溫針內(nèi)、外膝眼穴對膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠RhoA/ROCK信號通路的影響

石欣悅 洪昆達(dá)

基金項目：福建省衛(wèi)健委中青年骨干人才項目（2020GGA056）；福建醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院博士啟動基金（BS202005）。

作者簡介：石欣悅（1997—），女，漢族，碩士研究生在讀，研究方向為針推防治脊柱與骨關(guān)節(jié)疾病。E-mail：3062807751@qq.com

通信作者：洪昆達(dá)（1981—），男，漢族，博士，副主任醫(yī)師、碩士生導(dǎo)師，研究方向為針灸防治骨關(guān)節(jié)病。E-mail：hongkundafz@163.com

【摘? 要】? 目的：探討溫針內(nèi)、外膝眼穴對膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠RhoA/ROCK信號通路上關(guān)鍵因子的影響，進(jìn)一步明確溫針的作用靶點，為臨床中使用溫針治療KOA提供分子理論依據(jù)。方法：將24只SPF級雄性SD大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組與溫針組，每組各8只。采用木瓜蛋白酶法復(fù)制膝骨性關(guān)節(jié)炎模型；空白組與模型組同等抓取固定，溫針組采用溫針治療；期間觀察大鼠的一般情況。HE染色法觀察膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)變化，實時熒光定量PCR法（q-PCR）檢測大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)RhoA、ROCK與ERK1/2的基因表達(dá)。結(jié)果：空白組大鼠軟骨組織四層結(jié)構(gòu)規(guī)整清晰，基質(zhì)染色均勻，未見異常。與空白組相比，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表層可見局部缺損，軟骨細(xì)胞排列紊亂，基質(zhì)染色變淺，RhoA mRNA、ROCK mRNA及ERK2 mRNA的表達(dá)均明顯上調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），ERK1 mRNA表達(dá)變化未見明顯差異（P＞0.05）。溫針組軟骨組織形態(tài)總體優(yōu)于模型組，ROCK mRNA的含量相較于模型組顯著下降（P＜0.01），其余指標(biāo)兩組間統(tǒng)計學(xué)差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)論：本研究結(jié)果表明RhoA/ROCK信號通路參與早期膝骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)展；溫針可能通過抑制ROCK的基因表達(dá)參與調(diào)控RhoA/ROCK信號通路，從而緩解KOA癥狀，改善一般情況，延緩軟骨組織退變。

【關(guān)鍵詞】? 膝骨性關(guān)節(jié)炎；溫針；RhoA；ROCK；ERK1/2

【中圖分類號】R245??? 【文獻(xiàn)標(biāo)志碼】 A??? 【文章編號】1007-8517（2023）20-0015-05

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.20.zgmzmjyyzz202320005

Effects of Warm Needle Moxibustion at EX-LE4， ST35 on RhoA/ROCK Signaling

PathwayinKnee Osteoarthritis Model Rats

SHI Xinyue1? HONG Kunda1，2*

1.College of Acupuncture， Fujian University of Traditional Chinese Medicine， Fuzhou 350122，China;

2. Rehabilitation Medicine Department，The second affiliated hospital of Fujian Medical University， Quanzhou 362000，China

Abstract：Objective The purpose is todiscuss the effects of warm needle moxibustion at EX-LE4， ST35 on RhoA/ROCK signaling pathway in knee osteoarthritis rats， and to further clarify the target of warm needle moxibustion， so as to provide molecular theoretical basis for clinical practice. Methods 24 SPF male SD rats were randomly divided into blank group， model group and warm needle moxibustion group（WNM）， with 8 rats in each group. Papain was used to replicate knee osteoarthritis model， the blank group and the model group were same gripped and fixed as the WNM group， and the WNM group was treated with warm needle therapy， during which the general condition of the rats was observed. The morphologic changes of knee cartilage were observed by HE staining， and the gene expressions of RhoA， ROCK， ERK1/2 in the knee cartilage of rats were detected by q-PCR. Results In blank group， the structure of the four layers of cartilage tissue was clear and regular， the matrix staining was uniform， and no abnormality was observed. Compared with the blank group， local defectson the surface， disordered chondrocytes and lighter matrix staining were observed of knee cartilage in model rats， and the expressions of RhoA mRNA， ROCK mRNA and ERK2 mRNA in model group were significantly increase， which had statistical significance （P<0.01）， while there was no difference in the expression of ERK1 mRNA between model group and WNM group（P>0.05）. The cartilage morphology of WNM group was better than that of model group in general， and the content of ROCK mRNA was significantly decreased compared with model group （P<0.01）， while the other indexes were not statistically significant between the two groups （P>0.05）. Conclusions The result of this study indicates that the main factors of RhoA/ROCK signaling pathway， is involved in the development of early knee osteoarthritis. Warm needle moxibustion can relieve the symptoms of knee osteoarthritis， improve the general condition and delay cartilage degeneration. It may regulate the RhoA/ROCK signaling pathway mainly by inhibiting the expression of ROCK mRNA.

Keywords：Knee Osteoarthritis; Warm Needle Moxibustion; RhoA; ROCK; ERK1/2

膝骨性關(guān)節(jié)炎（knee osteoarthritis，KOA）是導(dǎo)致老年患者殘疾的最常見的慢性膝關(guān)節(jié)疾病之一［1］，其發(fā)病率隨著年齡的增長而增加，發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，以不可逆的膝關(guān)節(jié)軟骨退變、破壞及軟骨下骨骨質(zhì)增生為主要特征［2］，且臨床暫無特效藥物，以疼痛為主的諸多癥狀對患者的生活質(zhì)量造成了極大負(fù)面影響。保守治療對改善輕中度KOA癥狀、延緩KOA病程意義重大，然而長期口服非甾體抗炎藥對胃腸道具有一定副作用，膝關(guān)節(jié)腔注射藥物亦有其局限性［1，3］。溫針療法具有簡、便、效、廉的特點，諸多研究證明溫針治療KOA療效肯定［4］，無明顯不良反應(yīng)［5，6］，但其起效機(jī)制仍在進(jìn)一步探索中。

有研究［7］表明RhoA/ROCK信號通路與KOA的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)：骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生時，軟骨細(xì)胞將經(jīng)歷肥大、終末分化、骨化、凋亡這一系列過程［8］，軟骨細(xì)胞肥大等形態(tài)改變與分化、骨化、凋亡等生物活性均可受細(xì)胞骨架介導(dǎo)，軟骨細(xì)胞骨架破壞是導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生退行性變的重要因素之一［9］。RhoA與ROCK是參與細(xì)胞骨架調(diào)控的重要因子，當(dāng)ROCK被活化的RhoA激活后，能進(jìn)一步靶向調(diào)控ezrin、tau等細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白，亦可通過LIM激酶（LIMK）和肌球蛋白輕鏈激酶（MLCK），分別對底物肌動蛋白解聚因子和肌球蛋白輕鏈進(jìn)行調(diào)節(jié)，繼而影響肌動蛋白絲，改變軟骨細(xì)胞骨架排列［7，10］。除此之外，活化的RhoA、ROCK還能與Ras-Raf-MEK信號通路產(chǎn)生協(xié)同作用，共同調(diào)控ERK1/2的表達(dá)，而ERK1/2與KOA病程同樣有所關(guān)聯(lián)［11］。故本研究從RhoA/ROCK信號通路著手，觀察溫針對KOA模型大鼠RhoA/ROCK信號通路上關(guān)鍵因子RhoA、ROCK與其下游ERK1/2基因表達(dá)情況的影響，結(jié)合組織形態(tài)學(xué)，初步探討溫針治療KOA可能存在的作用機(jī)制，以期為臨床中使用溫針治療KOA提供分子理論依據(jù)。

1? 材料與方法

1.1? 實驗動物? 2月齡SPF級雄性SD大鼠24只，體質(zhì)量（200±20）g，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，動物許可證編號：SCXK（京）2019-0008。分籠飼養(yǎng)，每籠4只，自由飲水進(jìn)食，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。因后續(xù)干預(yù)過程中溫針組1只大鼠死亡，故溫針組最終樣本量為7只。

1.2? 主要試劑與儀器? 木瓜蛋白酶（上海麥克林生化科技有限公司，P6321），異氟烷（深圳瑞沃德生命科技有限公司，R510-22-10）。艾段（南陽仲圣藥業(yè)有限公司，規(guī)格0.7 cm×1 cm），華佗牌一次性使用無菌針灸針（蘇州醫(yī)療用品廠有限公司，規(guī)格0.25 mm×13 mm）。多聚甲醛固定液、EDTA脫鈣液、HE染液套裝（均來自武漢賽維爾生物科技有限公司）。強化RNA提取試劑盒 TransZol Up、反轉(zhuǎn)錄試劑盒All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR、實時熒光定量PCR試劑盒 Green qPCR SuperMix（+Dye II）（均來自北京全式金有限公司），qPCR引物（由福州尚亞生物技術(shù)有限公司提供）。ZHPW-250恒溫?fù)u床（BLabotery），

病理切片機(jī)（上海徠卡儀器有限公司），正置光學(xué)顯微鏡（日本尼康株式會社），Centrifuge 5424R高速低溫離心機(jī)（Eppendorf中國有限公司），NanoDrop One微量紫外-可見光分光光度計、ABI QuantStudio 3熒光定量PCR儀（均為賽默飛世爾科技（中國）有限公司）。

1.3? 動物分組與造模? 隨機(jī)數(shù)字法將24只SD大鼠均分至空白組、模型組與溫針組（8只/組）。除空白組外，其余大鼠采用木瓜蛋白酶法［12］復(fù)制膝骨性關(guān)節(jié)炎模型，動物用異氟烷麻醉，仰臥位置于操作臺，施術(shù)部位消毒，術(shù)者從髕韌帶外側(cè)凹陷處進(jìn)針，依次向大鼠左、右膝關(guān)節(jié)腔注射4％木瓜蛋白酶生理鹽水溶液0.2 mL，注射完畢助手以無菌棉球按壓針眼防止藥液流出，并拉伸大鼠下肢使大鼠膝關(guān)節(jié)被動屈伸10次左右，幫助藥液充分吸收。給藥在適應(yīng)性飼養(yǎng)后的第1天、第4天、第7天進(jìn)行，最后一次注射結(jié)束后正常飼養(yǎng)2周讓模型發(fā)展。期間觀察大鼠精神狀態(tài)、毛色、活動量、進(jìn)食、飲水等一般情況。

1.4? 干預(yù)方法? 用黑襪與自制固定板將大鼠仰臥位固定，膝關(guān)節(jié)保持自然屈曲?？瞻捉M與模型組同等抓取固定，不進(jìn)行治療。溫針組采用溫針灸法，取雙側(cè)內(nèi)膝眼、外膝眼（選穴定位方法參考《實驗針灸學(xué)》［13］），穴位局部消毒后以毫針向膝關(guān)節(jié)方向直刺約5 mm，并在針柄處放置艾段，從下方點燃，1壯燃盡后更換另1壯，共灸2壯，留針20 min；每日1次，干預(yù)6 d休息1 d，共干預(yù)2周。期間觀察大鼠精神狀態(tài)、毛色、活動量、進(jìn)食、飲水等一般情況。

1.5? 取材及檢測指標(biāo)? 末次干預(yù)結(jié)束后動物禁食12 h，不禁水，次日取材。麻醉后，每組隨機(jī)選取4只大鼠，用手術(shù)刀刮取搜集其右側(cè)膝關(guān)節(jié)脛骨平臺與股骨髁軟骨組織碎片，-80 ℃儲存，用于后續(xù)q-PCR檢測。每組其余大鼠的膝關(guān)節(jié)用于組織形態(tài)學(xué)對比觀察，完整分離關(guān)節(jié)后將其放入多聚甲醛中固定24 h，隨后EDTA脫鈣、常規(guī)脫水、包埋、切片（4 μm厚）及脫蠟后，按HE染液套裝說明書進(jìn)行染色操作。軟骨組織碎片液氮研磨后

用強化 RNA提取試劑盒

提取軟骨組織總RNA，測其濃度后，以RNA為模板按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書配制RT反應(yīng)液，42 ℃孵育15 min，85 ℃滅活5 s后得到cDNA；

按實時熒光定量 PCR 試劑盒說明書配制qPCR反應(yīng)液，總反應(yīng)體系20 μL，94 ℃30 s預(yù)變性后，94 ℃ 5 s、60 ℃ 30 s循環(huán)40次；以GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計算RhoA、ROCK、ERK1/2的mRNA相對表達(dá)量。具體引物序列見表1。

1.6? 統(tǒng)計學(xué)方法? 采用軟件SPSS 23.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計量資料采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)誤表示，符合正態(tài)分布的多組計量資料采用單因素方差分析，根據(jù)方差是否齊平進(jìn)一步用LSD檢驗或Games Howell檢驗進(jìn)行兩兩比較；若多組計量資料不符合正態(tài)分布則采用多樣本秩和檢驗。檢驗水準(zhǔn)α=0.05，即P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2? 結(jié)果

2.1? 一般情況? 空白組大鼠一般情況全程未見異常，精力充沛，毛發(fā)柔順、富有光澤，活動如常、行動敏捷，飲食二便如常，膝關(guān)節(jié)骨性標(biāo)志明顯。模型組與溫針組大鼠造模期間精神萎靡，毛發(fā)失去光澤、略顯干枯，活動明顯減少、喜蜷縮，飲食尚可，大便基本正常。干預(yù)期間，模型組與溫針組大鼠精神狀態(tài)及毛發(fā)色澤均有所恢復(fù)，模型組仍不喜活動，行走緩慢，飲食二便未見明顯異常，觸摸發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)骨性標(biāo)志變淺明顯；溫針組毛發(fā)較模型組更具光澤，隨著干預(yù)次數(shù)增加活動逐漸增多，可見跑、跳動作，飲食二便正常，觸摸發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)骨性標(biāo)志變淺，但對局部按壓刺激反應(yīng)較小。

2.2? 各組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)學(xué)對比? HE染色后，軟骨基質(zhì)與胞質(zhì)呈粉色，軟骨細(xì)胞核呈深藍(lán)色?？瞻捉M大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織四層結(jié)構(gòu)清晰規(guī)整，表層完整光滑，中間層與放射層軟骨細(xì)胞呈條索狀整齊排列，基質(zhì)染色均勻，未見異常；KOA模型大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨表層毛躁，可見局部裂痕，軟骨細(xì)胞數(shù)量彌漫性增加、排列紊亂，基質(zhì)染色輕度變淺；溫針組軟骨表層完整，軟骨細(xì)胞數(shù)量彌漫性增加、排列略不規(guī)則，基質(zhì)染色稍不均勻，但均優(yōu)于模型組。如圖1、圖2所示。

2.3? 各組大鼠目的基因相對表達(dá)量比較? 模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)RhoA mRNA、ROCK mRNA及ERK2 mRNA的表達(dá)相較于空白組均明顯升高，統(tǒng)計學(xué)差異顯著（P＜0.01）；而模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織內(nèi)ERK1 mRNA的表達(dá)與空白組對比不具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），暫不可認(rèn)為兩組間ERK1的基因相對表達(dá)量有所差異。與模型組對比，溫針組RhoA/ROCK信號通路的RhoA及通路下游ERK1/2的基因表達(dá)變化差異未達(dá)到統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），溫針組ROCK mRNA表達(dá)則明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。見表2，如圖3所示。

3? 討論

3.1? RhoA/ROCK信號通路與KOA? Rho蛋白家族屬于Ras超家族，是一組分子量在20～25kDa的小GTP結(jié)合蛋白，具有GTP酶活性，又稱作Rho GTP酶［14］；RhoA是Rho蛋白家族的成員之一，在例如細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)化和細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)等多個細(xì)胞過程中發(fā)揮重要作用［15］，其通過與GDP結(jié)合時失活，而與GTP結(jié)合時活化的方式，起到“分子開關(guān)”的作用。ROCK全稱Rho激酶（Rho kinase，ROCK），是RhoA下游重要的效應(yīng)靶標(biāo)［16］，在細(xì)胞收縮、遷移、凋亡、存活與增殖等過程中發(fā)揮多種功能［17］。RhoA-GTP與ROCK的Rho結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD）結(jié)合使之構(gòu)象發(fā)生改變，ROCK的自身抑制解除從而被激活，繼而向下傳遞胞外信號，發(fā)揮效用［18］。

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)KOA發(fā)展過程中確實存在RhoA/ROCK通路的異常激活：文剛等［19］搜集OA患者的關(guān)節(jié)軟骨組織進(jìn)行體外軟骨細(xì)胞培養(yǎng)，研究表明與正常對照組軟骨組織對比，OA組軟骨細(xì)胞RhoA、ROCK1/2的mRNA與蛋白表達(dá)水平均高于正常對照組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示RhoA/ROCK通路異常激活可能是誘導(dǎo)骨性關(guān)節(jié)炎形成的重要原因之一；Tiftik R N等［20］在IL-1β誘導(dǎo)的骨性關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激的研究中發(fā)現(xiàn)ROCK抑制劑法舒地爾可降低ROCK2、IL-6、TNF-α、COX-2等因子的蛋白表達(dá)，ROCK抑制劑可能是一種治療OA患者的有益選擇。另一方面，又有研究表明抑制RhoA/ROCK信號通路將阻礙軟骨細(xì)胞的分化形成：轉(zhuǎn)錄因子SOX9直接調(diào)節(jié)構(gòu)成軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的主要蛋白聚糖和膠原蛋白的表達(dá)，Haudenschild D R等［21］研究發(fā)現(xiàn)SOX9包含ROCK的共有磷酸化位點，ROCK通路的激活能導(dǎo)致Sox9磷酸化與轉(zhuǎn)錄激活來調(diào)節(jié)軟骨細(xì)胞基因表達(dá)，促進(jìn)軟骨分化；而Zhong? W等［22］也發(fā)現(xiàn)ROCK抑制劑和YAP/TAZ的敲低會破壞骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的纖維軟骨形成分化，影響軟骨細(xì)胞形成。

3.2? RhoA/ROCK與ERK1/2? MAPKs是一組高度保守的絲氨酸/蘇氨酸激酶，ERK1/2是其重要一支，且與KOA病程聯(lián)系緊密：激活p38MAPK與ERK1/2通路將誘導(dǎo)骨性關(guān)節(jié)炎炎癥反應(yīng)，加劇軟骨退化進(jìn)程，抑制ERK1/2信號通路則可減輕外界刺激對軟骨細(xì)胞的不利影響［23］。在經(jīng)典的ERK1/2通路中，細(xì)胞膜上配體誘導(dǎo)的受體酪氨酸激酶（RTK）激活并招募GTP結(jié)合形式的小GTP酶Ras，隨即觸發(fā)Raf的二聚化和激活，從而啟動下游磷酸化級聯(lián)反應(yīng)，依次激活MEK和ERK［24］。RhoA/ROCK信號通路已被諸多研究證明位于ERK1/2上游，且RhoA/ROCK信號通路被激活后，能協(xié)同Ras-Raf-MEK信號通路調(diào)控ERK1/2的表達(dá)［11］。但RhoA/ROCK對ERK存在差異性調(diào)控，目前仍在探討中：Taglietti V等［25］研究發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK軸對ERK呈負(fù)性調(diào)節(jié)，即RhoA和ROCK激活會抑制ERK激酶活性，從而促進(jìn)核因子Nfix及其激活劑JunB的表達(dá)；姚海華等［26］則通過動物實驗發(fā)現(xiàn)運用ROCK抑制劑Y27632能夠降低MEK、ERK1/2的基因與蛋白表達(dá)。這種差異可能和RhoA不同位點被ERK1/2磷酸化相關(guān)，還待深入研究［27］。

3.3? 溫針對RhoA/ROCK信號通路的影響? 在針對KOA的治療中，RhoA/ROCK及下游的ERK1/2表達(dá)差異同樣值得探討。如葉國平［11］的研究表明，與正常組對比，KOA模型大鼠體內(nèi)的RhoA、ROCK、ERK1/2及p-ERK1/2的蛋白表達(dá)均明顯升高，電針治療可在不同程度上降低上述指標(biāo)的蛋白表達(dá)，延緩膝關(guān)節(jié)軟骨退變；楊宜锜等［28］則發(fā)現(xiàn)ERK信號通路被鳶尾素激活后，反而抑制了骨細(xì)胞凋亡、緩解骨性關(guān)節(jié)炎病程。本研究結(jié)果顯示，模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)出現(xiàn)軟骨表層局部輕度缺損、軟骨細(xì)胞排列失序等改變，軟骨組織內(nèi)的RhoA mRNA、ROCK mRNA及ERK2 mRNA的表達(dá)與空白組相比均有所上調(diào)，ERK1 mRNA表達(dá)變化無統(tǒng)計學(xué)意義，提示KOA病程早期確實存在RhoA/ROCK信號通路的異常激活，且對下游ERK1/2的影響程度存在差異；溫針組大鼠毛發(fā)、活動量、膝關(guān)節(jié)對疼痛刺激的反應(yīng)等一般情況相較模型組均有所改善，膝關(guān)節(jié)軟骨組織形態(tài)改變介于空白組與模型組之間，ROCK mRNA的含量相較于模型組顯著下降，其余指標(biāo)如RhoA、ERK1 mRNA雖略微高于模型組、ERK2 mRNA較模型組雖有降低趨勢，但兩組間統(tǒng)計學(xué)差異均不顯著。本實驗結(jié)果表明溫針能有效緩解膝骨性關(guān)節(jié)炎癥狀，改善一般情況，對關(guān)節(jié)軟骨有保護(hù)作用，溫針可能主要通過抑制ROCK的基因表達(dá)參與對RhoA/ROCK信號通路的調(diào)控。因本研究造模給藥結(jié)束至取材共歷時4周，溫針干預(yù)僅有2周，干預(yù)周期與其他研究的療程存在一定差異，可能還不足以使溫針對RhoA/ROCK信號通路產(chǎn)生較大影響，日后可以考慮調(diào)整干預(yù)頻次、延長干預(yù)周期等以更符合臨床實際，具體還待更進(jìn)一步研究。

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（收稿日期：2023-02-07? 編輯：劉? 斌）