電針通過(guò)調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶-2/金屬蛋白酶組織特異性抑制劑-1對(duì)跟腱損傷大鼠生物力學(xué)及損傷修復(fù)的影響※

白文博 劉國(guó)偉 李 娜

(1．河北省石家莊市中醫(yī)院功能科,河北 石家莊 050051;2．河北省石家莊市中醫(yī)院針灸科,河北 石家莊 050051)

跟腱是人體最重要的多功能肌腱之一,跟腱斷裂是臨床最常見(jiàn)的肌腱損傷[1]。據(jù)報(bào)道,我國(guó)每年跟腱斷裂人數(shù)不斷增多,最常見(jiàn)于中青年活動(dòng)人群,且男性居多[2]。臨床對(duì)跟腱斷裂患者多進(jìn)行手術(shù)治療,但術(shù)后組織粘連問(wèn)題仍是臨床需解決的問(wèn)題[3]。研究發(fā)現(xiàn),針灸能調(diào)節(jié)機(jī)體功能,增強(qiáng)抵抗疾病的能力[4]。針灸可通過(guò)激發(fā)機(jī)體內(nèi)止痛物質(zhì)的釋放而緩解疼痛[5]。治療跟腱炎時(shí)取跟腱疼痛穴位進(jìn)行針灸,可起到治療效果[6]?；|(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)是機(jī)體內(nèi)水解酶之一,能對(duì)幾乎所有的細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行降解,廣泛存在于各種結(jié)締組織中[7]。金屬蛋白酶組織特異性抑制劑-1(TIMP-1)是機(jī)體天然存在的基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)抑制劑,廣泛存在于機(jī)體的組織和體液中。TIMP-1對(duì)MMPs家族的所有成員均有抑制作用,MMPs/金屬蛋白酶組織特異性抑制劑(TIMPs)調(diào)節(jié)異常可引起細(xì)胞外基質(zhì)合成或降解的失衡,介導(dǎo)各種組織、器官纖維化和疾病的發(fā)生發(fā)展[8]。有研究證實(shí),MMP-2和TIMP-1在跟腱損傷中高表達(dá),但具體機(jī)制尚不清楚[9]。本研究通過(guò)給予跟腱損傷大鼠電針治療,觀察電針通過(guò)調(diào)控MMP-2/TIMP-1對(duì)跟腱損傷大鼠生物力學(xué)及損傷修復(fù)的影響,結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 雄性SD大鼠50只,8周齡,體質(zhì)量200～220 g,均購(gòu)自青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,許可證號(hào):SCXK(青)2018-0013。飼養(yǎng)于大鼠動(dòng)物房,室溫恒定于18～22 ℃,房間內(nèi)光照12 h,晝夜交替。

1.2 試劑與儀器 4%異氟烷(上海江萊生物科技有限公司);MMP-2抗體(南京歐凱生物科技有限公司);TIMP-1抗體(武漢伊艾博生物科技有限公司);干擾金屬蛋白酶組織特異性抑制劑-1(sh-TIMP-1)質(zhì)粒(上海澤葉生物科技有限公司);4%多聚甲醛固定液、蘇木素-伊紅(北京索萊寶科技有限公司);SH08SDZ.ⅡA型電子治療儀(北京北信科儀分析儀器有限公司);熒光顯微鏡、倒置顯微鏡、透射電鏡(日本OLYMPUS公司);5415D型離心機(jī)(德國(guó)Eppendorf公司);AGIS-MS型電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)(日本島津公司)。

1.3 動(dòng)物分組及模型制備 將50只SD大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為5組,假手術(shù)組、模型組、電針組、sh-TIMP-1組和電針+sh-TIMP-1組,每組10只。采用跟腱縱軸中間橫行貫通切斷法制備跟腱損傷大鼠模型[10]。各組大鼠用麻醉呼吸機(jī)吸入4%異氟烷麻醉,仰臥位固定于無(wú)菌操作臺(tái),用碘伏消毒右后肢,在右后肢跟腱上方自近端向遠(yuǎn)端縱行切開(kāi)跟腱表面皮膚,將約2 cm亮白色的跟腱全段完全暴露在外,肉眼可見(jiàn)跟腱分為粗細(xì)兩端。先將相對(duì)較細(xì)的副腱切除,使用垂直于膠原纖維的15號(hào)手術(shù)刀刀片,在肌腱跟骨插入,近端約5 mm處橫斷跟腱,后縫合斷裂跟腱,并逐層縫合皮膚。假手術(shù)組僅劃開(kāi)跟腱表面皮膚,游離跟腱周邊軟組織,而后間斷縫合皮膚傷口。

1.4 干預(yù)方法 造模結(jié)束后次日,電針組大鼠仰臥位固定,取腎俞、足三里、陽(yáng)陵泉,腎俞(第2腰椎棘突下旁開(kāi)7 mm,左右各一穴)刺入8 mm,足三里(雙膝關(guān)節(jié)外側(cè),約腓骨小頭下5 mm處)刺入7 mm,陽(yáng)陵泉(距足三里上外側(cè)5 mm,左右各一穴)刺入6 mm。行針1 min后穴位加用電子治療儀治療,刺激強(qiáng)度以大鼠腿部肌肉出現(xiàn)微微顫動(dòng)為度,通電時(shí)間為5 min,振動(dòng)波幅為2 Hz。電針每日治療1次,6天為1個(gè)療程,共治療3個(gè)療程。sh-TIMP-1組大鼠跟腱組織中注射sh-TIMP-1質(zhì)粒300 μL治療,每周治療1次,共治療3周。電針+sh-TIMP-1組大鼠在跟腱組織中注射sh-TIMP-1質(zhì)粒300 μL,同時(shí)予電針干預(yù),方法同電針組。假手術(shù)組、模型組大鼠不予任何干預(yù)。

1.5 實(shí)驗(yàn)樣本取材 最后一次干預(yù)結(jié)束后24 h取材,麻醉各組大鼠,取出實(shí)驗(yàn)大鼠的跟腱組織,將跟腱組織于0.9%氯化鈉注射液中浸泡,紗布包裹浸泡的跟腱組織于凍存管中,置于-80 ℃冰箱待用。

1.6 生物力學(xué)指標(biāo)檢測(cè) 將大鼠跟腱取出并夾于夾具中,采用電子萬(wàn)能試驗(yàn)機(jī)進(jìn)行跟腱生物力學(xué)性能測(cè)試。檢測(cè)前對(duì)跟腱循環(huán)拉伸預(yù)處理。實(shí)驗(yàn)時(shí)用加載速率3 mm/min進(jìn)行拉伸破壞實(shí)驗(yàn)。以跟腱組織不在夾具處斷裂為實(shí)驗(yàn)成功標(biāo)準(zhǔn),記錄載荷-變性曲線。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中在跟腱組織上不斷滴加0.9%氯化鈉注射液保濕組織,后對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并計(jì)算力學(xué)參數(shù)。假手術(shù)組大鼠拉斷點(diǎn)均在肌肉連接處(跟腱無(wú)損傷縫合),評(píng)估跟腱損傷愈合情況失真,故未對(duì)假手術(shù)組進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)試。

1.7 跟腱組織病理學(xué)變化 取出各組大鼠跟腱組織,固定于4%多聚甲醛固定液中,組織脫水后用石蠟包埋組織,切成組織切片,厚度為5 μm?？鞠浜婵厩衅M織30 min,0.9%氯化鈉注射液清洗切片組織3次,每次沖洗1 min。蘇木素染色3 min,自來(lái)水沖洗切片3 min,繼續(xù)將組織經(jīng)伊紅染色10 s,乙醇脫水,向組織切片中滴加中性樹(shù)脂。將組織切片置于顯微鏡下觀察。

1.8 蛋白免疫印跡法(Western blotting)檢測(cè)跟腱組織中MMP-2、TIMP-1蛋白表達(dá) 取各組大鼠跟腱組織20 mg,將組織在冰上研磨呈粉末狀,將裂解液加入到組織中,制成組織懸液后離心,對(duì)蛋白樣本總濃度進(jìn)行測(cè)定。轉(zhuǎn)移蛋白樣品至聚偏二氟乙烯膜(PVDF),加入5%脫脂奶粉封閉樣品2 h。蛋白樣品中分別加入一抗MMP-2、TIMP-1、β-actin,孵育后洗滌蛋白樣品,將HRP標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG(1∶2000)加入到蛋白樣品中,室溫孵育1 h。用底物化學(xué)發(fā)光(ECL)液顯色,Image J軟件觀察條帶灰度值并計(jì)算蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠生物力學(xué)指標(biāo)比較 假手術(shù)組大鼠拉斷點(diǎn)均在肌肉連接處(跟腱無(wú)損傷縫合),評(píng)估跟腱損傷愈合情況失真,未對(duì)假手術(shù)組進(jìn)行生物力學(xué)測(cè)試;電針組、sh-TIMP-1組、電針+sh-TIMP-1組大鼠最大載荷、能量吸收、彈性模量和最大應(yīng)力均高于模型組(P<0.05),應(yīng)變低于模型組(P<0.05),比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;電針+sh-TIMP-1組大鼠最大載荷、能量吸收、彈性模量和最大應(yīng)力均高于電針組、sh-TIMP-1組(P<0.05),應(yīng)變低于電針組、sh-TIMP-1組(P<0.05),比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 4組大鼠生物力學(xué)指標(biāo)比較

2.2 5組大鼠跟腱組織病理學(xué)變化 假手術(shù)組大鼠跟腱纖維排列有序,無(wú)炎癥浸潤(rùn);模型組大鼠肌腱組織增生明顯,纖維結(jié)構(gòu)排列疏松且無(wú)序,并伴有新生血管生成和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);電針組大鼠跟腱組織得到明顯改善,跟腱組織纖維結(jié)構(gòu)排列較整齊,且新生血管和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕;sh-TIMP-1組大鼠跟腱組織纖維結(jié)構(gòu)排列較整齊,有新生血管和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn);電針+sh-TIMP-1組大鼠跟腱組織改善,跟腱組織纖維結(jié)構(gòu)排列較整齊,且新生血管和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)程度明顯減輕。見(jiàn)圖1。

▲區(qū)域?yàn)楦靺^(qū)

2.3 5組大鼠跟腱組織中MMP-2、TIMP-1蛋白表達(dá)及MMP-2/TIMP-1比值比較 與假手術(shù)組比較,模型組大鼠跟腱組織中MMP-2、TIMP-1蛋白表達(dá)及MMP-2/TIMP-1比值均升高(P<0.05);與模型組比較,電針組、sh-TIMP-1組、電針+sh-TIMP-1組大鼠跟腱組織中MMP-2、TIMP-1蛋白表達(dá)及MMP-2/TIMP-1比值均降低(P<0.05);與電針組、sh-TIMP-1組比較,電針+sh-TIMP-1組大鼠跟腱組織中MMP-2、TIMP-1蛋白表達(dá)及MMP-2/TIMP-1比值均降低(P<0.05)。見(jiàn)表2。

表2 5組大鼠跟腱組織中MMP-2、TIMP-1蛋白表達(dá)及MMP-2/TIMP-1比值比較

3 討論

跟腱損傷在臨床骨科最為常見(jiàn),由于跟腱損傷修復(fù)相對(duì)困難,且愈合時(shí)間長(zhǎng),嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量[11]。雖然臨床治療肌腱損傷有一定療效,但效果并不十分理想[12]。目前,中醫(yī)學(xué)治療跟腱斷裂有較好療效,能有效減少并發(fā)癥,并促進(jìn)組織愈合,針刺對(duì)人體功能產(chǎn)生廣泛作用[13],效果尤為顯著。有研究報(bào)道[14-17],針刺干預(yù)治療跟腱末端病,其臨床癥狀及生物力學(xué)功能顯著改善。

跟腱組織在載荷作用下能發(fā)生結(jié)構(gòu)和形態(tài)的變化,進(jìn)而對(duì)所承受的載荷環(huán)境進(jìn)行適應(yīng)[18]。但跟腱的功能適應(yīng)性存在一個(gè)載荷范圍,且有最佳載荷值。在該范圍內(nèi)的載荷量可顯著提升肌腱的生物力學(xué)性能,過(guò)大的載荷值甚至可能損傷跟腱[19]。本研究通過(guò)對(duì)各組大鼠生物力學(xué)指標(biāo)檢測(cè)發(fā)現(xiàn),電針組大鼠最大載荷、能量吸收、彈性模量和最大應(yīng)力均增加,應(yīng)變指標(biāo)顯著降低,提示電針能提高跟腱損傷大鼠跟腱生物力學(xué)性能。跟腱彈性模量的增加可導(dǎo)致變性跟腱彈性力增大,即在其他條件相同時(shí)肌腱能傳遞的肌力更大。由于肌腱損傷及斷裂通常是在一定應(yīng)變下肌腱內(nèi)部的膠原纖維部分或全部遭到破壞,故跟腱彈性模量的增加及應(yīng)變的減小,可使肌腱受力損傷的幾率降低。劉佳麗等[20]研究發(fā)現(xiàn),可通過(guò)增加跟腱損傷大鼠跟腱生物力學(xué)性能而產(chǎn)生功能適應(yīng)性變化,進(jìn)而對(duì)大鼠跟腱損傷的恢復(fù)起促進(jìn)作用。

MMP-2是專門分解Ⅰ型膠原的蛋白酶,在肌腱組織的代謝與重塑中發(fā)揮重要作用,在正常肌腱組織中含量極少,在變性、損傷或壞死的肌腱組織中含量會(huì)迅速增加,其升高幅度也與肌腱變性、受損或壞死程度呈正比,以發(fā)揮分解變性或者壞死肌腱組織的作用。TIMP-1作為MMP-2的拮抗劑,在實(shí)驗(yàn)中常會(huì)作為MMP-2的配對(duì)指標(biāo)共同測(cè)定,以檢驗(yàn)MMP-2的正確性,其含量會(huì)隨著MMP-2的升高而升高[21]。本研究結(jié)果顯示,電針可降低跟腱損傷大鼠跟腱組織中MMP-2和TIMP-1蛋白表達(dá),表明跟腱組織內(nèi)變性和壞死的肌腱已經(jīng)大量減少,有了較大程度的恢復(fù)。且HE染色結(jié)果也證實(shí)了電針能促進(jìn)跟腱損傷大鼠的跟腱組織恢復(fù)。史曉偉等[22]研究證實(shí),跟腱末端病發(fā)生時(shí)跟腱組織中MMP-1和TIMP-1表達(dá)均增加,提示MMP-1和TIMP-1參與跟腱末端病的重塑。因此猜測(cè)能否通過(guò)調(diào)控MMP-2/TIMP-1表達(dá)而增加跟腱生物力學(xué)性能,促進(jìn)跟腱組織愈合。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)向跟腱損傷模型大鼠注射sh-TIMP-1發(fā)現(xiàn),sh-TIMP-1能抑制跟腱損傷大鼠跟腱組織中MMP-2、TIMP-1蛋白表達(dá),升高跟腱生物力學(xué)性能,顯著改善跟腱損傷組織病理學(xué)變化,對(duì)跟腱損傷的修復(fù)起促進(jìn)作用。為進(jìn)一步證實(shí)電針通過(guò)對(duì)MMP-2/TIMP-1的調(diào)控而影響跟腱損傷的生物力學(xué)和損傷修復(fù),本研究通過(guò)聯(lián)合使用電針和sh-TIMP-1干預(yù)治療,結(jié)果顯示電針聯(lián)合sh-TIMP-1組的MMP-2、TIPM-1蛋白表達(dá)更低,且跟腱生物力學(xué)性能、損傷組織的修復(fù)效果優(yōu)于單獨(dú)使用電針或sh-TIMP-1,由此證明sh-TIMP-1對(duì)跟腱損傷大鼠的損傷恢復(fù)有促進(jìn)作用,進(jìn)一步證實(shí)電針可通過(guò)調(diào)控MMP-2/TIMP-1信號(hào)通路促進(jìn)跟腱損傷大鼠損傷修復(fù)。

綜上所述,電針可增加跟腱損傷大鼠跟腱生物力學(xué)性能,促進(jìn)損傷修復(fù),其機(jī)制可能與抑制MMP-2/TIMP-1表達(dá)有關(guān)。