川芎-丹參配伍治療脊髓損傷的網絡藥理學研究與驗證

劉 港 裴珍珍 鄧博文 蔣昇源 馬 超 白惠中 左心瑋 徐 林 穆曉紅

(1 北京中醫(yī)藥大學,北京,100029; 2 北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院,北京,100010)

脊髓損傷(Spinal Cord Injury,SCI)是指直接或者間接暴力造成脊髓組織損害,主要表現(xiàn)為損傷節(jié)段以下肢體嚴重功能障礙[1]。全球每年SCI人數(shù)25萬～50萬[2]。目前,我國SCI患者人數(shù)超過200萬,其發(fā)病率也伴隨交通意外、建筑事故頻發(fā)而快速上升[3]。SCI有效治療手段較少,是21世紀醫(yī)學領域面臨的重大難題。

原發(fā)性損傷和繼發(fā)性損傷是SCI的2個階段[4]。原發(fā)性損傷包括神經實質及軸突網絡的破壞以各類細胞的機械性損傷。原發(fā)性損傷后繼發(fā)的組織級聯(lián)反應稱為繼發(fā)性損傷,炎癥反應、氧化應激反應、微循環(huán)障礙、離子失衡、細胞凋亡和膠質瘢痕形成及過度增生等是該階段主要病理[5]。SCI作用機制復雜,長期以來,人們針對SCI不同機制分別進行了探索,但進展緩慢。目前,現(xiàn)代醫(yī)學對于SCI治療手段主要包括手術減壓及激素沖擊療法,雖能取得一定效果,但效果并不理想[2]。中醫(yī)藥在SCI后神經微環(huán)境調控方面具有獨特優(yōu)勢[6],但仍需要更多研究進一步闡明其作用機制。

中醫(yī)認為督脈受損,氣滯血瘀為SCI病機,活血祛瘀、通達氣血、溫通督脈為治則,處方以通絡活血、行氣化瘀藥物為主?；仡櫸墨I[7-9]發(fā)現(xiàn),川芎、丹參為活血化瘀藥物代表藥,在治療SCI時常被配伍使用。川芎為“血中之氣藥”,上可至巔頂,下可達血海;丹參具有較強的活血作用,在血瘀類疾病中,常配伍使用。在補陽還五湯、脊髓康、川芎丹參湯等方中,二者均相須為用,共奏行氣活血之功。本研究采用網絡藥理學方法,挖掘川芎-丹參治療SCI的有效成分,預測核心靶點及通路,并對部分網絡藥理學結果進行實驗驗證,以期為后續(xù)基礎研究及臨床應用提供證據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物 健康無特定病原體(Specific Pathogen Free,SPF)級8周齡雌性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley,SD)大鼠30只,體質量220～240 g,購于北京維通利華實驗動物技術有限公司,實驗動物生產許可證號:SCXK(京)2021-0011。于北京中醫(yī)藥大學的SPF級動物飼養(yǎng)中心飼養(yǎng),溫度22 ℃,濕度40%～50%,12 h光暗交替循環(huán),標準飼料飲食,活動無限制。實驗方案經由北京中醫(yī)藥大學動物實驗倫理委員會批準(倫理審批號:BUCM-2022042104-2098)。

1.1.2 藥物 川芎、丹參均購自北京中醫(yī)藥大學東直門醫(yī)院,根據臨床劑量和藥物動物劑量換算[10],并參考文獻[11],給藥劑量分為3個梯度,分別為川芎-丹參高劑量(8.100 g/kg),川芎-丹參中劑量(4.050 g/kg),川芎-丹參低劑量(2.025 g/kg)。

1.1.3 試劑與儀器 酶聯(lián)免疫吸附試驗(Enzyme-Linked Immunosorbent Assay,ELISA)試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,貨號:SEKR-0017);小鼠抗鼠單克隆磷脂酰肌醇3激酶(Phosohoinositide 3 Kinase,PI3K)抗體(武漢三鷹生物技術有限公司,貨號:60225-1-Ig);兔抗鼠多克隆p-PI3K抗體(英國Abcam公司,貨號:ab182651);小鼠抗鼠單克隆p-蛋白激酶B(Protein Kinase B,AKT)抗體(武漢三鷹生物技術有限公司,貨號:66444-1-Ig);兔抗鼠多克隆AKT抗體(武漢三鷹生物技術有限公司,貨號:10176-2-AP);GAPDH(北京索萊寶科技有限公司,貨號:P02436);ECL發(fā)光液(Perkin Elmer公司,美國,貨號:NEL111001);聚偏二氟乙烯(Polyvinylidenefluoride,PVDF)膜(北京索萊寶科技有限公司,貨號:YA1701);酶標儀(無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司,型號:DR-200BS);穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(Bio-rad公司,美國,型號:Powerpac HQ);計算機圖像分析儀(Media Cybernetics公司,美國,型號:Image-Pro Plus Analysis Soft ware)。

1.2 方法

1.2.1 網絡藥理學預測

1.2.1.1 檢索及篩選川芎-丹參藥物主要活性成分 使用中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據庫與分析平臺(https://tcmsp-e.com/)、中國科學院有機化學研究所化學專業(yè)數(shù)據庫(http://www.organchem.csdb.cn.[1978-2019])、化源網(https://www.chemsrc.com/),檢索川芎、丹參兩味藥物的活性成分,并利用Pub-Chem數(shù)據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)查找收集得到的藥物活性成分的化學結構式(2D結構或smiles號),在Swissh(http://www.swissadme.ch/)平臺上傳化學結構式,利用ADME(Absorption、Distribution、Metabolism and Excretion)進行篩選,GI absorption為High;Druglikeness中Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge滿足≥3個yes的活性成分納入。其他重要活性成分通過文獻檢索方式補充。

1.2.1.2 預測川芎-丹參藥物活性成分作用靶點 利用Swiss Target Prediction平臺(http://www.swisstargetprediction.ch),預測ADME篩選后所得活性成分的作用靶點,設置物種為“Homo sapiens”,選取Probability>0的靶基因。

1.2.1.3 獲取SCI疾病基因 以“Spinal cord injury”和“Spinal Cord Traumas”為關鍵詞,在GeneCards(http://www.genecards.org/)和OMIM(http://omim.org/)數(shù)據庫中查找SCI疾病基因。GeneCards數(shù)據庫中,Relevance score大于中位數(shù)的靶點被選為疾病對應的基因。

1.2.1.4 構建川芎-丹參活性成分-SCI相關靶點網絡 利用在線繪圖工具imageGP(http://www.ehbio.com/Cloud_Platform/front/)繪制川芎-丹參藥物成分和SCI對應靶點的韋恩圖。后借助Cytoscape(3.8.2)軟件構建“川芎-丹參活性成分-交集靶點”網絡圖,中藥活性成分的重要性通過節(jié)點度值大小評估。

1.2.1.5 蛋白質-蛋白質相互作用(Protein-protein Interaction,PPI)網絡的構建 在String(https://www.string-db.org/)平臺中導入獲得的交集靶點,定義最高置信度0.900,分析蛋白間作用,后使用Cytoscape軟件,導入分析結果,優(yōu)化圖像。借助CytoNCA插件對PPI網絡數(shù)據進行拓撲屬性分析,篩選出核心靶點網絡。

1.2.1.6 生物富集分析 為了進一步了解所篩選出的靶標蛋白的功能及其在相關通路中的作用,將川芎-丹參和SCI的交集基因導入Metascape數(shù)據庫(https://metascape.org/)中,物種限定為人類,閾值設定為P<0.01,在數(shù)據庫自我檢索和轉化操作后,進行基因本體(Gene Ontology,GO)富集分析和京都基因和基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)富集分析,P值≤0.01的數(shù)據和KEGG通路被認為是與本病的相關性最強,使用imageGP做出可視化結果。

1.2.2 實驗驗證

1.2.2.1 分組與模型制備 30只大鼠隨機分為假手術組、模型組、川芎-丹參高劑量組、川芎-丹參中劑量組、川芎-丹參低劑量組,每組6只。造模前,各組大鼠禁食水12 h,腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉(3%,1.5 mL/kg)。除假手術組外,其余各組采用改良Allen重物打擊法制備SCI模型[12]。大鼠取俯臥位,于背部以胸10椎體為中心,縱向切開皮膚,逐層分離筋膜、肌肉等組織,充分胸10段脊髓。隨后使用脊髓打擊器完成打擊,高25 cm,重量10 g。逐層縫合切口。完成打擊后,局部脊髓表面迅速出現(xiàn)瘀紫色,并伴有強烈尾部擺動,術后雙下肢完全癱瘓,認定為造模成功。假手術組暴露脊髓后即逐層縫合切口,不進行打擊。模型構建完成后,每日2次人工排尿,直至大鼠恢復自主排尿。

1.2.2.2 給藥方法 川芎-丹參各組按照1.1.2劑量灌胃給藥,假手術組給予等量生理鹽水,持續(xù)28 d。

1.2.2.3 檢測指標與方法 1)ELISA檢測大鼠脊髓組織活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)水平,干預28 d后,取各組大鼠脊髓50 mg。采用ELISA試劑盒檢測ROS、MDA含量,檢測均按照試劑盒說明嚴格操作。2)蛋白質印跡法檢測大鼠脊髓組PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達水平,干預28 d后,取各組大鼠脊髓50 mg,冰上研磨呈粉末狀,加入裂解液后離心。蛋白樣品轉移至PVDF膜,加入5%脫脂奶粉,封閉樣品2 h。分別加入一抗PI3K(1∶2 000)、p-PI3K(1∶1 000)、AKT(1∶3 000)、p-AKT(1∶1 000)、GAPDH(1∶5 000),4 ℃孵育過夜,加入二抗室溫孵育1 h,使用ECL液顯色。ImageJ軟件觀察條帶灰度值并計算。

2 結果

2.1 川芎-丹參活性成分及靶點 共收集到川芎-丹參的154個活性成分,其中,川芎84個,丹參74個。4個成分為川芎、丹參中藥所共有。預測154個成分靶點,將重復靶點刪除,最終得到903個靶點,其中川芎645個,丹參788個,530個靶點為二者共有。

2.2 SCI基因 共得到3 446個與SCI相關的基因。

2.3 川芎-丹參活性成分-SCI相關靶點網絡構建 共得到484個川芎-丹參活性成分與SCI的共同靶點。見圖1?！八幬镏饕钚猿煞?交集靶點”關系網絡見圖2。反映川芎-丹參154種成分與484個交集靶點之間的潛在作用。

圖1 川芎-丹參與SCI的韋恩圖

圖2 藥物主要活性成分-交集靶點網絡

2.4 PPI網絡 共發(fā)現(xiàn)關鍵靶點34個。根據Degree值排列,表1列出前8個關鍵節(jié)點,包括淀粉樣前體蛋白、磷脂酰肌醇3激酶、促分裂原活化的蛋白

表1 川芎-丹參治療SCI的核心靶點

激酶1、絲/蘇氨酸蛋白激酶1、促分裂原活化的蛋白激酶3、信號轉導及轉錄激活子3、緩激肽受體B2、細胞外鈣敏感受體。關鍵靶點相互作用關系見圖3。

圖3 川芎-丹參治療SCI關鍵靶點網絡

2.5 GO功能富集分析結果 共得到447個GO功能富集分析條目(P<0.01),其中生物過程(Biologi-cal Process,BP)條目247個,細胞組分(Cellular Component,CC)條目94個,分子功能(Molecular Function,MF)條目106個。BP包括對有機氮化合物的細胞反應、激酶活性的正向調節(jié)、炎癥反應等。CC包括神經元胞體、軸突等。MF包括神經遞質受體活性、蛋白激酶活性等。各組前12個條目見圖4。

圖4 川芎-丹參治療SCI的關鍵靶點的GO功能富集分析

2.6 KEGG通路分析結果 KEGG通路富集篩選得到126條信號通路(P<0.01),涉及PI3K/AKT、cAMP、Apoptosis、MAPK等信號通路等,這意味著川芎-丹參可通過調控上述信號通路達到促SCI后神經修復的效果。前20條通路構建可視化見圖5。藥物-疾病-核心交集靶點-通路網絡圖見圖6。

圖5 川芎-丹參治療SCI關鍵靶點的KEGG通路富集分析

圖6 藥物-疾病-核心交集靶點-通路網絡

2.7 川芎-丹參對SCI大鼠脊髓組織ROS、MDA水平的影響 與假手術組比較,模型組大鼠脊髓ROS及MDA表達升高(P<0.01);與模型組比較,川芎-丹參各劑量組ROS均降低(P<0.01);川芎-丹參高、中劑量組MDA均降低(P<0.01);其中川芎-丹參高劑量組差異最為顯著。見表2。

表2 川芎-丹參對SCI大鼠脊髓組織ROS、 MDA表達的影響

2.8 川芎-丹參對SCI大鼠脊髓組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達的影響 PI3K及AKT蛋白表達組間差異均無統(tǒng)計學意義(均P>0.05);與假手術組比較,模型組大鼠脊髓p-PI3K、p-AKT顯著降低(P<0.01);與模型組比較,川芎-丹參各劑量組p-PI3K、p-AKT均升高(P<0.01);其中川芎-丹參高劑量組差異最為顯著。見表3,圖7。

表3 川芎-丹參對SCI大鼠脊髓組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達的影響

圖7 各組大鼠脊髓組織PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達電泳條帶

3 討論

《靈樞經·寒熱病》曰:“身有所傷,血出多,及中風寒,若有所墮墜,四支懈惰不收,名曰體惰?！敝嗅t(yī)理論認為SCI當屬于“體惰”和“痿證”范疇。SCI血絡受損,血不循經而溢出脈外,離經之血成為瘀血。在此病理狀態(tài)下,陽氣不能交會于四肢,而且氣血不能輸布四肢以濡養(yǎng)筋脈,從而導致四肢麻木,痿軟無力甚至截癱?！皻鉁觥笔荢CI的主要病機,“行氣活血”是其主要治則。川芎被稱為血中之氣藥,走行力強。其有效成分川芎嗪可改善SCI繼發(fā)的微循環(huán)障礙,抑制炎癥反應以及神經細胞凋亡等[13-15]。丹參具有活血祛瘀,涼血消癰的功效,也是活血化瘀的重點藥物,PI3K/AKT、缺氧誘導因子1-α(Hypoxia Inducible Factor-1,HIF-α)/血管內皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)、細胞因子信號傳送阻抑物3(Suppressor of Cytokine Signaling 3,SOCS3)/STAT3等多條通路可被丹參有效活性成分丹參酮ⅡA激活[16-18],進而抑制炎癥反應、細胞凋亡等,改善微循環(huán)障礙。川芎、丹參臨床治療SCI時常相須為用,共同發(fā)揮活血化瘀之功,探究二者配伍后作用靶點、調控機制,將為SCI治療提供新的治療思路及實驗數(shù)據支持。本研究通過網絡藥理學數(shù)據分析,川芎-丹參治療SCI具有相關作用靶點484個。通過PPI網絡圖發(fā)現(xiàn),各靶點間存在大量交互關系,APP、PI3K、MAPK1/3、AKT1是最重要靶點蛋白。淀粉樣前體蛋白(Amyloid Precursor Protein,APP)是一種膜內在蛋白,廣泛存在神經元的突觸中,其可被β淀粉樣前體蛋白切割酶1(Beta-site Amyloid Precursor Protein Cleaving Enzyme 1,BACEL)和γ分泌酶分解產生β淀粉樣蛋白(Amyloid β,Aβ)[19]。研究表明SCI小鼠損傷早期APP、BACE1和γ-分泌酶和Aβ的水平明顯增加[20],進一步對SCI小鼠應用DAPT(γ-分泌酶抑制劑)發(fā)現(xiàn),Aβ形成顯著減少,進而影響SCI小鼠運動功能恢復。MAPK1、MAPK3在MAPK信號轉導中扮演了重要角色,可使絲氨酸、蘇氨酸和絡氨酸去磷酸化,抑制AMPK激活[21]。抑制SCI小鼠MAPK1/MAPK3表達后,可抑制炎癥通路激活、減輕炎癥反應以及神經細胞凋亡[22]。AKT1是PI3K下游主要的效應物,參與調控PI3K/AKT[23]。研究發(fā)現(xiàn),促進AKT激活,可提高抗凋亡蛋白表達,抑制促凋亡蛋白表達,減少SCI后神經細胞凋亡[24-25]。

對關鍵靶點進行GO富集分析,發(fā)現(xiàn)川芎-丹參治療SCI主要涉及細胞對氮化合物的反應、激酶活性調節(jié)、離子平衡、對創(chuàng)傷的反應、炎癥反應、跨突觸信號等生物學過程。涉及蛋白激酶活性、磷酸轉移酶活性、激酶結合等分子功能;涉及膜閥、受體復合物、樹突、軸突等細胞組分。通過KEGG富集分析,篩選得到了126條通路,在查閱相關資料和閱讀文獻后,發(fā)現(xiàn)PI3K/AKT、cAMP、MAPK等通路在川芎-丹參治療SCI中發(fā)揮著關鍵作用。PI3K/AKT信號通路參與細胞凋亡、自噬及增殖等多個表型。該通路激活后,磷酸肌醇三磷酸可被p-PI3K催化,進而作用于AKT并使其活化[23]。環(huán)磷酸腺苷(Cyclic Adenosine Monophosphate,cAMP)廣泛存在于中樞神經系統(tǒng)中,cAMP表達抑制可減少脊髓斷端軸突增長[26]。使用cAMP衍生物可以促使SCI大鼠神經干細胞分化和神經細胞增殖,這些對神經恢復尤為關鍵[27-28]。MAPK信號通路是指以MAPK為代表的信號轉導通路,MAPK通過逐級磷酸化,進入細胞核,調控細胞炎癥、增殖、凋亡等過程[29]。該通路包括細胞外調節(jié)蛋白激酶(Extracellular Regulated Protein Kinases,ERK1/2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal Kinase,JNK)和p38MAPK3條信號通路。研究發(fā)現(xiàn),抑制SCI小鼠組JNK通路,可促進小鼠行為學改善,這可能與JNK通路抑制劑下調凋亡相關基因表達、阻止受損神經元異?；钴S相關[30-31]。QIAN等[32]發(fā)現(xiàn)抑制p38MAPK信號通路,能夠抑制氧化應激反應、炎癥反應及減少細胞凋亡,減少繼發(fā)性損傷階段膠質瘢痕增生及增加神經營養(yǎng)因子表達。

本研究進一步探究PI3K/AKT信號通路發(fā)現(xiàn),SCI發(fā)生后,PI3K/AKT信號通路被抑制,而川芎-丹參能激活該通路。PI3K/AKT信號通路是與SCI病理過程密切相關的重要通路,激活該通路可以通過減少細胞凋亡、減輕炎癥反應和防止膠質瘢痕形成來促進脊髓損傷后神經功能的恢復[32]。該通路與氧化應激反應也具有密切的關系。氧化應激是指機體氧化系統(tǒng)與抗氧化系統(tǒng)失衡,ROS過度累積的一種代謝狀態(tài)。過量產生的ROS激發(fā)鏈式脂質過氧化反應,加重炎癥反應,加快細胞凋亡[33]。PI3K/AKT信號通路能通過調節(jié)過氧化物酶體增殖物激活受體α等調控脂質過氧化反應[34]。實驗結果發(fā)現(xiàn),SCI發(fā)生后,ROS及MDA表達水平顯著增加,而川芎-丹參能減低ROS及MDA表達水平,表明其在一定程度上能改善氧化應激反應,減輕脊髓繼發(fā)性損傷,這可能與其調控PI3K/AKT信號通路相關。

綜上所述,川芎-丹參配伍治療SCI具有多靶點、多途徑的優(yōu)勢,可能是通過激活PI3K/AKT信號通路,進而抑制氧化應激反應,減輕脊髓繼發(fā)性損傷。本研究為進一步探究川芎-丹參配伍治療SCI提供了一定的藥理學基礎。但本研究只對部分網絡藥理學結果進行驗證,其作用機制仍有待進一步探究。

利益沖突聲明:無。