循環(huán)腫瘤細胞與循環(huán)腫瘤微栓在鼻咽癌中的表達及其臨床意義

周龍清，喻國凍，張 瑜

（1.貴州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科；2.貴州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，貴州 貴陽 550004）

鼻咽癌（nasopharyngeal carcinoma, NPC）是指原發(fā)于鼻咽部黏膜上皮的惡性腫瘤，多發(fā)生于鼻咽頂壁和內(nèi)側，尤其是咽隱窩，其發(fā)生率主要與病毒感染、遺傳、環(huán)境等因素有關，是耳鼻喉科頭頸腫瘤疾病中常見的惡性腫瘤之一。多數(shù)NPC 患者以頸部出現(xiàn)腫塊為首發(fā)癥狀，由于NPC 早期癥狀不明顯，多數(shù)患者確診時已進入進展期或晚期。目前，EB 病毒血清抗體標志物與血漿EB 病毒DNA（EBV-DNA）檢測均可用于NPC 的早期篩查，但其特異度較低，且影像學檢查也存在一定局限性[1]。循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）是一種新興的腫瘤特異性生物標志物，是指由腫瘤原發(fā)灶或轉移灶脫落進入血液循環(huán)系統(tǒng)的腫瘤細胞，在胃癌、乳腺癌、非小細胞肺癌等惡性腫瘤的診斷、治療及預后監(jiān)測中逐漸被臨床應用和推廣[2]。研究指出，部分CTCs 可逃離機體免疫識別或藥物治療，在體內(nèi)尋找合適的微環(huán)境，形成“種子”在遠端組織器官或原發(fā)組織種植生長，導致腫瘤的轉移或復發(fā)[3]。循環(huán)腫瘤微栓（CTM）是指多個CTCs 同類聚集或與其他種類細胞聚集形成的細胞團，在血液中，CTM 會減緩血流速度，可成為血液中凝血酶形成的平臺，形成血栓栓塞[4]。相比單個形式存在的CTCs，CTM 更易避免腫瘤細胞凋亡，且更易發(fā)生免疫逃逸，生存力更強，放化療耐受性更好，轉移風險更高[5]。目前CTCs 與CTM 在NPC 患者中的臨床研究報道較少。因此，本研究旨在探討CTCs 與CTM 在NPC 中的表達及其臨床意義，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2020 年8 月至2021 年8 月貴州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院收治的122 例疑似NPC 患者的臨床資料，按病理學檢查結果的不同分為鼻咽部慢性炎癥組（30 例）與NPC 組（92 例）。鼻咽部慢性炎癥組患者中男性15 例，女性15 例；年齡18～63 歲，平均（46.56±5.86）歲。 NPC 組患者中男性48 例，女性44 例；年齡22～75 歲，平均（48.52±7.79）歲。診斷標準：參照《實用耳鼻咽喉頭頸外科學》[6]中的相關診斷標準。納入標準：①符合上述診斷標準且經(jīng)常規(guī)病理檢查確診；②未接受相關化療與靶向治療等抗腫瘤治療；③臨床資料完整。排除標準：①合并免疫疾系統(tǒng)疾??；②進行放化療和（或）生物靶向治療；③長期使用非甾體類抗炎類藥物。本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準。

1.2 研究方法

1.2.1 病理學檢測和分型 取所有患者組織樣本，均使用10%福爾馬林進行固定并石蠟包埋切片后，經(jīng)病理科診斷疾病類型，并進行病理分型。

1.2.2 外周血CTCs 與CTM 的檢測 采用CTC-Biopsy?系統(tǒng)檢測所有患者外周血CTCs 與CTM 情況，采集所有患者外周靜脈血約8 mL，其中5 mL 立即置于抗凝真空采血管并輕柔顛倒混勻8 次以避免凝血，采用3 mL 0.2%的多聚甲醛緩沖液進行稀釋，室溫下靜置10 min 后經(jīng)直徑為8 μm 的圓孔膜過濾，分離并富集CTCs，用Diff-Quick染色富集到的CTCs，風干并封片。處理樣本要求：血液樣本需在2 h 內(nèi)完成檢測，若不能在2 h 內(nèi)進行檢測，則需豎直靜置于4 °C 冰箱保存，保存時間不能超過24 h，處理前至少在室溫環(huán)境復溫30 min。 CTCs 判定標準[7]：細胞核不規(guī)則，呈現(xiàn)桿狀、分葉狀、馬蹄形狀、腎形、卵圓形狀；核質(zhì)比大于0.8；核直徑大于15 μm；核仁突出、深染且著色不均勻；核膜增厚出現(xiàn)凹陷或皺褶，核膜呈鋸齒狀；細胞核染色質(zhì)邊移或巨大核仁、異常核分裂。CTM 判定標準：3 個及3 個以上的CTCs 成團[7]。所有患者CTCs、CTM 結果的判定均由3 名資深細胞病理學家在不了解患者臨床資料和病理診斷的情況下獨立評估和判讀。

1.2.3 NPC 患者EBV 感染情況 將1.2.2 中采集的剩余3 mL 外周靜脈血采用熒光定量聚合酶分析法檢測NPC 患者EBV-DNA 感染情況，以拷貝數(shù)＞500 拷貝/mL 計為陽性[8]。

1.3 觀察指標①比較兩組患者CTCs 陽性率與CTM 陽性率。②比較NPC 組CTCs、CTM 陽性和陰性患者的臨床特征，收集所有患者性別、年齡、病理類型、T 分期、N 分期、臨床分期、EBV-DNA，并進行分析。T 分期標準：TX為原發(fā)腫瘤無法評價；T0為無原發(fā)腫瘤存在證據(jù)，包含頸部淋巴結EBV 陽性；T1為腫瘤局限于鼻咽部，或侵犯口咽和（或）鼻腔；T2為腫瘤侵犯咽旁間隙，和（或）鄰近軟組織（包括翼內(nèi)肌、翼外肌、椎前?。籘3為腫瘤侵犯顱底、頸椎、翼狀結構，和（或）鼻旁竇；T4為腫瘤顱內(nèi)侵犯，侵犯顱神經(jīng)、下咽部、眼眶、腮腺和（或）翼外肌側緣軟組織浸潤。N 分期標準：NX 為區(qū)域淋巴結無法評價；N0無區(qū)域淋巴結轉移；N1為單側頸部淋巴結轉移，和（或）單側、雙側咽后淋巴結轉移，轉移灶最大徑≤ 6 cm，在環(huán)狀軟骨下緣以上；N2為雙側頸部淋巴結轉移，轉移灶最大徑≤ 6 cm，在環(huán)狀軟骨下緣以上；N3為單側或雙側頸部淋巴結轉移，轉移灶最大徑＞6 cm，和（或）侵犯超過環(huán)狀軟骨下緣[8]。③相關性。采用Spearman 相關系數(shù)法分析NPC 患者CTCs、CTM 陽性率與N 分期、EBV-DNA的相關性。

1.4 統(tǒng)計學方法采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù)，計數(shù)資料以[ 例(%)]表示，采用χ2檢驗；采用Spearman相關系數(shù)法分析NPC 患者CTCs、CTM 陽性率與N 分期、EBV-DNA 的相關性。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩組患者CTCs 和CTM 的表達差異NPC 患者 CTCs 染色可見核型異常，胞核呈分葉狀，見圖1， CTCs陽性率67.39%（62/92），高于鼻咽部慢性炎癥組中CTCs陽性率為0.00%（0/30），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=41.109，P＜0.05）。 NPC 患者CTM 染色可見存在3 個和3 個以上CTC 構成的小細胞團，見圖2，CTM 陽性率為56.52%（52/92），高于鼻咽部慢性炎癥組中CTM 陽性率0.00%（0/30），差異有統(tǒng)計學意義（χ2=29.553，P＜0.05）。

圖1 NPC 患者CTCs（40×）

圖2 NPC 患者CTM（40×）

2.2 NPC 組CTCs 陽性和陰性患者臨床特征分析NPC組患者中， CTCs 陽性患者N2～N3期占比高于CTCs 陰性，EBV-DNA 陽性患者占比高于CTCs 陰性，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）； NPC CTCs 陽性和陰性患者在性別、年齡、病理類型、T 分期、臨床分期方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表1。

表1 NPC 組CTCs 陽性和陰性患者臨床特征分析[ 例(%)]

2.3 NPC 組CTM 陽性和陰性患者臨床特征分析NPC組患者中，CTM 陽性患者N2～N3期占比高于CTCs 陰性，EBV-DNA 陽性患者占比高于CTCs 陰性，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；NPC CTM 陽性和陰性患者在性別、年齡、病理類型、T 分期、臨床分期方面比較，差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表2。

表2 NPC 組CTM 陽性和陰性患者臨床特征分析[ 例(%)]

2.4 相關性經(jīng)Spearman 相關性分析顯示，NPC 患者CTCs 陽性與N 分期、EBV-DNA 陽性均呈正相關（r=0.259、0.232）；NPC 患者CTM 陽性與N 分期、EBV-DNA 陽性均呈正相關（r=0.247、0.337），差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表3。

表3 NPC 患者CTCs、CTM 陽性率與N 分期、EBV-DNA 的相關性分析

3 討論

NPC 是一種對放射敏感性的腫瘤，由于其解剖位置特殊，早期缺乏特異性癥狀與有效的診斷方法，從而不易被診斷。早診斷、早治療是降低NPC 患者病死率、提高生存率的關鍵。傳統(tǒng)腫瘤疾病主要通過組織活檢和影像學檢查結果進行診斷。影像學檢查只能發(fā)現(xiàn)直徑＞5 mm 的腫瘤，對微小瘤體診斷的準確率較低[9]。在腫瘤的形成、發(fā)展過程中，部分腫瘤細胞由原發(fā)灶或轉移灶脫落進入外周血液，因此，外周血CTCs 的檢測可有效用于體外早期診斷，與傳統(tǒng)組織病理活檢相比，CTCs 檢測具有無創(chuàng)、便捷等優(yōu)點，目前已被廣泛應用于腫瘤疾病的診斷與患者的預后評估[10]。

CTCs 在NPC 患者疾病進展過程的各個階段表達不同，因此檢測外周血中的CTCs 對鼻咽癌的早期篩查與診斷均具有積極作用[11]。CTCs 具有不同的細胞表型，包括上皮細胞型CTCs、上皮與間質(zhì)細胞混合型CTCs 和間質(zhì)細胞型CTCs，細胞表型可有效反映腫瘤細胞的惡性程度，其中間質(zhì)細胞型CTCs 較其他表型CTCs 具有更強的遷移和侵襲能力[12]。CTCs 以不同形態(tài)存在于外周血，3 個及3 個以上CTCs 構成的細胞簇稱為CTM，在惡性腫瘤的轉移中具有重要作用，且CTM 比CTC 更具侵襲性、轉移潛能及對凋亡的抵抗力[13]。本研究結果顯示，鼻咽部慢性炎癥患者外周血液中均未檢測到CTCs 與CTM，NPC 患者CTCs 陽性率為67.39%，CTM 陽性率為56.52%，與吳君心等[14]研究結果一致。

本研究進一步對患者的臨床特征資料分析，結果顯示，NPC 患者中，CTCs、CTM 陽性患者N2～N3期占比高于陰性患者，EBV-DNA 陽性患者占比高于陰性患者，提示NPC 患者外周血中CTCs、CTM 陽性均與患者N 分期、EBV-DNA 密切相關，NPC 患者中N 分期越高且EBV-DNA陽性的患者有較高的CTCs 和CTM 陽性率。T、N 分期是影響NPC 患者治療的重要因素，目前臨床主要通過影像學技術對NPC 患者診斷與T、N 分期進行判定，但影像學的遲滯性和不穩(wěn)定性導致不能對NPC 的療效及時評估[15]。CTCs 檢測在NPC 患者的診斷與臨床分期中具有一定優(yōu)勢，可避免組織病理學和影像學檢測的局限性，同時能反映腫瘤整體異質(zhì)性的特征，尤其是對于已發(fā)生轉移的患者[16]。腫瘤在無淋巴結和遠處轉移時，可在外周血液循環(huán)中檢測到CTCs，因其從原發(fā)灶脫落，通過侵襲、遷移和入侵血管等方式進入血液循環(huán)，極易通過血液循環(huán)而轉移到全身其他器官，因而可通過檢測外周血中CTCs 了解患者病情惡化、轉移情況[17]。

在NPC 的發(fā)生發(fā)展中，CTCs 和EB 病毒的活化狀態(tài)受環(huán)境因素的影響，且放化療等抗腫瘤治療也將影響CTCs與EB 病毒的相互作用。EB 病毒對NPC 患者的診斷、復發(fā)、轉移的檢測具有重要意義，外周血中CTCs 數(shù)量與EB病毒的載量呈正相關，EB 病毒的負荷越大，外周血中檢測出的CTCs 數(shù)量則越多[18]。本研究中，經(jīng)Spearman 相關性分析顯示，NPC 患者CTCs 陽性率與N 分期、EBV-DNA陽性均呈正相關（r=0.259、0.232）；NPC 患者CTM 陽性率與N 分期、EBV-DNA 陽性均呈正相關（r=0.247、0.337），說明NPC 患者與EB 病毒感染高度相關，外周血中CTM陽性，則腫瘤惡化、復發(fā)、轉移的可能性較高。

綜上，NPC 患者外周血中CTCs 陽性與N 分期及EBV-DNA 密切相關，CTM 陽性與N 分期、EBV-DNA 密切相關，CTCs 和CTM 可作為NPC 早期診斷和預后的輔助評價指標。