HPLC法多成分含量測(cè)定結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)評(píng)價(jià)上清丸中大黃的質(zhì)量

肖琳婧 秦學(xué)玲 金蒙 付興情 龍琴 張赟華

基金項(xiàng)目：國家藥品抽檢項(xiàng)目（No.國藥監(jiān)藥管［2022］1號(hào)）。

作者簡介：

肖琳婧（1987—），女，白族，碩士，主管藥師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。E-mail：xiaolinjing1@126.com

通信作者：

張赟華（1977—），男，彝族，本科，副主任藥師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。 E-mail：33683185@qq.com

【摘? 要】

目的：建立HPLC的方法測(cè)定上清丸中大黃的游離蒽醌（蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素）的含量，結(jié)合主成分分析方法，對(duì)市售上清丸中大黃（酒炒）的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法：采用月旭Xtimate-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相為乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫，檢測(cè)波長為254 nm；流速為1 mL/min；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：103批上清丸大黃中游離蒽醌類成分含量相差較大，5種成分線性良好（0.9996≤r≤1.0000），平均加樣回收率96.91%～101.40%（RSD值為0.6%～2.2%），通過主成分成分對(duì)上清丸（大蜜丸、水丸）中大黃（酒炒）質(zhì)量進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)，大蜜丸中大黃（酒炒）質(zhì)量排名靠前的是來自A，C、F、G企業(yè)的樣品，大黃（酒炒）質(zhì)量較差是B、D、E、I企業(yè)生產(chǎn)的樣品。上清丸（水丸）中，L、M企業(yè)各批次樣品游離蒽醌的量較N企業(yè)高，說明L、M企業(yè)上清丸中大黃（酒炒）的質(zhì)量較N企業(yè)好。結(jié)論：該分析方法簡單可行，具有良好精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性為上清丸中大黃（酒炒）質(zhì)量評(píng)價(jià)提供參考。

【關(guān)鍵詞】? 上清丸;高效液相色譜法;游離蒽醌;主成分分析

【中圖分類號(hào)】R284.1??? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號(hào)】1007-8517（2023）20-0028-10

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.20.zgmzmjyyzz202320008

Quality Evaluation of Shangqing Pills by HPLC Coupled with Chemometrics

XIAO Linjing? QIN Xuelin? JIN Meng? FU Xingqing? LONG Qin? ZHANG Yunhua*

Yunnan Institute for Food and Drug Control， Kunming 650106， China

Abstract：

Objective To establish simultaneous determination method of five anthraquinones（aloe-emodin， rhein， emodin， chrysophanol and physcion）in Shangqing Pills by HPLC. Methods Separation was performed on a Xtimate-C18 column （250 mm×4.6 mm， 5 μm） and the mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid with gradient elution. The flow rate at 1 mL/min， the column temperature at 30 ℃， the detection wavelength at 254 nm， and the injection volume was 10 μL. Results The contents of five anthraquinones in the 103 batches of Shangqing pills were significantly different. There was a good linear relationships of five compoments in Shangqing Pills， with average recoveries of? 96.91%-101.40% （RSD 0.6%-2.2%）. Comprehensive evaluation of Shangqing pills by principal components analysis （PCA）. The top companies in the comprehensive ranking of Shangqing big honeyed pills were A、C、H and G companies， and the lower ranking wereB、D、E and I companies. In Shangqing pills （water pills）， the amount of free anthraquinone in samples from L and M were higher than that of N. Conclusion The analytical method is simple and feasible， with good precision， repeatability and stability. The method can provide a reference for the quality evaluation of Shangqing Pills.

Keywords：

Shangqing Pills; HPLC; Free Anthraquinones; Principal Components Analysis （PCA）

上清丸來源于《丹溪心法》“朱丹溪方上清散加減”［1］，但與現(xiàn)行處方一致的上清丸最先記載于《北京市中藥成方選集》［2］。上清丸現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)收載于衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第十冊(cè)，標(biāo)準(zhǔn)編號(hào)為 WS3-B-1878-95，標(biāo)準(zhǔn)收載大蜜丸和水丸兩種劑型，后增加水蜜丸的規(guī)格。上清丸由菊花、薄荷、川芎、白芷、荊芥、防風(fēng)、桔梗、連翹、梔子、黃芩（酒炒）、黃柏（酒炒）及大黃（酒炒）十二味藥材組成。主要有清熱散風(fēng)、解毒通便的功效。臨床上常用于頭暈耳鳴、目赤、鼻流黃涕、口舌生瘡、牙齦腫痛、大便秘結(jié)［3］。大黃為處方中的君藥，用量約占處方量的五分之一，其主要活性成分為蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等蒽醌類化合物。大黃蒽醌類成分僅占大黃成分的3%～5%，但具有較強(qiáng)的瀉下、消炎、抗菌作用，是評(píng)價(jià)大黃藥材以及含大黃制劑質(zhì)量的指標(biāo)成分［4-8］。上清丸現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅對(duì)大黃進(jìn)行顯微鑒別。文獻(xiàn)［9-11］報(bào)道，采用HPLC方法可對(duì)上清丸中的歐前胡素、黃芩苷、綠原酸及大黃中總蒽醌進(jìn)行含量測(cè)定，但上清丸中大黃（酒炒）游離蒽醌含量測(cè)定未見報(bào)道。大黃（酒炒）后結(jié)合性蒽醌減少30%～50%，而游離蒽醌的量大幅提升，為評(píng)價(jià)大黃（酒炒）的質(zhì)量，有必要建立其游離蒽醌的測(cè)定方法。

上清丸包括大蜜丸、水丸、水蜜丸三種劑型。三種劑型處方量相同，制法不同，具體制法如下：以上12味藥材共530g，其中每100g粉末加煉蜜180g制成大蜜丸，每100g粉末加煉蜜40g制成水蜜丸，以水泛丸制成水丸。由于加入的輔料的量不同，造成不同劑型每克上清丸中含的大黃（酒炒）的量不同。為綜合評(píng)價(jià)市售上清丸中大黃（酒炒）的質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)采用了HPLC測(cè)定了103批樣品中大黃中游離蒽醌類成分的含量，運(yùn)用化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法進(jìn)行主成分分析，實(shí)現(xiàn)上清丸大黃（酒炒）質(zhì)量科學(xué)、系統(tǒng)的控制。

1? 儀器與試藥

1.1? 儀器? 島津LC-20A高效液相色譜儀；賽多利斯 BS224S電子天平；賽多利斯SECURA225D電子天平。

1.2? 試藥? 蘆薈大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110795-201308，來源：中國食品藥品檢定研究院，含量以97.8%計(jì)）；大黃酸對(duì)照品（批號(hào)：110757-201607，來源：中國食品藥品檢定研究院，含量以99.3%計(jì)，）；大黃素對(duì)照品（批號(hào)：110756-201913，來源：中國食品藥品檢定研究院，含量以96.0%計(jì)）；大黃酚對(duì)照品（批號(hào)：110796-201621，來源：中國食品藥品檢定研究院， 含量以 99.2%計(jì)）；大黃素甲醚對(duì)照品（批號(hào)：110758-201415，來源：中國食品藥品檢定研究院，含量以 99.1%計(jì)）。乙腈為色譜純（默克公司），水為純化水，甲醇、乙醇、磷酸等其他試劑均為分析純。

1.3? 樣品? 方法學(xué)考察用的樣品：上清丸（水蜜丸，批號(hào)：A12003，廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司生產(chǎn)），其余103批次上清丸樣品來源于14家生產(chǎn)企業(yè)，由于樣品來源國家專項(xiàng)抽驗(yàn)，涉及數(shù)據(jù)保密，生產(chǎn)企業(yè)由A～N代替。具體信息見表1。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 色譜條件? 采用月旭Xtimate-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5μm），以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸為流動(dòng)相B，梯度洗脫，流速為1 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長為254 nm。理論板數(shù)按大黃素峰計(jì)算應(yīng)不低于3000。見表2。

2.2? 溶液的制備

2.2.1? 對(duì)照品溶液的制備? 分別取蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 mL含蘆薈大黃素10μg、大黃酸8μg 、大黃素8μg、大黃酚40μg，大黃素甲醚10μg的混合溶液，即得。

2.2.2? 供試品溶液的制備? 取本品重量差異項(xiàng)下大蜜丸，剪碎，精密稱定，取約2 g；取水丸或水蜜丸適量，研細(xì)，取約1 g，置具塞三角錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定重量，加熱回流45 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2.3? 陰性供試品溶液的制備? 按處方比例，在實(shí)驗(yàn)室模擬工藝，分別配制缺大黃細(xì)粉，分別取約1 g，同供試品溶液制備，即得陰性供試品溶液。

2.3? 方法學(xué)考察

2.3.1? 專屬性試驗(yàn)? 按“2.2.1、2.2.2、2.2.3”項(xiàng)下制備的對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性供試品，在上述試驗(yàn)條件下，采用紫外檢測(cè)器檢測(cè)，測(cè)定，記錄色譜圖，如圖1。結(jié)果表明上述液相色譜條件下，供試品溶液色譜中呈現(xiàn)與對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚與相鄰色譜峰的分離度大于1.5，理論理論板數(shù)以大黃素峰計(jì)均不低于3000，陰性供試品在相應(yīng)位置處未見色譜峰，表明其他藥味不干擾5種待測(cè)成分的測(cè)定，方法專屬性良好。

2.3.2? 線性關(guān)系考察? 精密稱定取蘆薈大黃素對(duì)照品10mg、大黃酸對(duì)照品8mg、大黃素對(duì)照品8mg、大黃酚對(duì)照品20mg、蘆薈大黃素對(duì)照品10mg置于50 mL量瓶中，用甲醇溶解定容至刻度，搖勻，得蘆薈大黃素母液（C=200μg/mL）、大黃酸母液（C=160μg/mL）、大黃素母液（C=160μg/mL）、大黃酚母液（C=400μg/mL）、大黃素甲醚母液（C=200μg/mL）精密吸取5 mL、5 mL、2 mL、1 mL、1 mL置于10 mL、50 mL、50 mL、100 mL、250 mL容量瓶中，加甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得系列線性溶液。精密吸取上述線性對(duì)照品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀中，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定。以各成分進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，相應(yīng)峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算回歸方程，線性測(cè)定數(shù)據(jù)、回歸方程及相關(guān)系數(shù)見表3。

2.3.3? 精密度試驗(yàn)? 取混合對(duì)照品適量，按上述方法制備，連續(xù)6次測(cè)定，測(cè)得蘆薈大黃素、大黃酸苷、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積RSD（n=6）分別為0.3%、0.5%、0.7%、0.3%、0.5%，儀器的精密度良好。

2.3.4? 穩(wěn)定性試驗(yàn)? 取上清丸（水蜜丸，批號(hào)：A12003，廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司生產(chǎn)）同一供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣，分別在0 h、4 h、8 h、12 h、20 h、24 h各進(jìn)樣一次，測(cè)定各組分的峰面積，蘆薈大黃素、大黃酸、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚的峰面積RSD （n=6） 分別為0.9%、0.9%、0.5%、0.9%、1.0%，樣品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.3.5? 重復(fù)性試驗(yàn)? 取上清丸（水蜜丸，批號(hào)：A12003，廣州白云山陳李濟(jì)藥廠有限公司生產(chǎn)）按“2.2.2”項(xiàng)下操作，平行提取 6 份，測(cè)得結(jié)果見表4，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6? 加樣回收試驗(yàn)? 分別精密稱6份樣品（批號(hào)：A12003） 0.5 g，采用加樣回收試驗(yàn)方法，分別按下表精密加入5種對(duì)照品溶液，計(jì)算回收率和RSD見表5。

2.4? 含量測(cè)定? 取上清丸103批，按照2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，各精密吸取10 μＬ，注入HPLC中，采用外標(biāo)法計(jì)算各成分的含量，結(jié)果見表6。

由于不同劑型上清丸中每克樣品大黃（酒炒）的量不同，對(duì)相同劑型不同企業(yè)不同批次的樣品進(jìn)行分析。

通過BM SPSS 18.0對(duì)不同企業(yè)生產(chǎn)的72批次上清丸（大蜜丸）游離蒽醌的含量進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見表7。上清丸（大蜜丸）A、C、F、G企業(yè)各批次樣品游離蒽醌的量整體較高，上清丸中大黃（酒炒）質(zhì)量整體較好；D、E、I企業(yè)各批次樣品游離蒽醌的量均較低，上清丸中大黃（酒炒）質(zhì)量整體較差，如A企業(yè)生產(chǎn)的大蜜丸游離蒽醌的量與其余B、D、E、I、K企業(yè)有顯著性差異。

通過BM SPSS 18.0對(duì)不同企業(yè)生產(chǎn)的 72批次上清丸（水丸）游離蒽醌的含量進(jìn)行顯著性分析，結(jié)果見表8。上清丸（水丸）中，L、M企業(yè)各批次樣品游離蒽醌的量較N企業(yè)高，說明L、M企業(yè)上清丸中大黃（酒炒）的質(zhì)量較N企業(yè)好，L、M企業(yè)生產(chǎn)水丸游離蒽醌的量與N企業(yè)間有顯著性差異。

2.5? 化學(xué)計(jì)量學(xué)分析

2.5.1? 主成分分析及綜合評(píng)價(jià)［12-15］? 采用IBM SPSS 18.0 和SIMCA 12.0軟件對(duì)不同企業(yè)不同批次上清丸大黃中游離蒽醌類成分的量進(jìn)行主成分分析。

將103批次不同劑型的上清丸樣品導(dǎo)入IBM SPSS 18.0、SIMCA 12.0分析軟件，根據(jù)表9，顯示前2個(gè)主成分累積方差貢獻(xiàn)率分別為95.39%，選取前2個(gè)主成分進(jìn)行主成分分析。PCA 得分圖如圖2，不同劑型的上清丸在得分圖中可以大致區(qū)分，紅色為大蜜丸、紫色為水丸、綠色為水丸，但部分大蜜丸和水蜜丸之間存在交叉。

7批次水蜜丸為A廠家獨(dú)家生產(chǎn)，因水蜜丸樣本量較少未做主成分分析。將72批次上清丸（大蜜丸）、24批次上清丸（水丸）大黃中5個(gè)蒽醌類成分導(dǎo)入SPSS 18.0軟件。

上清丸（大蜜丸、水丸）KMO統(tǒng)計(jì)量分別為0.663、0.524，大于最低標(biāo)準(zhǔn)0.5；Bartlett球型檢驗(yàn)結(jié)果為0.000，P<0.001，說明該數(shù)據(jù)適合做因子分析，根據(jù)表10、11分別顯示前2個(gè)主成分特征值均大于1，累積方差貢獻(xiàn)率分別為94.63%、92.14%，選取前2個(gè)主成分進(jìn)行主成分分析。

SIMCA 12.0 分析軟件得到上清丸（大蜜丸、水丸）PCA 得分圖，如圖3、圖4所示。

通過上清丸大蜜丸PCA得分圖，結(jié)合上清丸中游離蒽醌的總量，72批上清丸（大蜜丸）樣品大致可分為2組，說明不同生產(chǎn)企業(yè)生產(chǎn)的上清丸（大蜜丸）的質(zhì)量存在差異，紅色部分上清丸大蜜丸大黃（酒炒）質(zhì)量較好，主要來自A、C、F、G企業(yè)，綠色部分大黃（酒炒）質(zhì)量較差，主要由B、D、E、I企業(yè)生產(chǎn)。

24批上清丸（水丸）樣品大致可分為3組，結(jié)合游離蒽醌的總量，紅色部分為上清丸中大黃（酒炒）質(zhì)量較好，N企業(yè)生產(chǎn)的上清丸均在綠色部分，大黃（酒炒）質(zhì)量較差。

3? 討論

本研究比較了不同提取溶劑（90%甲醇、70%甲醇、70%乙醇、甲醇），不同提取方式（超聲30 min、加熱回流30 min），不同回流時(shí)間（30 min、45 min、60 min），最終確定最佳提取條件是甲醇加熱回流提取45 min。此條件提取較完全，通過上述色譜條件，可以較好地測(cè)定上清丸大黃（酒炒）中游離蒽醌的含量。

本實(shí)驗(yàn)在篩選流動(dòng)相時(shí)，通過對(duì)乙腈-水、甲醇-水的運(yùn)行，篩選出乙腈-水系統(tǒng)優(yōu)于甲醇-水系統(tǒng)，但大黃酸色譜峰出現(xiàn)了拖尾現(xiàn)象，進(jìn)而以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相，同時(shí)測(cè)定上清丸中游離蒽醌的含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相梯度洗脫時(shí)，供試品中5個(gè)蒽醌類成分可達(dá)到基線分離，峰型較好，并且干擾較少，出峰時(shí)間適中，故選取此條件為流動(dòng)相。

通過測(cè)定103批上清丸大黃中游離蒽醌的含量，按劑型對(duì)不同企業(yè)的樣品中游離蒽醌的含量進(jìn)行比較，上清丸（大蜜丸）中A、C、F、G企業(yè)各批次樣品游離蒽醌的量整體較高，大黃（酒炒）質(zhì)量整體較好；D、E、I企業(yè)各批次樣品游離蒽醌的量均較低，大黃（酒炒）質(zhì)量整體較差。上清丸（水丸）中，L、M企業(yè)樣品游離蒽醌的量整體較N企業(yè)高，L、M企業(yè)上清丸中大黃（酒炒）的質(zhì)量較N企業(yè)好。

進(jìn)一步建立PCA模型，對(duì)不同劑型的上清丸進(jìn)行主成分分析，大蜜丸、水蜜丸、水丸可大致區(qū)分，但部分批次大蜜丸和水蜜丸存在交叉。分析存在交叉的原因，根據(jù)不同劑型的上清丸制法，每克大蜜丸、水蜜丸、水丸中大黃的量分別為0.08 g、0.16 g、0.22 g，水蜜丸、水丸每克大黃的量分別為大蜜丸的2倍和3倍，如用品質(zhì)相同的大黃投料，水蜜丸中大黃的游離蒽醌的量應(yīng)為大蜜丸的2倍，但部分批次上清丸（大蜜丸）投料的大黃（酒炒）質(zhì)量較好，游離蒽醌的量達(dá)到1mg/g以上，與水蜜丸中游離蒽醌的量相當(dāng)。

綜上，本實(shí)驗(yàn)采用多成分含量測(cè)定結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)市售上清丸中大黃（酒炒）的質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，為綜合評(píng)價(jià)上清丸中大黃的質(zhì)量提供依據(jù)。

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（收稿日期：2023-01-10? 編輯：劉? 斌）