小兒咳喘靈顆粒中山銀花檢查方法的研究

胡 鳳 韓志雙 鐘姝霞 陳建平

四川省自貢檢驗檢測院，四川 自貢 643000

金銀花與山銀花均為忍冬科忍冬屬植物，金銀花為忍冬科植物忍冬的干燥花蕾或帶初開的花，山銀花為忍冬科植物灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬或黃褐毛忍冬的干燥花蕾或帶初開的花，二者在一些功效方面存在相同性[1]。2005版之前的《中國藥典》將山銀花收載于金銀花項下，山銀花為2010年中國藥典新收載的品種。因此，在金銀花的實際應用中，存在著金銀花與山銀花混用的現(xiàn)象。

小兒咳喘靈顆粒由麻黃、金銀花、苦杏仁、板藍根、石膏、甘草、瓜蔞七味中藥組成，具有宣肺、清熱，止咳、祛痰、平喘之功效，用于上呼吸道感染，氣管炎，肺炎，咳嗽等[2～3]。經調研發(fā)現(xiàn)，同規(guī)格的小兒咳喘靈顆粒的市售價格由5元至30元不等，價格差距較大，而金銀花的價格較山銀花貴，因此不排除有些企業(yè)為了降低成本，用山銀花代替金銀花投料的可能。因此，有必要開展小兒咳喘靈顆粒中山銀花檢查方法研究。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent1200高效液相色譜儀，Alltech 2000ES型蒸發(fā)光散射檢測器，AB 3000-4000QTRAP液相色譜-質譜聯(lián)用儀，XSE-205梅特勒電子天平，UPR-II-20L純水儀，SCQ超聲波清洗器。

1.2 試藥 灰氈毛忍冬皂苷乙(批號：111814-202106，含量96.1%，中國食品藥品檢定研究院)；乙腈、甲酸為色譜純；水為超純水；甲醇等試劑為分析純。實驗用中藥飲片麻黃、金銀花、苦杏仁、板藍根、石膏、甘草、瓜蔞、山銀花為市售飲片。收集小兒咳喘靈顆粒10批，均為市售品種，分別來自10個不同生產廠家。

2 方法與結果

2.1 HPLC-ELSD法色譜條件 色譜柱：月旭 Xtimate C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相為乙腈(B)、水(A)；梯度洗脫條件：20% B→28% B(0～8 min)，28% B→33% B(8～21 min)，33% B(21～24 min)，33% B→20% B(24～26 min)；流速為1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量：10 μL；不分流模式；漂移管溫度：106 ℃；氣體流量：2.2 mL/min。

2.2 LC-MS/MS法色譜條件 色譜柱：Agilent InfinityLab Poroshell120 SB-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，2.7 μm)；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液(28∶72)；流速為0.3 mL/min；柱溫40 ℃；進樣量為5 μL。

2.3 LC-MS/MS法質譜條件 電離方式：電噴霧負離子模式；檢測方式：多反應檢測(MRM)；氣簾氣SUR(psi)：25；霧化氣(psi)：60；輔助加熱氣(psi)：60；離子源電壓(V)：4500(-)；輔助加熱氣溫度：550 ℃；定性離子對、定量離子、去簇電壓DP、碰撞電壓CE、出口電壓CXP和離子化模式見表1。

表1 灰氈毛忍冬皂苷乙的主要質譜參數

2.4 HPLC-ELSD法對照品溶液的制備 精密稱取灰氈毛忍冬皂苷乙22.07 mg至25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備溶液。

2.5 HPLC-ELSD法標準曲線的制備 分別精密量取上述標準儲備溶液1 mL、1 mL、1 mL、2 mL、2 mL至100 mL、50 mL、25 mL、10 mL及5 mL量瓶中，各加甲醇稀釋至刻度。以峰面積對數值為橫坐標，對照品濃度對數值為縱坐標，繪制標準曲線。

2.6 LC-MS/MS法對照品溶液的制備 精密稱取灰氈毛忍冬皂苷乙20.01 mg至25 mL量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為標準儲備溶液。

2.7 LC-MS/MS法標準曲線的制備 分別精密量取上述標準儲備溶液1 mL、1 mL、1 mL、1 mL、5 mL至100 mL、50 mL、25 mL、10 mL及10 mL量瓶中，各加甲醇稀釋至刻度。以峰面積為縱坐標，對照品濃度為橫坐標，繪制標準曲線。

2.8 供試品溶液的制備 取本品粉末2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用50%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.9 陽性供試品的制備 按照小兒咳喘靈顆粒生產工藝，分別摻入100%山銀花、50%山銀花、40%山銀花、30%山銀花、10%山銀花、5%山銀花及3%山銀花，制成模擬小兒咳喘靈顆粒陽性樣品，作為陽性樣品1～陽性樣品7，按照“2.8”項下方法制備成陽性供試品溶液。

2.10 專屬性實驗 精密吸取對照品、供試品及陰性樣品溶液各 10 μL，注入液相色譜儀測定，記錄色譜圖，結果陰性樣品無干擾，該方法專屬性強(如圖1所示)。

2.11 線性關系考察 HPLC-ELSD法以灰氈毛忍冬皂苷乙對照品峰面積對數值為橫坐標，對照品濃度對數值為縱坐標，繪制標準曲線。線性方程：y=0.8489x-0.6514，r2=0.99；LC-MS/MS法以灰氈毛忍冬皂苷乙對照品濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。線性方程：y=1659.21347x+ 16424.09941，r=0.99897，表明建立的 HPLC-ELSD法和LC-MS/MS法的線性良好。

圖1 小兒咳喘靈顆粒中山銀花檢查高效液相色譜圖

2.12 儀器精密度試驗 將濃度為32.7342 μg/ mL對照品溶液，注入液相色譜儀，聯(lián)系測定6次，記錄峰面積，灰氈毛忍冬皂苷乙峰面積的RSD分別為1.41%和1.05%，表明高效液相色譜儀及液相色譜-質譜聯(lián)用儀的精密度良好。

2.13 方法精密度試驗 取同一樣品按照“2.8”項下方法制備8份供試品，進行測定，HPLC-ELSD法測得灰氈毛忍冬皂苷乙的平均含量為13.5033 mg/g，LC-MS/MS法測得灰氈毛忍冬皂苷乙的平均含量為13.3190 mg/g，8份供試品溶液含量的RSD分別為2.2%和1.9%，表明本方法的精密度良好。

2.14 穩(wěn)定性試驗 取同一份樣品供試品溶液，在室溫下，分別在0 h、6 h、12 h、24 h、48 h進樣，計算灰氈毛忍冬皂苷乙峰面積的RSD，HPLC-ELSD法和LC-MS/MS法分別為3.4%和4.0%，表明供試品溶液在48 h內穩(wěn)定。

2.15 加樣回收試驗 按照“2.8”項下方法分別稱取3份樣品約2 g(樣品7)，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按照表2精密加入灰氈毛忍冬皂苷乙對照品，進行測定，計算灰氈毛忍冬皂苷乙的平均回收率分別為100.9%及102.9%，表明方法的準確度良好。

2.16 樣品測定 取7批模擬陽性樣品及10批市購小兒咳喘靈顆粒樣品進行測定，以標準曲線計算含量。結果見表3。

表2 灰氈毛忍冬皂苷乙加樣回收試驗結果

表3 樣品測定結果

2.17 LC-MS/MS法驗證陽性樣品 精密吸取2.1項下的對照品、供試品及陽性樣品溶液各5 μL，注入液相色譜-質譜聯(lián)用儀測定，進行液質聯(lián)用分析，記錄質譜圖，試驗結果表明HPLC-ELSD法檢出灰氈毛忍冬皂苷乙的樣品，經高效液相色譜-質譜聯(lián)用方法驗證，均為灰氈毛忍冬皂苷乙陽性檢出，而HPLC-ELSD法未檢出灰氈毛忍冬皂苷乙的樣品，高效液相色譜-質譜聯(lián)用方法亦未檢出。結果如圖2所示。

圖2 小兒咳喘靈顆粒中山銀花檢查質譜圖

灰氈毛忍冬皂苷乙的3個定性離子對的相對豐度分別為7%、4%、6%；陽性樣品3個定性離子的相對豐度分別為7%、4%、5%，表明陽性樣品特征質譜碎片離子相對豐度與相應的對照品的特征質譜碎片離子相對豐度比較，處于特征質譜碎片離子相對豐度的最大允許限度范圍內，因此可判定該樣品為陽性樣品。

2.18 定量限測定 根據《中國藥典》2020年版四部0212 藥材和飲片檢定通則規(guī)定，中藥材及中藥飲片的藥屑及雜質通常不得過3%。按照小兒咳喘靈顆粒制備工藝制備出摻入3%山銀花的陽性樣品，HPLC-ELSD法檢測出灰氈毛忍冬皂苷乙的含量為0.23 mg/g，信噪比為10；根據LC-MS/MS法檢測出3%山銀花的陽性樣品灰氈毛忍冬皂苷乙的含量為0.20 mg/g，通過色譜計算定量離子及定性離子的信噪比分別為420.0、38.0、21.0、25.0，大于10，滿足儀器定量限要求，故將此方法的定量限設置為0.20 mg/g。

3 結果與討論

3.1 目標成分的選擇 根據文獻記載，灰氈毛忍冬皂苷乙及川續(xù)斷皂苷乙是區(qū)分山銀花及金銀花的專屬性化學成分[4-6]。經前期研究發(fā)現(xiàn)，按照小兒咳喘靈顆粒生產工藝制備的含山銀花陽性樣品，經前處理提取后無法在HPLC-ELSD法中得到較好的呈現(xiàn)。此外，現(xiàn)行藥典中含山銀花類制劑的山銀花檢查均選用灰氈毛忍冬皂苷乙為特征性成分[7-10]，故本研究選擇山銀花的主要特征成分灰氈毛忍冬皂苷乙作為目標成分進行測定。

3.2 樣品提取條件的選擇 本研究考察了小兒咳喘靈顆粒的不同提取方式(超聲法、回流法、浸提法)，比較了不同提取溶劑(甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、50%乙醇、正丁醇)的提取效果，發(fā)現(xiàn)50%甲醇為提取溶劑的超聲提取方法簡單，成分含量最高、提取效果最好，并對超聲提取時間(15 min、30 min、45 min、60 min)進行了比較，超聲提取30 min、45 min、60 min時，灰氈毛忍冬皂苷乙的的含量差距較小，故選擇超聲提取30 min。

3.3 色譜條件的優(yōu)化 灰氈毛忍冬皂苷乙無明顯紫外吸收，故采用蒸發(fā)光散射檢測器進行測定。在HPLC-ELSD法中考察過乙腈-水的等度洗脫，發(fā)現(xiàn)目標峰與雜質峰的分離效果不好，故采用梯度洗脫方式；同時考察乙腈-0.1%磷酸為流動相，發(fā)現(xiàn)色譜峰與乙腈-水為流動相洗脫時相比較差異不明顯，故選擇乙腈-水為流動相。

LC-MS/MS法中乙腈-0.1%甲酸為流動相的等度洗脫就能達到很好的分離效果，故采用等度洗脫方式。當采用乙腈-水為流動相洗脫時，色譜峰的峰型不如乙腈-0.1%甲酸為流動相的峰型，故采用乙腈-0.1%甲酸為流動相。

3.4 樣品含量測定結果分析 10家生產企業(yè)的10批小兒咳喘靈粒中，有1批少量檢出灰氈毛忍冬皂苷乙，但未超過本研究擬定的定量限?？赡茉撈髽I(yè)采購的金銀花混有少量山銀花，存在潛在風險。

綜上，本研究建立的HPLC-ELSD法可準確檢出小兒咳喘靈顆粒中含有的灰氈毛忍冬皂苷乙，并與LC-MS/MS法的驗證結果一致。本方法專屬性強，結果準確可靠，重現(xiàn)性好，可以有效控制小兒咳喘靈顆粒中金銀花投料的情況。采用偽品投料的情況有可能影響產品的有效性和安全性，建議增加小兒咳喘靈顆粒補充檢驗方法，增加山銀花檢查項目，以杜絕部分廠家以山銀花投料的違規(guī)行為，為藥品監(jiān)管提供技術支撐。