芥子咳喘貼早期安全性評(píng)價(jià)實(shí)驗(yàn)研究

王道涵 袁曉雯 喬艷雪 趙榮華 王素梅 馬雅鑾

(1 北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院兒科,北京,100078; 2 中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所,北京,100700; 3 中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所,北京,100700)

小兒支氣管炎是常見的小兒下呼吸道疾病之一,可由病毒和(或)細(xì)菌感染,過敏原刺激以及各種理化因素導(dǎo)致支氣管黏膜損傷而出現(xiàn)的急慢性炎癥。本病預(yù)后輕重差別大,小年齡患兒在某些病原體感染后臨床表現(xiàn)較重,預(yù)后較差[1-2]。本病西醫(yī)治療以對(duì)癥處理為主,多依靠口服或靜脈給藥,由于患兒依從性較差,且部分藥物存在一定不良反應(yīng),癥狀短期內(nèi)難以得到理想控制。中醫(yī)將本病歸屬“咳嗽”范疇，歷代醫(yī)家非常重視外治法的應(yīng)用，其中，中藥貼敷技術(shù)歷史傳承悠久，其通過精準(zhǔn)取穴、經(jīng)皮給藥，避免了藥物在體內(nèi)的首過效應(yīng)，具有維持有效藥物濃度時(shí)間長(zhǎng)，不良反應(yīng)小的優(yōu)點(diǎn)[3-4]。國家級(jí)名老中醫(yī)、著名中醫(yī)兒科專家王素梅教授經(jīng)古方優(yōu)化及工藝改進(jìn)，創(chuàng)制而成的芥子咳喘貼是一種治療小兒支氣管炎的有效外用貼劑。為評(píng)價(jià)該貼劑的安全性，本實(shí)驗(yàn)擬對(duì)其進(jìn)行皮膚急性毒性、皮膚刺激性及皮膚過敏相關(guān)試驗(yàn)研究，為臨床試驗(yàn)提供可靠依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 健康日本大耳白兔20只,體質(zhì)量2 500～3 000 g;健康Hartley豚鼠30只,體質(zhì)量250～300 g,受試動(dòng)物均為清潔級(jí),雌雄各半,購自北京昌揚(yáng)西山養(yǎng)殖場(chǎng),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(京)2011-0010。飼養(yǎng)于中國中醫(yī)科學(xué)院中醫(yī)基礎(chǔ)理論研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào):SCXK(京)2010-0032。動(dòng)物飼養(yǎng)室條件:溫度22～25 ℃,濕度40%～60%,通風(fēng)良好。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)與實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào):202022)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑 芥子咳喘貼,組方:白芥子、延胡索、細(xì)辛、干姜、冰片、紫草、甘草,購自北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院中藥房,經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院譚鵬副教授負(fù)責(zé)鑒定;賦形劑,由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供。

1.1.3 試劑與儀器 2,4-二硝基氯代苯丙酮液(上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司,批號(hào):47HAM-HM);總膽固醇(Total Cholesterol,TC)試劑盒(批號(hào):CH0101152),三酰甘油(Triglyceride,TG)試劑盒(批號(hào):CH0101151),高密度脂蛋白(High Density Lipoprotein,HDL)試劑盒(批號(hào):CH0101161),低密度脂蛋白(Low Density Lipoprotein,LDL)試劑盒(批號(hào):CH0101162),谷丙轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-pyruvic Transaminase,GPT)試劑盒(批號(hào):CH0101201),谷草轉(zhuǎn)氨酶(Glutamic-oxaloacetic Transaminase,GOT)試劑盒(批號(hào):CH0101202),以上試劑盒均購自四川邁克生物科技公司。尿素氮(Blood Urea Nitrogen,BUN)試劑盒(批號(hào):HY-N0015),肌酐(Creatinine,CRE)試劑盒(批號(hào):HY-N0017),以上試劑盒購自北京華英生物技術(shù)研究所;尿酸(Uric Acid,UA)試劑盒(批號(hào):C01221),購自南京建成生物工程研究所;蘇木精-伊紅(Hematoxylin and Eosin,HE)染色試劑(批號(hào):G1120),購自北京索萊寶有限公司;全自動(dòng)生化分析儀(Beckman Coulter公司,美國,型號(hào):CX4);型電子分析天平(METTLER TOLEDO公司,瑞士,型號(hào):LE204E);手提式高壓滅菌鍋(上海比朗儀器有限公司,型號(hào):YXQ-SG46-280);寵物電推剪(深圳市科德士電子廠,型號(hào):CP-9600)。

1.2 方法

1.2.1 皮膚用藥急性毒性試驗(yàn) 選擇日本大耳白兔12只,雌雄各半,試驗(yàn)前24 h將日本大耳白兔臀背部沿脊柱兩側(cè)脫毛,每側(cè)脫毛面積約15 cm×10 cm,脫毛后檢查有無皮膚劃傷并剔除劃傷者。給藥當(dāng)日隨機(jī)分為3組并施藥物,每組4只?？瞻讓?duì)照組(賦形劑2 g/只)、芥子咳喘貼常規(guī)劑量組(2 g/只)、芥子咳喘貼高劑量組(8 g/只),藥物均勻涂抹于脫毛區(qū),用油紙、紗布、膠布固定,單籠飼養(yǎng),每日2次,2次用藥間隔6 h,包扎24 h后溫水洗凈,分別于給藥前、給藥后第3天、第7天觀察日本大耳白兔全身中毒表現(xiàn),包括呼吸,四肢活動(dòng),體質(zhì)量,皮膚,毛發(fā),眼睛,黏膜,脊神經(jīng)等變化[5-6]。第8天將所有日本大耳白兔心臟取血,取血前禁食12 h,10%水合氯醛腹腔注射麻醉后開胸暴露心臟,用10 mL注射器經(jīng)左心室抽取血液標(biāo)本5 mL,測(cè)定各組血生化指標(biāo)并比較組間差異[7-8]。

1.2.2 單次給藥完整皮膚刺激試驗(yàn) 選擇日本大耳白兔4只,雌雄各半,脫毛方法參照1.2.1。給藥當(dāng)日每只日本大耳白兔分別沿脊柱左側(cè)脫毛區(qū)涂以低劑量芥子咳喘貼1 g,右側(cè)涂以等量賦形劑作為賦形劑側(cè),包扎24 h后溫水洗凈,并于1、24、48、72 h觀察日本大耳白兔皮膚有無紅斑、水腫現(xiàn)象,以及上述變化的恢復(fù)情況和時(shí)間,并與賦形劑側(cè)進(jìn)行比較。試驗(yàn)結(jié)果按皮膚刺激性反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分,計(jì)算平均分值,進(jìn)行刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)[9-10]。見表1～2。

表1 皮膚刺激性及過敏反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

表2 皮膚刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

1.2.3 多次給藥完整皮膚刺激試驗(yàn) 選擇日本大耳白兔4只,雌雄各半,脫毛及給藥方式參照1.2.2,1次/d,連續(xù)7 d,最后1次給藥24 h后溫水洗凈,并于1、24、48、72 h觀察日本大耳白兔皮膚有無紅斑、水腫,涂抹部位是否有色素沉著、出血點(diǎn)、皮膚粗糙、皮膚菲薄,以及上述變化的恢復(fù)情況和時(shí)間,并與賦形劑側(cè)進(jìn)行比較。試驗(yàn)結(jié)果按皮膚刺激性反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評(píng)分,計(jì)算平均分值,進(jìn)行刺激強(qiáng)度評(píng)價(jià)。見表1～2。

1.2.4 皮膚過敏試驗(yàn) 選擇Hartley豚鼠30只,雌雄各半。試驗(yàn)前24 h將Hartley豚鼠背部沿脊柱兩側(cè)脫毛,每側(cè)脫毛面積3 cm×3 cm。隨機(jī)分為3組并施以藥物,即:空白對(duì)照組、陽性對(duì)照組、芥子咳喘貼組,每組10只。致敏接觸:取芥子貼膏劑0.2 g涂于動(dòng)物左側(cè)脫毛區(qū),用一層油紙及二層紗布覆蓋固定,持續(xù)6 h后溫水洗凈,后于第7、14天以同樣方式重復(fù)給藥1次,共3次?？瞻讓?duì)照組和陽性對(duì)照組以同樣方式分別涂賦形劑0.2 g和2,4-二硝基氯代苯丙酮液0.2 mL。激發(fā)方法:末次致敏后,將3種藥物分別等量涂于各自組別動(dòng)物右側(cè)脫毛區(qū),6 h后溫水洗凈,分別于去除藥物后6、24、48、72 h觀察皮膚過敏情況,進(jìn)行皮膚過敏反應(yīng)評(píng)分和皮膚致敏性評(píng)價(jià)[11]。見表1,表3。

表3 皮膚致敏性評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

2 結(jié)果

2.1 急性毒性試驗(yàn)對(duì)日本大耳白兔一般狀況影響 給藥期間及停藥后,各組日本大耳白兔發(fā)育正常,毛發(fā)光澤,反應(yīng)機(jī)敏,呼吸平穩(wěn),飲水、攝食及排便、排尿正常,天然孔道無異常分泌物。動(dòng)物行為、肌肉緊張力等均未見異常表現(xiàn)。動(dòng)物眼結(jié)膜、口腔黏膜和氣道黏膜未見有分泌物、充血、發(fā)紺、黃疸等現(xiàn)象。未見眼瞼下垂,眼球突出、震顫和混濁。各組無動(dòng)物死亡。

2.2 急性毒性試驗(yàn)對(duì)日本大耳白兔體質(zhì)量、大體解剖狀況影響 5各組動(dòng)物體質(zhì)量平穩(wěn)增長(zhǎng),給藥前、給藥3 d后和給藥7 d后各組日本大耳白兔體質(zhì)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。日本大耳白兔皮膚、脊神經(jīng)及各臟器未見明顯異常改變。見圖1。

圖1 各組用藥后各組織病理學(xué)檢測(cè)結(jié)果(HE染色,×100)

表4 芥子咳喘貼對(duì)日本大耳白兔體質(zhì)量的影響

2.3 急性毒性試驗(yàn)對(duì)日本大耳白兔臟器質(zhì)量及臟器系數(shù)影響 與空白對(duì)照組和芥子咳喘貼常規(guī)劑量組比較,芥子咳喘貼高劑量組肝臟質(zhì)量明顯降低(P<0.05);與空白對(duì)照組比較,芥子咳喘貼高劑量組肺臟質(zhì)量明顯增加(P<0.05),左右腎臟質(zhì)量明顯降低(P<0.05);與空白對(duì)照組和芥子咳喘貼常規(guī)劑量組比較,芥子咳喘貼高劑量組肝臟臟器系數(shù)明顯降低(P<0.05);與空白對(duì)照組比較,芥子咳喘貼高劑量左右腎臟臟器系數(shù)明顯降低(P<0.05),芥子咳喘貼常規(guī)劑量組與空白對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表5～6。

表5 各組日本大耳白兔臟器質(zhì)量比較

表6 各組日本大耳白兔臟器系數(shù)比較

2.4 急性毒性試驗(yàn)對(duì)日本大耳白兔血生化指標(biāo)影響 各組日本大耳白兔血脂(TC、TG、HDL、LDL)、肝功(GPT、GOT)及腎功(BUN、CRE、UA)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表7～8。

表7 各組日本大耳白兔血脂指標(biāo)比較

表8 各組日本大耳白兔肝腎功指標(biāo)比較

2.5 完整皮膚刺激試驗(yàn)結(jié)果 單次給藥結(jié)果顯示,全部日本大耳白兔皮膚在各觀察時(shí)間點(diǎn)均未出現(xiàn)紅斑、水腫,兩側(cè)皮膚刺激評(píng)分均為0。多次給藥結(jié)果顯示,3只日本大耳白兔皮膚在各觀察時(shí)間點(diǎn)均未出現(xiàn)紅斑、水腫,兩側(cè)皮膚刺激評(píng)分均為0;1只兔子給藥4 d后,芥子咳喘貼側(cè)皮膚出現(xiàn)明顯可見紅斑及水腫,給藥7 d后,該側(cè)紅斑增多,呈紫紅色并有焦痂,賦形劑側(cè)皮膚出現(xiàn)中度到嚴(yán)重紅斑,停藥24 h后,芥子咳喘貼側(cè)與賦形劑側(cè)紅斑數(shù)量比為20∶5。停藥72 h后,芥子咳喘貼側(cè)紅斑好轉(zhuǎn),賦形劑側(cè)紅斑加重,二者紅斑數(shù)量比為20∶25,其刺激強(qiáng)度平均分值1.5,為輕度刺激。試驗(yàn)期間各組日本大耳白兔均未出現(xiàn)死亡。

2.6 皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果 芥子咳喘貼組、空白對(duì)照組均未引起Hartley豚鼠皮膚出現(xiàn)紅斑、水腫等過敏反應(yīng),致敏率均為0。陽性對(duì)照組所有Hartley豚鼠在激發(fā)6 h后出現(xiàn)皮膚紅斑、水腫,涂抹部位未出現(xiàn)色素沉著、出血點(diǎn)、皮膚粗糙、皮膚菲薄,部分Hartley豚鼠出現(xiàn)中度到嚴(yán)重紅斑,水腫隆起超過1 mm,反應(yīng)級(jí)數(shù)為3級(jí),48 h后上述過敏癥狀出現(xiàn)減輕反應(yīng)級(jí)數(shù)為2級(jí),72 h后明顯消退,表現(xiàn)為輕度紅斑、水腫,反應(yīng)級(jí)數(shù)為1級(jí)。試驗(yàn)期間各組Hartley豚鼠均未出現(xiàn)休克和死亡。

3 討論

芥子咳喘貼處方靈感來源于明末清初醫(yī)家張璐所著《張氏醫(yī)通》里“白芥子散”組方,該貼劑的多個(gè)衍生方在臨床廣泛用于小兒急性支氣管炎、咳嗽變異性哮喘、反復(fù)呼吸道感染的治療[12-14]。臨床研究證實(shí),芥子咳喘貼適宜小兒急性支氣管炎屬肺經(jīng)蘊(yùn)熱證型,對(duì)咳嗽、咯痰、喘促癥狀具有顯著治療作用[15]。藥效學(xué)研究顯示,芥子咳喘貼具有明顯的鎮(zhèn)咳、祛痰作用。在抗炎方面,常規(guī)劑量組對(duì)部分炎癥介質(zhì),如單核細(xì)胞趨化蛋白1、白細(xì)胞介素-6具有一定程度抑制作用[16]。

本方以白芥子為君藥,主要成分為白芥子苷、芥子堿和脂肪酸等,其藥理成分白芥子苷通過分解產(chǎn)生硫代異氰酸對(duì)羥芐酯,為強(qiáng)力皮膚發(fā)紅劑,該化學(xué)物質(zhì)經(jīng)穴位給藥透皮量和穩(wěn)定透皮速率較高,且藥物經(jīng)穴位的透過量穩(wěn)態(tài)透皮速率更高,穴位皮膚滯留量顯著高于非穴位皮膚[17-18]。是促進(jìn)全方經(jīng)皮吸收、提高療效的重要保證[19]。硫代異氰酸對(duì)羥芐酯對(duì)皮膚刺激作用的層次不同,超劑量或皮膚給藥時(shí)間過長(zhǎng)可造成皮膚刺激損傷或過敏反應(yīng)[20]。

急毒結(jié)果顯示,芥子咳喘貼對(duì)日本大耳白兔一般狀況無顯著影響,給藥期間及停藥后,各組日本大耳白兔生理發(fā)育、機(jī)體代謝及行為活動(dòng)等各項(xiàng)指標(biāo)正常。高劑量組對(duì)日本大耳白兔肝臟、肺臟、左右腎臟質(zhì)量和臟器系數(shù)有一定影響,表現(xiàn)為肺臟質(zhì)量增加,肝臟、左右腎臟質(zhì)量和臟器系數(shù)減少,但各組血生化指標(biāo)并未出現(xiàn)顯著差異,說明芥子咳喘貼高劑量對(duì)某些臟器發(fā)育具有一定抑制作用,但短期給藥未出現(xiàn)臟器功能損害。

皮膚過敏試驗(yàn)結(jié)果顯示,芥子咳喘貼對(duì)Hartley豚鼠無明顯過敏反應(yīng);單次給藥完整皮膚試驗(yàn)結(jié)果顯示,芥子咳喘貼對(duì)日本大耳白兔無明顯皮膚刺激反應(yīng)。多次給藥完整皮膚試驗(yàn)結(jié)果顯示,從第4天起,部分日本大耳白兔皮膚出現(xiàn)紅斑及水腫,停藥3 d后皮損逐漸減輕;表明芥子咳喘貼多次給藥對(duì)日本大耳白兔皮膚具有一定刺激性,考慮到動(dòng)物與人體皮膚結(jié)構(gòu)不同,藥物透皮吸收速率不同,故經(jīng)人體皮膚給藥后出現(xiàn)皮損的時(shí)間、程度以及預(yù)后可能與本試驗(yàn)結(jié)果有所差異,提示臨床如需要多次給藥,應(yīng)合理安排給藥間隔時(shí)間,以連續(xù)給藥不超過3 d為宜,避免皮膚刺激發(fā)生。

本研究表明芥子咳喘貼是一種安全性較高的外用貼劑,預(yù)期臨床應(yīng)用安全性良好,上述結(jié)果可為臨床推廣提供可資借鑒的參考依據(jù)。不足的是,本研究并未進(jìn)行藥物長(zhǎng)期毒性試驗(yàn),難以全面評(píng)估藥物對(duì)重要臟器是否具有遠(yuǎn)期損傷以及評(píng)估毒性反應(yīng)劑量。課題組將在下階段組方優(yōu)化中進(jìn)一步完善相關(guān)研究。

利益沖突聲明:所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。