不同栽培料配方對(duì)野生桑黃子實(shí)體生長(zhǎng)特性的影響*

杜成志，趙 岑，呂 軍，王曉軍，吳倩倩，武恩斯，李巖杰，張?zhí)m迎

（聊城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東 聊城 252000）

桑黃（商品名） 一般包括銹革孔菌科（Hymenochaetaceae） 桑黃孔菌屬（Sanghuangporus） 真菌。近年，隨著粗毛纖孔菌（Inonotus hispidus） 等藥用菌藥理作用的深入研究，逐步將粗毛纖孔菌列為桑黃的1 個(gè)種[1]。粗毛纖孔菌原隸屬于擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes） 銹革孔菌目（Hymenochaetales） 銹革孔菌科纖孔菌屬（Inonotus）[2]。其子實(shí)體一年生，單生或疊生，無(wú)菌柄，蓋形；鮮品無(wú)嗅無(wú)味，革質(zhì)至軟木栓質(zhì)，干后木栓質(zhì)[3]。粗毛纖孔菌子實(shí)體是我國(guó)傳統(tǒng)中藥材桑黃的重要來(lái)源，在東北地區(qū)主要用于治療消化不良等胃病[4-5]?，F(xiàn)有研究表明，桑黃所含的多糖、三萜類、酚類、黃酮類等生物活性物質(zhì)有明顯的藥理作用和臨床功效，主要用于治療各種癌癥、糖尿病、痛風(fēng)、關(guān)節(jié)炎等[6-7]。

聊城市臨清市黃河故道古桑園中擁有豐富的野生桑黃資源[8]。課題組經(jīng)野外采集、馴化，篩選出較適宜人工栽培的桑黃菌株，并通過(guò)篩選得到最佳菌株和最佳配方，試驗(yàn)結(jié)果可為實(shí)際生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試桑黃菌株L1 和L2，為聊城市農(nóng)業(yè)科學(xué)院野外采集種，經(jīng)鑒定為粗毛纖孔菌Inonotus hispidus。

1.2 主要試劑

無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品（純度99.4%），壇墨質(zhì)檢科技股份有限公司；蒽酮（AR），上海麥克林生化科技股份有限公司；硫酸（AR）、無(wú)水乙醇（AR）、乙酸乙酯（AR）、香草醛（AR）、高氯酸（AR）、冰醋酸（AR），上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司；齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品（純度98%），北京索萊寶科技有限公司；甲醇（AR），西隴科學(xué)股份有限公司。

1.3 主要儀器

JY1003 電子天平，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司；DHG-9075A 鼓風(fēng)干燥箱，上海恒一科學(xué)儀器有限公司；TU-1901 紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；HH-S6 恒溫水浴鍋，常州國(guó)宇儀器制造有限公司；ZNHW-150 智能調(diào)溫電加熱套，河南鞏義高科儀器有限公司；KH30R-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；SY-360 超聲波清洗儀，上海寧商超聲儀器有限公司。

1.4 培養(yǎng)基配方

1.4.1 分離活化培養(yǎng)基配方

分離活化培養(yǎng)采用加富型PDA 培養(yǎng)基，含馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂20 g、 KH2PO23 g、MgSO41.5 g、麩皮10 g，水1 000 mL。

1.4.2 原種培養(yǎng)基配方

原種培養(yǎng)基配方為柞木屑72%、麩皮13%、玉米粉12%、紅糖1%、石膏1%、石灰1%。

1.4.3 栽培料配方

分別采用了2 個(gè)栽培料配方。配方C1 為桑木屑77%、麩皮10%、玉米粉10%、紅糖2%、石膏1%；配方C2 為桑木屑58%、棉籽殼20%、麩皮12%、玉米粉4%、豆粕3%、紅糖1%、石灰1%、石膏1%。

1.5 試驗(yàn)方法

1.5.1 菌種活化

將保藏菌種接種于加富型PDA 培養(yǎng)基上活化，經(jīng)二次轉(zhuǎn)接后備用。

1.5.2 原種制備

按照原種配方備料，主料于泡料桶中浸泡12～24 h 后，瀝水，與輔料一起混勻，靜置5～10 h 后再次翻料，培養(yǎng)料含水量為63%左右。將培養(yǎng)料裝入14 cm×27 cm×0.05 mm 的聚丙烯袋中進(jìn)行高壓滅菌。待菌袋冷卻后分別接入試驗(yàn)?zāi)阜N，放入發(fā)菌室內(nèi)進(jìn)行發(fā)菌培養(yǎng)。保持發(fā)菌室溫度為24 ℃，避光培養(yǎng)45 d，待菌絲滿袋后使用。

1.5.3 栽培種制備

將C1 和C2 兩種配方所需原料分別按比例混勻，預(yù)處理方法同1.5.2 所述?？刂圃耘嗔虾繛?3%左右，用18 cm×35 cm×0.05 mm 的聚丙烯袋裝袋，每袋濕質(zhì)量為1.3 kg。將菌袋進(jìn)行高壓滅菌，待冷卻后分別接入試驗(yàn)菌種，放入發(fā)菌室內(nèi)進(jìn)行發(fā)菌培養(yǎng)。保持發(fā)菌室溫度為24 ℃，避光培養(yǎng)55～60 d，待菌絲滿袋再后熟培養(yǎng)25 d 后使用。

1.5.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)共設(shè)計(jì)4 個(gè)處理，即L1C1、L1C2、L2C1、L2C2，每個(gè)處理3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)做7 袋，每個(gè)處理共21 袋。

1.5.5 出菇管理和采收

將菌包按隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)擺放在出菇棚內(nèi)地面上，保持棚內(nèi)溫度為23～28 ℃，避免陽(yáng)光直射，打開(kāi)風(fēng)口適當(dāng)通風(fēng)，在地面水溝適當(dāng)進(jìn)行灌水，保持空氣濕度為90%～95%。記錄原基形成時(shí)間；出菇后，觀察并記錄子實(shí)體生長(zhǎng)情況。待子實(shí)體開(kāi)始噴粉即為成熟，此時(shí)可以采收。試驗(yàn)共采收2 潮子實(shí)體并統(tǒng)計(jì)產(chǎn)量、生物學(xué)效率等。

1.6 桑黃有效成分檢測(cè)

1.6.1 粗多糖的檢測(cè)

1） 提取粗多糖。稱取桑黃樣品粉末2 g，置于圓底燒瓶中，加水60 mL，靜置1 h；加熱回流4 h，趁熱過(guò)濾；用少量熱水洗滌過(guò)濾器和濾渣；濾渣重復(fù)以上操作，合并濾液后水浴蒸干。蒸干后所得固體物質(zhì)先用5 mL 水溶解，之后邊攪拌邊滴加乙醇至75 mL，搖勻，在4 ℃條件下靜置12 h，離心后去上清液；沉淀用熱水溶解，隨后轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中；冷卻后加水定容，搖勻。取上述溶液適量，離心，精密量取3 mL 上清液于25 mL 容量瓶中加水定容，搖勻即得桑黃樣品粗多糖提取液。

2） 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取無(wú)水葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品，加水配制質(zhì)量濃度為0.12 mg·mL-1的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精確量取上述葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.2、0.6、1.2、1.6、2.0 mL，分別置于10 mL 具塞試管中，加水至2.0 mL。迅速加入6 mL 硫酸蒽酮溶液，搖勻，靜置15 min，冰浴15 min 后取出。用紫外可見(jiàn)分光光度法，在625 nm 波長(zhǎng)處分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3） 測(cè)定粗多糖含量。精確量取上述1） 中得到的樣品粗多糖提取液2.0 mL，置于10 mL 具塞試管中，按照繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，在625 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品溶液吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出粗多糖含量。

1.6.2 三萜的檢測(cè)

1） 提取三萜。取桑黃樣品粉末2 g，置于具塞錐形瓶中，加甲醇50 mL，超聲處理（功率140 W，頻率42 kHz） 45 min；冷卻后過(guò)濾至100 mL 容量瓶中；用適量甲醇分次洗滌過(guò)濾器和濾渣；濾液并入上述容量瓶中，加甲醇定容，搖勻即得桑黃樣品三萜提取液。

2） 繪制齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。精密稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品，加甲醇配制質(zhì)量濃度為0.2 mg·mL-1的齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。精確量取上述齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，分別置于15 mL具塞試管中；揮發(fā)干，置冷；精確加入新配制的香草醛冰醋酸溶液（精密稱取香草醛0.5 g，加入冰醋酸使其溶解，定容至10 mL 即得） 0.2 mL、高氯酸0.8 mL，搖勻；70 ℃水浴加熱15 min，冰浴5 min后取出。精確加入乙酸乙酯4 mL，搖勻。用紫外可見(jiàn)分光光度法，在546 nm 波長(zhǎng)處分別測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品溶液吸光度，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3） 測(cè)定三萜含量。精密量取桑黃樣品三萜提取液0.2 mL，置于15 mL 具塞試管中，按照繪制齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法，在546 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定樣品吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出三萜的含量。

1.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 和SPSS 18 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)與分析，結(jié)果為3 次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理中桑黃子實(shí)體的生長(zhǎng)時(shí)間

不同栽培料配方對(duì)不同野生桑黃子實(shí)體生長(zhǎng)時(shí)間的影響情況詳見(jiàn)表1。

表1 不同處理中桑黃子實(shí)體的生長(zhǎng)時(shí)間Tab.1 Fruit body growth time of Phellinus igniarius in different treatments

由表1 可以看出，4 個(gè)處理中原基形成時(shí)間相差不大，但是同一配方條件下，菌株L1 較菌株L2現(xiàn)原基時(shí)間和子實(shí)體成熟時(shí)間短，說(shuō)明菌株L1 結(jié)實(shí)能力較菌株L2 強(qiáng)。對(duì)于同一菌株來(lái)說(shuō)，配方C2 較配方C1 中桑黃子實(shí)體現(xiàn)原基時(shí)間和子實(shí)體成熟時(shí)間都短，說(shuō)明配方C2 較配方C1 更適宜桑黃生長(zhǎng)。吳亞召等[9]在研究中發(fā)現(xiàn)，在桑木屑中加入一定量的棉籽殼，對(duì)促進(jìn)桑黃菌絲生長(zhǎng)及提高子實(shí)體產(chǎn)量有一定的促進(jìn)作用。本試驗(yàn)結(jié)果與其結(jié)論一致，可能是因?yàn)槊拮褮ぞ哂休^好的保水性，在出菇過(guò)程中能減少菌包內(nèi)的水分流失，并均衡栽培袋內(nèi)的營(yíng)養(yǎng)，從而延長(zhǎng)子實(shí)體生長(zhǎng)時(shí)間。

2.2 不同處理中桑黃的生長(zhǎng)特性

不同栽培料配方對(duì)不同野生桑黃生長(zhǎng)特性的影響情況詳見(jiàn)表2。

表2 不同處理中野生桑黃的生長(zhǎng)特性Tab.2 Growth characteristics of wild Phellinus igniarius in different treatments

由表2 可知，不同栽培料配方對(duì)桑黃子實(shí)體的生長(zhǎng)特性及子實(shí)體形態(tài)有一定的影響。L1C2 處理中桑黃子實(shí)體各項(xiàng)指標(biāo)表現(xiàn)最優(yōu)，每袋平均產(chǎn)量達(dá)25.2 g（干質(zhì)量），且子實(shí)體形狀較好；平均生物學(xué)效率達(dá)30%；一潮菇出菇率最高，為100%。對(duì)同一菌株而言，配方C2 較配方C1 對(duì)桑黃子實(shí)體生長(zhǎng)更有利；而在同一配方條件下，菌株L1 在一潮菇出菇率方面占有明顯的優(yōu)勢(shì)。子實(shí)體形態(tài)特征見(jiàn)圖1。

圖1 不同處理中桑黃子實(shí)體的形態(tài)Fig.1 Fruit body morphology of Phellinus igniarius in different treatments

2.3 不同處理中桑黃有效成分的含量

不同栽培料配方對(duì)不同野生桑黃有效成分含量的影響情況詳見(jiàn)表3。

表3 不同處理中野生桑黃有效成分的含量Tab.3 Content of active ingredients in wild Phellinus igniarius in different treatments

從表3 可以看出，L1C2 處理子實(shí)體中粗多糖含量最高，達(dá)2.05%；L1C1 處理桑黃子實(shí)體中粗多糖含量最低，為0.79%。L1C1 處理桑黃子實(shí)體中三萜含量最高，為2.71%；L2C1 處理桑黃子實(shí)體中三萜含量最低，為1.92%。比較2 個(gè)菌株子實(shí)體中三萜和粗多糖的含量，發(fā)現(xiàn)菌株L1 的三萜含量相對(duì)較高而粗多糖含量相對(duì)較低，L2 的粗多糖含量相對(duì)較高而三萜含量相對(duì)較低。說(shuō)明菌株L2 和L1 在子實(shí)體形成過(guò)程中，代謝通路相差較大。比較2 個(gè)配方栽培的子實(shí)體，發(fā)現(xiàn)三萜含量差異不大，配方C2 栽培的子實(shí)體中粗多糖含量相對(duì)較高。說(shuō)明配方C2 更有利于桑黃次級(jí)代謝產(chǎn)物的形成。

3 結(jié)論和討論

通過(guò)試驗(yàn)篩選出最佳桑黃菌株為L(zhǎng)1，該菌株的優(yōu)勢(shì)主要表現(xiàn)在出菇率高，子實(shí)體中三萜含量高；最佳配方為C2（桑木屑58%、棉籽殼20%、麩皮12%、玉米粉4%、豆粕3%、紅糖1%、石灰1%、石膏1%），該配方條件下桑黃出菇率高、子實(shí)體中粗多糖含量高。L1C2 處理為本次試驗(yàn)的最佳處理，桑黃原基形成時(shí)間為6 d，子實(shí)體成熟時(shí)間為46 d，生長(zhǎng)周期最短；每袋平均產(chǎn)量為25.2 g（干質(zhì)量）；生物學(xué)效率為30%；子實(shí)體中三萜含量為2.24%，粗多糖含量為2.05%；一潮菇出菇率達(dá)100%，二潮菇出菇率也最高，為66.7%，其他處理均未超過(guò)50%。

試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，不同的野生桑黃菌株栽培特性差異較大，表現(xiàn)為部分菌株更適宜人工栽培，能耐受高氮源營(yíng)養(yǎng)配方，子實(shí)體形態(tài)好、產(chǎn)量高，子實(shí)體中有效成分含量也較高；部分菌株則不適宜人工栽培，子實(shí)體形態(tài)差、產(chǎn)量低，子實(shí)體中有效成分含量低。不同的栽培料配方對(duì)桑黃生長(zhǎng)特性具有一定的影響，在桑木屑配方中加入適量的棉籽殼有利于桑黃產(chǎn)量的提高，延長(zhǎng)出菇期。