松乳菇多糖提取工藝研究及降血糖活性評價*

羅麗平，李冰晶，楊 玲，楊彝華，賀紅早

（貴州省生物研究所，貴州 貴陽 550009）

糖尿病是因遺傳、飲食、環(huán)境等因素導致胰島素功能衰減，從而對胰島素敏感降低，影響相關代謝酶的活性而引起，其中α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶是影響人體血糖水平最主要的2 種酶[1]。α-淀粉酶可水解淀粉內(nèi)部的α-1，4-糖苷鍵，并產(chǎn)生糊精、低聚糖和葡萄糖等物質(zhì)，會造成血液中血糖濃度升高[2]。而α-葡萄糖苷酶能催化水解人體攝取的碳水化合物中的α-1，4-糖苷鍵，并釋放葡萄糖，促進小腸對糖的吸收，導致血糖濃度升高[3]。因此，通過測定物質(zhì)對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用，可判斷該物質(zhì)的降血糖作用。

目前，許多天然產(chǎn)物均具有較好的降血糖功效且副作用小，具有開發(fā)成現(xiàn)有降血糖藥物替代品的潛質(zhì)[4]。比如，楊成峻等[5]發(fā)現(xiàn)花椒（Zanthoxylum bungeanum） 果皮中多酚類物質(zhì)對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用顯著，具有較好降血糖作用。常國立等[6]通過研究楊梅（Myrica rubra） 核多酚對α-葡萄糖苷酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)其具有較強的體外降血糖活性。王安娜等[7]研究了栘依（Docynia delavayi） 黃酮對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制作用，發(fā)現(xiàn)其具有較好的體外降血糖活性。在以食用菌為試驗對象的研究中，林杉等[8]報道了三地羊肚菌（Morchella eohespera） 胞外多糖對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制作用，對羊肚菌胞外多糖的降血糖作用進行了探討。另有研究發(fā)現(xiàn)，銀耳（Tremella fuciformis）多糖可降低高膽固醇血癥小鼠血清膽固醇含量，香菇（Lentinus edodes） 多糖可促進膽固醇代謝而降低其在血清中的含量[9]。冬蟲夏草（Ophiocordyceps sinensis） 可促進細胞分泌胰島素從而降低血糖[10]。

松乳菇（Lactarius Deliciosus） 屬紅菇科（Rus sulaceae） 乳菇屬（Lactarius），肉質(zhì)鮮美，營養(yǎng)豐富，食用價值高[11-13]，并具有增強免疫力、抗腫瘤、抗氧化等作用[14]。項目組前期對松乳菇多糖粗提物進行了生物活性初探，結果發(fā)現(xiàn)松乳菇粗多糖提取物對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的活性抑制效果顯著[15]。因此試驗以松乳菇為研究對象，以提取物中的多糖含量為考察指標，探究不同提取方法和因素對松乳菇提取率的影響，為后續(xù)研究提供理論基礎。

1 材料與設備

1.1 材料與試劑

野生新鮮松乳菇，采購于龍里野生菌市場。α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、4-硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷、葡萄糖，上海源葉生物科技有限公司；可溶性淀粉，成都金山化學試劑有限公司；二硝基水楊酸，國藥集團化學試劑有限公司；PBS 緩沖液、Na2CO3，天津市致遠化學試劑有限公司；無水乙醇，重慶川東化工(集團) 有限公司；試驗用水均為二級水。

1.2 設備與儀器

DZF-6021 真空干燥箱，上海精宏實驗設備有限公司；EYELA N-3000 循轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛朗儀器有限公司；循環(huán)水式真空泵，鄭州長城科工貿(mào)有限公司；DK-98-II 水浴鍋，天津市泰斯特儀器有限公司；ISO9001 型電子天平，北京賽多麗斯儀器系統(tǒng)有限公司；SB25-12DTD 型超聲波清洗機，寧波新芝生物科技股份有限公司；LGJ-18 型真空冷凍干燥機，北京松源華興科技發(fā)展公司；UV755B 型紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司。

2 試驗方法

2.1 樣品制備

新鮮松乳菇用水洗去表面塵土后，置于烘箱中50 ℃烘干，粉碎成粉末。

2.2 葡萄糖標準曲線制作

使用苯酚硫酸法測定提取物中的多糖含量。物質(zhì)多糖在濃硫酸溶于水時產(chǎn)生的瞬間高溫作用下水解產(chǎn)生單糖，并迅速脫水成糠醛衍生物。在強酸條件下與苯酚起顯色反應，生成的橙黃色物質(zhì)在波長490 nm 處有最大吸光值，吸光值與糖濃度呈線性關系[16]。配制質(zhì)量濃度為0.5 mg·mL-1的葡萄糖標準品母液，分別取母液稀釋至質(zhì)量濃度為0.005、0.015、0.025、0.035、0.045 mg·mL-1。分別各取1 mL 溶液并加入6%苯酚1 mL，再緩慢加入5 mL 濃硫酸反應，冷卻后于490 nm 下測定吸光值。以質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，繪制葡萄糖標準曲線并得到回歸方程。

2.3 提取方法對比試驗

考察水提法、酶提法（纖維素酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶）、醇提法（50%乙醇、75%乙醇） 對松乳菇多糖提取率的影響，篩選出較優(yōu)的提取方法。

1） 水提法：稱取適量的原料粉末于燒瓶中，按料液比為1∶8 加入蒸餾水，浸泡2 h，100 ℃回流提取2 次，每次2 h。合并提取液，減壓濃縮后，用85%乙醇對濃縮液進行醇沉處理，4 ℃靜置過夜，去上清，50 ℃減壓濃縮后于真空干燥箱中50 ℃真空干燥得到粗多糖提取物。

2） 酶提法：稱取適量的原料粉末于燒瓶中，按料液比為1∶8 加入蒸餾水，按原料100 g 使用30 mg的酶用量分別加入纖維素酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶。60 ℃水浴提取2 次，每次2 h。之后100 ℃沸水浴10 min 使酶滅活。合并提取液，減壓濃縮后，用85%乙醇對濃縮液進行醇沉處理，4 ℃靜置過夜，去上清，50 ℃減壓濃縮后于真空干燥箱中50 ℃真空干燥得到粗多糖提取物。

3） 醇提法：稱取適量的原料粉末于燒瓶中，按料液比為1 ∶8 分別加入50%乙醇和75%乙醇。浸泡2 h，80 ℃回流提取2 次，每次2 h。合并提取液，減壓濃縮后，用85%乙醇對濃縮液進行醇沉處理，4 ℃靜置過夜，去上清，50 ℃減壓濃縮后于真空干燥箱中50 ℃真空干燥得到粗多糖提取物。

2.4 單因素試驗

基于提取方法比較試驗結果，對最佳提取方法中的條件進行單因素試驗。

2.5 正交試驗

基于單因素試驗選取的因素及結果，設計組合正交試驗，對提取工藝進行優(yōu)化，以確定各因素的影響程度，最終確定最佳工藝條件。

2.6 提取物對α-淀粉酶活性的抑制作用

使用二硝基水楊酸（DNS） 法測定α-淀粉酶活性[17]。作用原理：溶液中的α-淀粉酶將淀粉水解為還原糖，加入3，5-二硝基水楊酸后發(fā)生顏色反應，溶液由無色變?yōu)榧t棕色，此時可在540 nm 處測得最大吸光值，當加入酶抑制劑后，由于酶活性受到抑制，水解生成的還原糖減少，溶液的紅棕色消退。根據(jù)數(shù)據(jù)變化分析提取物對α-淀粉酶的抑制作用[18]。

3 mL PBS 緩沖液（pH 6.8） 中加入0.5%可溶性淀粉溶液1 mL 和DNS 溶液5 mL，作為空白調(diào)零組。在2 mL PBS 緩沖液中加入1% α-淀粉酶溶液2 mL、0.5%淀粉1 mL 和DNS 溶液5 mL，作為對照組，測得吸光值A。取1 mL 待測樣品溶液，加入PBS 緩沖液定容至3 mL，再加入1%的α-淀粉酶溶液1 mL，搖勻。放入37 ℃水浴預熱10 min，加入0.5%淀粉溶液1 mL，在37 ℃恒溫水浴鍋中反應10 min 取出，加入DNS 溶液5 mL，沸水浴5 min 取出，冷卻后于540 nm 下測得試驗組吸光值A1。另取1 mL 與試驗組質(zhì)量濃度相同的被試樣品溶液為本底對照組，加入PBS 緩沖液定容至4 mL，置于37 ℃水浴預熱10 min，加入PBS 緩沖液1 mL，37 ℃水浴10 min，加入PBS 緩沖液5 mL，置于沸水中水浴5 min，冷卻后于540 nm 下測得吸光值A0。每組試驗3 個平行，最終值取3 次的平均值，抑制率（IA，%） 的計算公式為：

式中：A1為試驗組吸光值；A0為本底對照組吸光值；A 為對照組吸光值。

2.7 提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用

使用4 -硝基酚-α-D-吡喃葡萄糖苷（PNPG）比色法測定α-葡萄糖苷酶活性[19]。作用原理：溶液中的PNPG 被α-葡萄糖苷酶水解為葡萄糖和對硝基酚（PNP），在堿性條件下，溶液由無色變成黃色，PNP 在405 nm 處可測得最大吸光值，加入酶抑制劑后水解反應變?nèi)鯇е翽NP 的生成減少，溶液顏色變淡。根據(jù)數(shù)據(jù)變化分析提取物對α-淀粉酶的抑制作用[20]。

5 mL PBS 緩沖液（pH 6.8） 中加入0.1 mmol·L-1PNPG 2 mL 和0.1 mol·L-1Na2CO3溶液2 mL，作為空白調(diào)零組。4 mL PBS 緩沖液中加入20 mg·mL-1α-葡萄糖苷酶1 mL、PNPG 1 mL 和Na2CO3溶液1 mL 作為對照組，在400 nm 處測得吸光值A′。取1 mL 被試樣品溶液，加入緩沖液定容至4 mL，后加入α-葡萄糖苷酶溶液1 mL，搖勻后置于37 ℃水浴鍋中加熱反應10 min，加入PNPG 2 mL，后繼續(xù)于37 ℃水浴10 min，取出并加入Na2CO3溶液2 mL，搖勻后于400 nm 處測得試驗組吸光值A′1。另取相同濃度被試樣品溶液1 mL 加入PBS 緩沖液定容至5 mL，搖勻后于37 ℃水浴鍋中加熱10 min，隨后加入PNPG 2 mL，繼續(xù)在37 ℃水浴中加熱10 min取出，加入Na2CO3溶液2 mL，于405 nm 下測得本底對照組吸光值A′0。每組試驗3 個平行，最終值取3 次的平均值，抑制率（IG，%） 計算公式為：

式中：A′1為試驗組吸光值；A′0為本底對照組吸光值；A′為對照組吸光值。

2.8 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 21 和SPSS 17.0 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行方差和顯著性分析。

3 結果與分析

3.1 葡萄糖標準曲線

繪制的葡萄糖標準曲線見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Glucose standard curve

如圖1 所示，以質(zhì)量濃度（X） 為橫坐標，吸光值（Y） 為縱坐標，繪制標準曲線得到回歸方程Y=8.829X+0.014 4，相關系數(shù)R2為0.999。

3.2 提取方法對比試驗結果

使用水提法、酶提法（纖維素酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶）、醇提法（50%乙醇、75%乙醇） 提取松乳菇多糖，不同提取方法對多糖提取率及酶活性抑制率的影響見圖2。

圖2 不同提取方法對松乳菇提取物中多糖含量與酶活性的影響Fig.2 Effect of different extract methods on polysaccharide content in Lactarius deliciosus extracts and enzyme activity

由圖2 可知，用纖維素酶酶解得到的提取物中的多糖含量均高于其他提取方法，提取得到的多糖提取物對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制率也均高于其他組，為最佳提取方法。

3.3 單因素試驗結果

針對纖維素酶酶用量、提取時間、提取溫度3個因素進行單因素試驗。酶用量：每100 克樣品的酶用量為10、20、30、40、50 mg；提取時間：1、2、3、4 h；提取溫度：40、60、80、100 ℃。纖維素酶不同酶用量對松乳菇多糖提取率及酶活性抑制率的影響見圖3。

圖3 纖維素酶不同酶用量對松乳菇提取物中多糖含量與酶活性的影響Fig.3 The effect of different enzyme dosages of cellulase on polysaccharide content in Lactarius deliciosus extracts and enzyme activity

由圖3 可知，結果顯示纖維素酶的酶用量為30 mg時，得到的提取物中多糖含量較高，且對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制率也較強。

不同提取時間對松乳菇多糖提取率及酶活性抑制率的影響見圖4。

圖4 不同提取時間對松乳菇提取物中多糖含量與酶活性的影響Fig.4 Effect of different extraction times on polysaccharide content in Lactarius deliciosus extracts and enzyme activity

由圖4 可知，當提取時間為3 h 時，多糖含量較高，提取時間繼續(xù)延長至4 h 時，多糖含量趨于穩(wěn)定，時間繼續(xù)延長多糖含量變化較小。

不同提取溫度對松乳菇多糖提取率及酶活性抑制的影響見圖5。

圖5 不同提取溫度對松乳菇提取物中多糖含量與酶活性的影響Fig.5 Effect of different extraction temperatures on polysaccharide content in Lactarius deliciosus extracts and enzyme activity

由圖5 可知，當提取溫度為80 ℃時多糖的含量較高，提取溫度為100 ℃時，多糖含量開始下降，對α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性的抑制率強弱也隨之變化，原因可能是高溫影響物質(zhì)結構所致。

3.4 正交試驗結果

根據(jù)單因素試驗結果開展纖維素酶酶提法正交試驗，對酶用量（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）3 因素3 水平組合正交，L9（33） 正交表見表1。

表1 正交試驗的因素與水平Tab.1 Factors and levels of orthogonal experiment

根據(jù)表1 的設計方案進行試驗，結果及方差分析見表2～表5。

表2 松乳菇提取物對α-淀粉酶活性的抑制作用Tab.2 Inhibitory effect of Lactarius deliciosus extracts on α-amylase activity

表3 松乳菇提取物對α-淀粉酶活性抑制作用的方差分析Tab.3 Variance analysis of the inhibitory effect of Lactarius deliciosus extracts on α-amylase activity

表4 松乳菇提取物對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用Tab.4 Inhibitory effect of Lactarius deliciosus extracts on α-glucosidase activity

表5 松乳菇提取物對α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的方差分析Tab.5 Variance analysis of the inhibitory effect of Lactarius deliciosus extracts on α-glucosidase activity

由表2～表5 結果分析可知，影響松乳菇多糖提取率的主次因素為C＞A＞B，提取溫度（C） 的影響作用較大，而提取時間（B） 對其的影響較小。隨著多糖含量的增加，對α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用也隨之增強。綜合分析最終得出松乳菇多糖的最佳提取工藝為A2B1C2，即纖維素酶酶用量為30 mg，提取時間為2.0 h，提取溫度為70 ℃。

4 結論與討論

本試驗中選擇不同提取方法對松乳菇多糖進行提取，通過單因素試驗確定纖維素酶酶提法所得多糖含量最高，并通過正交試驗優(yōu)化提取工藝，最終確定了纖維素酶酶提法影響松乳菇多糖提取的主次因素為C＞A＞B，最佳提取工藝為A2B1C2，即纖維素酶酶用量為30 mg，提取時間為2.0 h，提取溫度為70 ℃。

采用α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的活性為指標，測定各多糖樣品的體外降血糖活性。在最佳條件下提取得到的粗多糖含量可達45.70%，對α-淀粉酶活性抑制和α-葡萄糖苷酶活性抑抑制率可達41.80%和41.56%。試驗結果表明，各樣品均呈現(xiàn)出不同程度的降血糖活性，活性強弱與多糖含量基本呈現(xiàn)正相關。因此可初步得出松乳菇中的主要降血糖物質(zhì)為松乳菇多糖。后續(xù)將進一步探明有效物質(zhì)的作用機制，為松乳菇在食品、藥品等領域的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。