HPLC法測定夏枯草籽及夏枯草籽油中迷迭香酸的含量

黃志云 孫維廣 李啟燕 陳斌 萬安鳳 高建勝

基金項(xiàng)目：

作者簡介：

黃志云（1990—），女，漢族，碩士，主管中藥師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制研究工作。E-mail： zyh2179@163.com

通信作者：

孫維廣（1974—），男，漢族，博士，制藥高級工程師，研究方向?yàn)橹兴庂|(zhì)量控制研究工作。E-mail： sunwg2233@163.com

【摘? 要】

目的：建立夏枯草籽及夏枯草籽油中迷迭香酸含量測定方法。方法：采用HPLC法，Ultimate XB-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），柱溫為25℃，檢測波長為330nm，流動相為乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（18∶16∶66），流速1.0mL/min。結(jié)果：迷迭香酸線性范圍為0.20～1.23μg（R2＝0.9993）；夏枯草籽和夏枯草籽油樣品中迷迭香酸的平均回收率分別為99.22%（RSD為1.70%）、100.15%（RSD為2.04%）。結(jié)論：該方法操作簡單，可靠，重復(fù)性好，可用于夏枯草籽及夏枯草籽油中迷迭香酸的含量測定。

【關(guān)鍵詞】

夏枯草籽；夏枯草籽油；含量測定；HPLC法；迷迭香酸

【中圖分類號】R284.1??? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2023）20-0057-04

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.20.zgmzmjyyzz202320013

Determination of Rosmarinic Acid in Prunellae Spica Seeds and Oil-type Prunellae Spica Seeds by HPLC

HUANG Zhiyun1? SUN Weiguang1*? LI Qiyan2? CHEN Bin3? WANG Anfeng1? GAO Jiansheng1

1.Guangzhou Baiyunshan Xingqun Pharmaceutical Co.，Ltd.， Guangzhou 510288， China;

2. Guangzhou Special Service Recuperation Center of PLA Rocket Force， Guangzhou 510010， China;

3. Jiangxi Xinkangjian Ecological Agriculture Development Co.， Ltd， Xinyu? 336500，China

Abstract：

Objective To establish a method for determination of rosmarinic acid in? Prunellae spica seeds and oil-type Prunellae spica seeds by HPLC. Methods Ultimate XB-C18（250mm×4.6mm，5μm） column was used and the column temperature was 25℃， the detection wavelength was 330nm， the mobile phase was acetonitrile-Methanol-0.1%H3PO4 solution 18∶16∶66）， the flow rate was 1.0mL/min. Results thelinear ranges ofrosmarinic acid? was 0.20-1.23μg （R2＝0.9993）; and the average recoveries of rosmarinic acid in? Prunellae spica seeds and oil-type Prunellae spica seeds was 99.22%（RSD 1.70%）， 100.15% （RSD 2.04%）， respectively.Conclusions The method is simple， reliable， efficient， and can be used for determination of rosmarinic acid in Prunellae spica seeds and oil-type Prunellae spica seeds.

Keywords：Prunellae Spica Seeds; Oil-type Prunellae Spica Seeds; Content Determination; HPLC; Rosmarinic Acid

夏枯草為唇形科（Lamiaceae）植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥果穗，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，因“此草夏至后即枯”而得名，是一種藥食同源的多年生草本植物，至今已有幾千年的藥用歷史，現(xiàn)收載于2020年版《中國藥典》。夏枯草味苦、辛，性寒，歸肝、膽經(jīng)，可清肝散火、明目、散結(jié)消腫［1］。對目赤腫痛、畏光流淚、目珠夜痛、頭暈?zāi)垦?、瘰疬、癭瘤、乳腺癌、高血壓、淋巴結(jié)核、浸潤性肺結(jié)核、單純性甲狀腺腫、腮腺炎、急性黃疸型傳染性肝炎等均有良好的臨床治療效果?，F(xiàn)代研究［2-3］表明，夏枯草中含有多種化學(xué)成分：包括三萜、甾醇、黃酮、有機(jī)酸、香豆素等類型化合物，具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)、降血壓、降血糖、降血脂等藥理作用。夏枯草籽為唇形科（Lamiaceae）植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥成熟種子，為夏枯草的生殖種子，應(yīng)具有與夏枯草一致的遺傳活性物質(zhì)與作用。因此，夏枯草籽及夏枯草籽油在食用、保健或藥物中具有較大的開發(fā)前景，但其應(yīng)用價(jià)值還未受到重視，并未見到其相關(guān)報(bào)道。

迷迭香酸（rosmarinic acid，RA）是一種多酚酸，化學(xué)名為：R（+）2-［3-（3，4-二羥基苯基）-1-氧代-2-丙烯基］氧基-3，4-二羥基苯丙酸，廣泛分布于唇形科、紫草科、葫蘆科等植物中，是夏枯草的主要有效成分之一?，F(xiàn)代藥理研究［4-5］表明，迷迭香酸具有抗氧化、抗菌抗炎、抗腫瘤、抗抑郁和抗焦慮、改善腎臟疾病、保肝等多方面藥理學(xué)活性。

本文首次發(fā)現(xiàn)夏枯草籽及夏枯草籽油中富含迷迭香酸類成分，利用極性溶劑提取法將脂溶性成分與迷迭香酸類極性成分分離。目前尚未有專門針對夏枯草籽和夏枯草籽油的含量控制方法，鑒于迷迭香酸為夏枯草主要有效成分之一，藥理活性廣泛，以及《中國藥典》中夏枯草含量控制指標(biāo)成分為該成分，有必要建立以迷迭香酸為含量指標(biāo)的夏枯草籽及夏枯草籽油質(zhì)量控制方法，為下一步的開發(fā)利用提供參考。本文采用HPLC法測定夏枯草籽及夏枯草籽油中迷迭香酸的含量，為質(zhì)量控制提供了實(shí)驗(yàn)方法。

1? 儀器與材料

1.1? 儀器? BY-500A高速萬能粉碎機(jī)，永康市速鋒工貿(mào)有限公司生產(chǎn)；賽默飛U3000系列高效液相色譜儀（U紫外檢測器），德國賽默公司生產(chǎn)；BT125D型十萬分之一電子分析天平，德國賽多利斯公司生產(chǎn)；XPR36型百萬分之一電子分析天平，梅特勒-托利多；SB25-12TD型新芝超聲清洗機(jī)，愽納清洗設(shè)備有限公司；紫外光燈；水浴鍋；常用玻璃儀器；干燥箱。

1.2? 材料? 磷酸、甲醇為分析純、甲醇、乙腈為色普純，迷迭香酸對照品（批號111871-202007，含量：98.1%），由中國食品藥品檢定研究院提供。夏枯草籽（批號：20220314，20220325，20220402），由江西鑫康健生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供，經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院劉傳明副教授鑒定為唇形科（Lamiaceae）植物夏枯草Prunella vulgaris L.的干燥種子；夏枯草籽油（批號：20220318，20220329，20220406），由江西鑫康健生態(tài)農(nóng)業(yè)開發(fā)有限公司提供。

2? 方法與結(jié)果

2.1? 對照品溶液制備? 精密稱取迷迭香酸對照品4.09mg，置于100mL容量瓶中，用50%甲醇溶解并定容，即得迷迭香酸對照品溶液。

2.2? 供試品溶液制備

2.2.1? 夏枯草籽供試品溶液的制備? 取夏枯草籽，粉碎破壁，過40目篩，稱取夏枯草籽粉約1.0g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇100 mL，精密稱重，超聲處理（功率600 W，頻率40 kHz）60min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，得夏枯草籽供試品溶液。

2.2.2? 夏枯草籽油的制備? ①夏枯草籽的破壁：將純凈的夏枯草籽置于粉碎破壁機(jī)中，選用40目孔徑的粉碎破壁機(jī)篩網(wǎng)進(jìn)行粉碎破壁；將粉碎破壁機(jī)置于（10±2）℃的環(huán)境下；或是在粉碎破壁機(jī)的發(fā)熱部位外部加裝制冷循環(huán)水裝置，并保持粉碎溫度在15℃以下；開啟機(jī)粉碎，粉碎后的夏枯草籽粉置于孔徑為40目的篩網(wǎng)中，振搖過篩，讓粒徑小于篩網(wǎng)網(wǎng)孔的草籽粉通過，不能通過的草籽粉加入粉碎機(jī)中繼續(xù)粉碎破壁，直至全部通過為止，獲得破壁的夏枯草籽粉。②與夾帶劑混勻。加夾帶劑混合：往上述破壁夏枯草籽粉原料中加入極性夾帶劑甲醇，按一定比例混合均勻；將混合均勻的粉體均勻地填充于超臨界CO2萃取釜中。③超臨界萃取。靜態(tài)浸泡萃?。簩⑸鲜鎏畛浜孟目莶葑鸦旌戏垠w的超臨界CO2萃取釜，升溫至45℃的溫度，通以CO2超臨界流體升壓至20MPa的壓力，停泵，靜態(tài)浸泡提取40min；動態(tài)萃取：靜態(tài)浸泡提取40min后，當(dāng)分離器的溫度及壓力達(dá)到設(shè)定值時(shí)開始動態(tài)萃取并計(jì)時(shí)，萃取時(shí)間120min； 采用二級分離，分離的工藝條件是：一級解析器壓力為10MPa，分離溫度37℃；二級解析器壓力為4MPa，分離溫度27℃；獲得黃綠色的夏枯草籽油。④過濾除雜。取上述夏枯草籽油，置于孔徑為350目的過濾裝置中減壓抽濾，棄去不能濾過的雜質(zhì)，得清澈的夏枯草籽油。

2.2.3? 夏枯草籽油供試品溶液的制備? 取夏枯草籽油約0.8g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇100mL，超聲處理（功率600W，頻率40kHz）60min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置讓乳化液分層澄清，取50%甲醇部分，濾過，取續(xù)濾液，得夏枯草籽油供試品溶液。

2.3? 色譜條件? 采用Ultimate XB-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm），柱溫為25℃，檢測波長為330nm，流速1mL/min，進(jìn)樣量10μL，流動相為乙腈-甲醇-0.1%磷酸溶液（18∶16∶66）。

2.4? 專屬性? 精密吸取對照品溶液、供試品溶液及 陰性樣品溶液，分別進(jìn)樣 10 μL，按 2.3項(xiàng)色譜條件測定，結(jié)果從色譜圖如圖1～4可知，迷迭香酸對照品HPLC色譜圖中，在保留時(shí)間10.3min左右有迷迭香酸對照品的吸收峰呈現(xiàn)，在夏枯草籽及夏枯草籽油的HPLC色譜圖中均在保留時(shí)間10.3min左右有迷迭香酸的吸收峰出現(xiàn)，且峰形與迷迭香酸對照品的峰形一至，分離度良好，而在空白提取溶劑的HPLC色譜圖中未見迷迭香酸的吸收峰，表明陰性對照無干擾。

2.5? 線性關(guān)系考察? 取“2.1”項(xiàng)下對照品溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別取5 μL、10 μL、15 μL、20 μL、25 μL、30 μL進(jìn)樣，以進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；得回歸方程：Y＝39.886X-0.0115，R2＝0.9993，表明迷迭香酸在0.20～1.23μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.6? 精密度試驗(yàn)? 精密吸取“2.1”項(xiàng)下迷迭香酸對照品溶液10 μL，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6次，測定峰面積，計(jì)算迷迭香酸峰面積值的平均值為16.26，RSD為0.69%，峰面積值的RSD<2%，結(jié)果見表2；結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.7? 穩(wěn)定性試驗(yàn)? 取“2.2.1”項(xiàng)下的夏枯草籽供試品溶液及“2.2.2”項(xiàng)下的夏枯草籽油供試品溶液，按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，分別于0 h、1 h、4 h、8 h、12 h、24 h，分別進(jìn)樣10 μL，測定迷迭香酸峰面積值，計(jì)算夏枯草籽供試品中迷迭香酸峰面積值的平均值為23.56，RSD為0.99%；計(jì)算夏枯草籽油供試品中迷迭香酸峰面積值的平均值為25.35，RSD為0.93%；測得兩個(gè)樣品中迷迭香酸峰面積的RSD均<2%，表明在24 h內(nèi)供試品溶液穩(wěn)定性良好。

2.8? 重復(fù)性試驗(yàn)? 取同一批號夏枯草籽樣品（批號20220314），按“2.2.1”項(xiàng)下的夏枯草籽供試品溶液的制備方法制備6份夏枯草籽樣品液；取同一批號夏枯草籽油樣品（批號20220318），按“2.2.2”項(xiàng)下的夏枯草籽油供試品溶液的制備方法制備6份夏枯草籽油樣品液；分別按“2.3”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣測定，計(jì)算迷迭香酸含量；夏枯草籽樣品中迷迭香酸含量的平均值為0.59%，RSD為0.98%；夏枯草籽油樣品中迷迭香酸含量的平均值為0.80%，RSD為0.94%；測得兩個(gè)樣品中迷迭香酸含量的RSD均<2%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.9? 回收率試驗(yàn)? 精密稱取已知含量同一批號夏枯草籽樣品（批號20220314）6份，每份0.5 g，分別精密加入相當(dāng)于樣品中迷迭香酸含量100%的對照品溶液適量，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備供試品溶液；精密稱取已知含量同一批號夏枯草籽油樣品（批號20220318）6份，每份0.4 g，分別精密加入相當(dāng)于樣品中迷迭香酸含量100%的對照品溶液適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液；再按“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算迷迭香酸含量及回收率，結(jié)果夏枯草籽樣品中迷迭香酸的平均回收率為99.22%，RSD為1.70%，夏枯草籽油樣品中迷迭香酸的平均回收率為100.15%，RSD為2.04%。結(jié)果見表1。

試驗(yàn)結(jié)果表明：夏枯草籽的迷迭香酸回收率在97.11％～101.26％之間，夏枯草籽油的迷迭香酸回收率在97.58％～102.67％之間，兩批樣品的加樣回收良好。

2.10? 三批夏枯草籽及夏枯草籽油中迷迭香酸的含量測定? 按“2.3”項(xiàng)下色譜條件分別測定3個(gè)不同批次的夏枯草籽及3個(gè)不同批次的夏枯草籽油樣品中迷迭香酸的含量。結(jié)果見表2。

測得三批夏枯草籽中迷迭香酸的含量在0.54%～0.71%之間；測得三批夏枯草籽油中迷迭香酸的含量在0.69%～0.96%之間。

3? 討論

本文首次發(fā)現(xiàn)夏枯草籽及夏枯草籽油中富含迷迭香酸類成分，并首次建立了夏枯草籽及夏枯草籽油中迷迭香酸的檢測方法。研究結(jié)果表明，夏枯草籽及夏枯草籽油中迷迭香酸的含量測定在線性范圍內(nèi)線性良好，其精密度、穩(wěn)定性、重現(xiàn)性、回收率試驗(yàn)均符合要求。

壓榨法、常規(guī)超臨界CO2萃取制備方法所制備的夏枯草籽油中很少含有或不含有迷迭香酸成分，試驗(yàn)所用的夏枯草籽油為使用極性夾帶劑的超臨界CO2萃取制備方法所制備的夏枯草籽油，克服了常規(guī)超臨界CO2萃取制備方法操作壓力大、萃取時(shí)間長、對設(shè)備要求高、能耗大、提取容量少、萃取率不夠理想等缺點(diǎn)，提高了迷迭香酸的提取率［6-9］。

《中國藥典》中夏枯草藥材含量要求為含迷迭香酸不得少于0.20%，本研究中夏枯草籽中迷迭香酸的含量在0.54%～0.71%之間，夏枯草籽油中迷迭香酸的含量在0.69%～0.96%之間，含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于藥典要求的下限，本研究為夏枯草籽及夏枯草籽油的開發(fā)和利用提供了方法和依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

［1］

國家藥典委員會.中華人民共和國藥典（一部）［M］.北京： 中國醫(yī)藥科技出版社， 2020：292.

［2］張金華， 邱俊娜， 王路， 等. 夏枯草化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展［J］. 中草藥， 2018， 49 （14）： 3432-3440.

［3］高建勝，孫元芳，鐘小天， 等.基于“成分-靶點(diǎn)-通路”網(wǎng)絡(luò)多層次分析夏枯草治療視神經(jīng)病變的作用機(jī)制［J］.中藥材，2020，43（7）：1702-1708.

［4］翁夕婷.迷迭香酸的研究進(jìn)展［J］.當(dāng)代化工研究，2017（4）：17-18.

［5］李存玉， 吳鑫， 馬贊， 等.夏枯草中迷迭香酸的納濾分離行為及富集工藝對比［J］. 中藥材， 2018， 41（8）： 1947-1949.

［6］劉曉庚， 陳梅梅， 謝亞桐. 夾帶劑及其對超臨界CO2萃取效能的影響［J］. 食品科學(xué)，2004 （11）： 353-357.

［7］龍?zhí)恚?樓一層， 張浩. 響應(yīng)曲面法優(yōu)化夏枯草中迷迭香酸的超聲提取工藝［J］. 西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2016， 44（7）： 209-214.

［8］朱鶴云， 彭秀玲， 馮波.正交試驗(yàn)優(yōu)選夏枯草中迷迭香酸超聲波提取工藝［J］. 吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報(bào)， 2011， 32（1）： 11-14.

［9］林麗美， 許招懂， 閆積彪， 等. 夏枯草中活性成分迷迭香酸的提取分離、結(jié)構(gòu)鑒定與富集［J］. 中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志， 2009， 15（8）： 35-37.

（收稿日期：2023-03-01? 編輯：陶希睿）