重慶市中心城區(qū)匯集濃縮血小板制備關(guān)鍵控制點確認探討*

周 瓊,楊冬燕,駱展鵬,卿 蕓,賀冬梅,林 蘭,曾北南

(重慶市血液中心血液制備科,重慶 400052)

隨著臨床醫(yī)療技術(shù)的發(fā)展,血小板使用量快速上升,目前臨床上以使用單采血小板為主,但單采血小板存在血源招募相對困難,獻血者獻血時間較長等因素限制,不能完全滿足臨床上的需求;全血資源比單采血小板來源機會多。因此,匯集濃縮血小板作為單采血小板的有效補充,逐步在全國部分血站開展制備。同時,由于匯集濃縮血小板的制備過程較復(fù)雜,影響因素較多,因此對其制備過程中的關(guān)鍵控制點的確認顯得尤為重要。本文采用匯集白膜層(BC)的方法制備匯集濃縮血小板,并對其關(guān)鍵控制點進行確認,為建立匯集濃縮血小板的制備標(biāo)準(zhǔn),提供實踐基礎(chǔ)[1-4]。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1血液來源 在本中心街頭采集的符合國家《獻血者健康檢查標(biāo)準(zhǔn)》的無償獻血者全血中,抽取規(guī)格為每袋400 mL,共84袋,并按ABO血型分類,于室溫放置。常規(guī)采集去白細胞單采血小板14袋,(22±2)℃振搖保存,備用。

1.1.2研究對象分組 匯集濃縮去白血小板設(shè)為實驗組;去白細胞單采血小板設(shè)為對照組。

1.1.3儀器與試劑 全自動血細胞分析儀X-500i(日本sysmex),大容量冰凍離心機cryofuge 8(美國Thermo),全自動全血成分血離心機 compomat G4(德國 Fresenius Kabi),無菌導(dǎo)管接駁機TSCD-Ⅱ(日本 Terumo),貯血冰柜(日本 Sanyo),血小板恒溫保存箱PC4200h(美國Helmer),Coulter計數(shù)儀(美國beckman coulter),四聯(lián)采血袋(山東威高),PFS-PL300型白細胞過濾器(南京雙威),血小板貯存袋(美國 Haemonetics),7230型分光光度計(上海分析儀器廠),血氣儀(德國西門子RP500),流式細胞儀(美國 BD accuri C6 plus),全自動微生物偵測系統(tǒng) BACT-3D(美國BioMérieux)。

1.2方法

1.2.1采用BC方法制備 匯集濃縮血小板采集6 h內(nèi)的新鮮全血用BC方法分離制備BC,并根據(jù)本地區(qū)獻血者血小板濃度及血小板回收率[5]初步確定BC匯集袋數(shù)。

1.2.2制備過程四聯(lián)袋 采集的新鮮全血400 mL,常溫保存,4～6 h內(nèi)重離心(第1次離心),將離心后的全血轉(zhuǎn)入血細胞分離機(G4),按設(shè)定程序分離出含血漿、白膜、紅細胞的BC共約85 mL,BC在(22±2)℃條件下靜置。次日將6袋經(jīng)檢驗合格的同血型的BC通過無菌導(dǎo)管接駁機匯集,輕輕混合均勻后離心(第2次離心)。分離制備出匯集濃縮血小板,如果產(chǎn)品中紅細胞殘留量較多,則需再次輕離心(第3次離心),減除紅細胞,將最終分離的產(chǎn)品經(jīng)濾白處理后,直接轉(zhuǎn)入血小板專用保存袋震蕩保存。

1.2.3第1次全血重離心參數(shù) 離心力2 283 g,加速9 g,減速4 g,時間10 min(分離BC)前提下[6];確定第2次離心參數(shù)為:離心力291 g,加速9 g,減速4 g,時間12 min(分離血小板);第3次離心參數(shù)為離心力145 g,加速9 g,減速4 g,時間5 min(去除殘留紅細胞),觀察并評價離心效果。

1.2.4研究對象理化指標(biāo)檢測 實驗室檢測容量、血小板含量及血小板回收率、白細胞殘留量、紅細胞混入量、儲存期末pH和無菌實驗。

2 結(jié) 果

2.1離心參數(shù) 第1次全血重離心參數(shù)、第2次BC輕離心參數(shù)、第3次減除殘留紅細胞時的離心參數(shù)。見表1。

表1 離心參數(shù)

2.2匯集濃縮血小板 匯集袋數(shù)用四聯(lián)袋采集的新鮮全血400 mL,預(yù)估回收后的血小板含量,確定以6袋匯集制備為1個匯集濃縮血小板。匯集濃縮血小板的容量、血小板含量,紅細胞混入量高于機采血小板組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);兩組白細胞計數(shù)和儲存期末pH值比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 匯集濃縮血小板匯集袋數(shù)

2.3匯集濃縮血小板和機采去白血小板質(zhì)量指標(biāo) 見表3。

表3 保存期內(nèi)匯集濃縮去白血小板與機采血小板質(zhì)量指標(biāo)比較

3 討 論

制備方法的成敗取決于關(guān)鍵控制點的把控,匯集濃縮血小板制備的關(guān)鍵控制點主要包括制備方法的選用、匯集袋數(shù),幾次離心的參數(shù)及效果的選擇、其他質(zhì)量指標(biāo)評價。

3.1方法選用 選擇適宜、較為成熟的技術(shù)。匯集濃縮血小板制備方法主要有富漿法和白膜法,其中白膜法制備濃縮血小板,在重慶市中心城區(qū)運用多年,較為成熟[5-6],故選用白膜法。有研究報道,采用室溫過夜匯集BC法制備的血小板含量較即時匯集BC法制備的血小板含量高[2],因此采用靜置過夜法來制備匯集濃縮血小板。

3.2匯集袋數(shù) 根據(jù)重慶市中心城區(qū)獻血人群全血血小板含量和BC回收率來預(yù)測匯集濃縮血小板的血小板計數(shù),“五混一”方式中血小板計數(shù)有可能處于低限或不足,“七混一”方式造成太高,血液資源浪費,同時增加抗原性,因此確定采用6袋匯集成一份方式匯集濃縮血小板。

3.3離心參數(shù) 選擇不同離心機型號,即便是同一型號、新購進的和使用多年的機器,且維護狀況、參數(shù)一致,離心效果也不一定相同,需要自己摸索最優(yōu)離心參數(shù)[7]。根據(jù)離心效果來確定離心參數(shù)。第1次離心參數(shù):離心力2 283 g,加速9 g,減速4 g,時間10 min是制備濃縮血小板一直沿用的,且離心效果良好,繼續(xù)使用。在選擇第2次匯集BC離心參數(shù)時,通過對比①(離心力291 g,加速9 g,減速4 g,時間10 min)和②(離心力291 g,加速9 g,減速4 g,時間12 min)時,②離心效果較佳。匯集濃縮血小板中紅細胞殘留量較多時,則需再次輕離心(第3次離心)減少紅細胞殘留量,對比離心力291 g,加速9 g,減速4 g,時間5 min;離心力145 g,加速9 g,減速4 g,時間5 min ;離心參數(shù)紅細胞去除效果雖然較好,但有較為明顯的血小板聚集現(xiàn)象;則在紅細胞去除和不引發(fā)血小板聚集綜合離心效果上更佳。

3.4其他質(zhì)量指標(biāo)評價 從實驗中可以看出,匯集濃縮血小板的容量、血小板含量,紅細胞混入量高于機采血小板組;白細胞計數(shù)和儲存期末pH值在兩組間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。(1)容量:匯集濃縮血小板容量明顯高于機采血小板,也超過了國家標(biāo)準(zhǔn),在實驗之初,為保證血小板回收率,對之前沿用的機器制備濃縮血小板分離程序未進行修改(2 U容量50～76 mL),導(dǎo)致容量超標(biāo),這將作為下一步首要解決問題。(2)血小板含量:明顯高于機采血小板組,即使排除容量超標(biāo)因素,按比例遞減,匯集濃縮血小板的含量也高于機采血小板組。(3)紅細胞混入量:濃縮血小板組高于機采血小板組,但均在國標(biāo)規(guī)定范圍內(nèi)。(4)白細胞計數(shù):與機采血小板組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。匯集濃縮血小板使用專用血小板白細胞過濾器,特點白細胞清除率高,殘留少,有效成分回收率也高。對匯集濃縮血小板進行濾除白細胞處理,可以減少各種輸血不良反應(yīng)的發(fā)生,同時利用血小板白細胞過濾器進行濾白處理,方便又快捷[8]。(5)儲存期末pH值和無菌實驗,兩組均無顯著差異,符合國標(biāo)規(guī)定范圍。

總之,在開展新項目和新技術(shù)時,確認工作非常重要,隨著技術(shù)的更新?lián)Q代,方法確認是開展質(zhì)量監(jiān)測和工作的前提條件和基本要求[9]。因此,對開展新項目和新技術(shù)進行方法查新,借鑒數(shù)據(jù),結(jié)合自身條件、設(shè)備,注意關(guān)鍵控制點和關(guān)鍵環(huán)節(jié),方法確認著重于方法能不能用,確認結(jié)果合格后,還需嚴(yán)密監(jiān)測,對影響結(jié)果的因素進行系統(tǒng)性評價。