(fā)展[32-33]。STAT4是Th1輔助細(xì)胞的主要轉(zhuǎn)錄因子,參與固有免疫與適應(yīng)性免疫應(yīng)答[34-35]。其在淋巴細(xì)胞、髓系細(xì)胞中均有表達(dá),但表達(dá)水平在不同分化水平的細(xì)胞系中存在差異,具有相對成熟表型的髓系細(xì)胞系中未檢測到STAT4轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[34]?，F(xiàn)有報(bào)道指出,GATA3可能通過誘導(dǎo)STAT4過表達(dá),激活JAK/STAT通路參與急性B淋巴細(xì)胞白血病的發(fā)生[36-37]。另有文獻(xiàn)指出,CML干細(xì)胞可通過磷酸化激活STAT4與STAT5促進(jìn)PIM2的表達(dá)致病[38]。目前關(guān)于STAT4與髓系白血病之間關(guān)系的研究較少,本研究發(fā)現(xiàn)AML患者體內(nèi)STAT4 mRNA水平明顯高于健康人群,而STAT4高表達(dá)提示患者擁有較短的總生存、無事件生存。STAT3/4/5在髓系細(xì)胞不同發(fā)育階段存在表達(dá)差異,在不同類型的惡性血液病中也具有表達(dá)差異[32-39],但不可否認(rèn)的是,在某些疾病,如CML中,STATs因子在疾病致病過程中存在協(xié)同作用。

本研究分析AML患者與健康人群之間的差異表達(dá)基因,發(fā)現(xiàn)在AML患者中JAK/STAT通路處于激活狀態(tài),AML患者JAK1、JAK2和STAT4基因表達(dá)水平高于健康人群,STAT5A和STAT6基因表達(dá)水平低于健康人群。利用單因素和多因素分析模型評估單個(gè)JAK基因和單個(gè)STAT基因與AML患者總生存及無事件生存間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)STAT4基因高表達(dá)提示AML患者預(yù)后不良,STAT4高表達(dá)是AML患者預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。在不同亞組中進(jìn)一步分析,發(fā)現(xiàn)經(jīng)NCCN危險(xiǎn)度分級定義的預(yù)后良好組STAT4高表達(dá)患者,較低表達(dá)患者擁有更短的EFS。下一步將招募AML患者與同期健康供者各30人,采集患者及健康供者的骨髓或外周血,提取單個(gè)核細(xì)胞后進(jìn)行qRT-PCR、Western blot,分析患者與健康供者間STAT家族的表達(dá)差異、磷酸化STAT的變化,追蹤患者預(yù)后信息,以驗(yàn)證文中結(jié)論。此外仍需探尋下游通路,尋找靶基因,對STAT4異常表達(dá)對AML發(fā)病及影響預(yù)后的作用機(jī)制展開進(jìn)一步研究。

綜上所述,本研究對4個(gè)獨(dú)立隊(duì)列中患者的基因表達(dá)信息、臨床信息、預(yù)后信息進(jìn)行綜合分析,證實(shí)在AML患者中,JAK/STAT通路處于激活狀態(tài),JAKs和STATs在AML患者中存在表達(dá)差異。本研究還發(fā)現(xiàn)STAT家族中,STAT4基因的表達(dá)上調(diào)提示AML患者預(yù)后不良,可能是預(yù)測AML預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物,這些結(jié)果為進(jìn)一步研究STAT4基因的功能奠定了基礎(chǔ)。