巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質(zhì)體融合育種*

閆亞敏，梁大偉，馬建偉，劉欣芊，肖裕玲，高錦運(yùn)，田 怡，薛建邦，莫美華

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642）

原生質(zhì)體融合是生物工程育種的一項(xiàng)重要技術(shù)，該技術(shù)可以去除細(xì)胞壁的屏障，實(shí)現(xiàn)遠(yuǎn)緣雜交，集雙親優(yōu)良遺傳性狀于一體，并定向篩選表現(xiàn)雙親優(yōu)良遺傳性狀的融合子，遺傳信息傳遞量大，操作方便，適用性強(qiáng)[1-3]。近年來食用菌原生質(zhì)體融合技術(shù)在理論和應(yīng)用上都取得了很大進(jìn)展，國(guó)內(nèi)許多研究者通過試驗(yàn)已經(jīng)獲得了食用菌種內(nèi)、種間、屬間，甚至科間原生質(zhì)體融合子，并結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)就食用菌育種進(jìn)行了大量的研究，取得了令人矚目的進(jìn)展[4-9]。通過原生質(zhì)體融合技術(shù)，可以改善食用菌品質(zhì)，提高產(chǎn)量，增強(qiáng)抗性，對(duì)食用菌的良種選育具有深刻意義[10-11]。

雙孢蘑菇（Agaricus bisporus） 具有清熱解毒、消炎潤(rùn)肺等多種保健功能，是目前世界上人工栽培最廣泛、產(chǎn)量最高、消費(fèi)量最大的食用菌，產(chǎn)量約占世界食用菌總產(chǎn)量的40%[12-13]。巨大口蘑（Macrocybe gigantea） 是一種口感鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富、產(chǎn)量高的珍稀食用菌，具有防癌抗癌、抗氧化、抑制高血壓、抑制細(xì)菌、抑制真菌、抑制艾滋病病毒、提高免疫力等多種功效[14-19]。而且貨架期長(zhǎng)，在貯藏運(yùn)輸中不易褐變和腐爛，8～12 ℃條件下保存30 d 不變色、不變味，適合鮮銷和加工，有很好的開發(fā)價(jià)值和應(yīng)用前景。但實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)現(xiàn)其生長(zhǎng)速度慢、栽培周期長(zhǎng)，該缺點(diǎn)嚴(yán)重制約了產(chǎn)業(yè)化與規(guī)模化的發(fā)展[20-22]。為了解決巨大口蘑生長(zhǎng)速度慢、栽培周期長(zhǎng)、較難均衡供應(yīng)市場(chǎng)的難題，選育生長(zhǎng)速度快、栽培周期短的巨大口蘑新菌株顯得尤為重要。

將優(yōu)質(zhì)、耐貯藏的巨大口蘑和高產(chǎn)、適應(yīng)性強(qiáng)的雙孢蘑菇作為親本菌株，進(jìn)行原生質(zhì)體融合育種，建立巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質(zhì)體制備、融合及再生的優(yōu)化體系，以得到具有新的生理特性的融合菌株。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

巨大口蘑菌株，華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院應(yīng)用真菌實(shí)驗(yàn)室保藏；雙孢蘑菇2796，購(gòu)于廣東省微生物研究所。

1.2 試驗(yàn)培養(yǎng)基

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、MgSO40.05%、KH2PO40.15%、瓊脂2%。

再生培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、MgSO40.05%、KH2PO40.2%、VB10.001%、蛋白胨0.3%、瓊脂2%、0.6 mol·L-1甘露醇1 L，pH 7.0。

液體培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%。

栽培料配方：棉籽殼30%、蔗渣60%、麩皮8%、石灰1%、輕質(zhì)碳酸鈣0.2%、MgSO40.1%、KH2PO40.2%、酵母粉0.5%，pH 6.0～7.0。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菌絲體制備

在巨大口蘑的PDA 培養(yǎng)基上用打孔器（直徑為1.2 cm） 取2～3 塊菌絲體最前端生長(zhǎng)旺盛的菌絲塊，接種于160 mL 液體培養(yǎng)基中，30 ℃、160 r·min-1條件下培養(yǎng)7～10 d，得到菌絲球。將菌絲球轉(zhuǎn)移到160 mL 液體培養(yǎng)基中，30 ℃靜置培養(yǎng)4 d 以上，無菌條件下挑取菌絲體，無菌濾紙吸干水分，得到巨大口蘑菌絲體。雙孢蘑菇菌絲培養(yǎng)溫度為26 ℃，其他方法同上。

1.3.2 原生質(zhì)體制備

使用一定量的滲透壓穩(wěn)定劑（0.6 mol·L-1KCl 與0.6 mol·L-1的甘露醇以1 ∶1 復(fù)配） 將收集到的菌絲反復(fù)洗滌2～3 次。按照每0.3～0.5 克菌絲加入1 mL 酶液的比例，巨大口蘑采用5%纖維素酶和5%蝸牛酶作為混合酶系，在31 ℃條件下，酶解4.5 h；雙孢蘑菇采用7.6%纖維素酶和4%蝸牛酶作為混合酶系，在32 ℃條件下，酶解2.2 h。酶解完畢后，濾液低速離心棄上清液收集沉淀，用滲透壓穩(wěn)定劑洗滌2 次，并加入與酶液等體積的滲透壓穩(wěn)定劑重懸原生質(zhì)體，測(cè)定巨大口蘑和雙孢蘑菇原生質(zhì)體的釋放量。

1.3.3 原生質(zhì)體滅活

將巨大口蘑和雙孢蘑菇的原生質(zhì)體的量調(diào)整到1×106個(gè)/mL。巨大口蘑原生質(zhì)體使用紫外滅活：15 W 紫外燈，于25 cm 處照射18 min。雙孢蘑菇原生質(zhì)體使用熱滅活：56 ℃水浴，熱滅活30 min。均達(dá)到100%滅活。

1.3.4 原生質(zhì)體的融合條件研究

使用分子量為6 000 的聚乙二醇（PEG） 為融合劑，研究PEG 濃度、融合時(shí)間和溫度對(duì)原生質(zhì)體融合的影響。初始條件為30 ℃融合20 min，再以前一步篩選結(jié)果作為后一步試驗(yàn)條件，分別逐步設(shè)置PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%、20%、30%、40%、50%；融合時(shí)間為5、10、15、20、25、30 min；融合溫度為20、25、30、35、40 ℃。

1.3.5 原生質(zhì)體的融合與再生

分別將0.5 mL 純化滅活的巨大口蘑和雙孢蘑菇原生質(zhì)體懸液按照體積比1 ∶1 混合，30 ℃條件預(yù)熱5 min 后加入一定濃度的PEG 1 mL，迅速置于30 ℃水浴中，按照設(shè)定時(shí)間取樣，3 000 r·min-1離心15 min，棄去上清液，加入滲透壓穩(wěn)定劑洗滌2 次去除PEG，得到原生質(zhì)體融合物。取0.1 mL 原生質(zhì)體融合物涂布于再生培養(yǎng)基上，26 ℃避光培養(yǎng)10～20 d，定期觀察融合子的生長(zhǎng)情況并計(jì)算融合率。融合率（R，%） 的計(jì)算公式為[23]：

式中：N 為融合子的再生菌落數(shù)（個(gè)）；P 為雙親原生質(zhì)體數(shù)（個(gè)）。

1.3.6 融合菌株的鑒定

融合菌株和親本菌株在PDA 培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)，觀察、記錄菌落形態(tài)。采用插片法培養(yǎng)，待菌絲長(zhǎng)滿蓋玻片后用乳酸石炭酸染色，于16×40 倍顯微鏡下觀察、記錄菌絲形態(tài)。根據(jù)融合子形態(tài)特征、拮抗試驗(yàn)結(jié)果和菌絲生長(zhǎng)速度進(jìn)行初步鑒定，經(jīng)過鑒定之后，選取與母種具有明顯形態(tài)差異、發(fā)生拮抗反應(yīng)且具有鎖狀聯(lián)合的菌株，進(jìn)行出菇試驗(yàn)，記錄、比較其出菇時(shí)間和商品性狀。

2 結(jié)果與分析

2.1 巨大口蘑和雙孢蘑菇原生質(zhì)體的制備

在前期研究的基礎(chǔ)上[24]，巨大口蘑和雙孢蘑菇分別以菌齡5 d 和4 d 的菌絲體作為材料，經(jīng)過纖維素酶和蝸牛酶混合酶解后，巨大口蘑原生質(zhì)體的釋放量為7.5×106個(gè)/mL，雙孢蘑菇原生質(zhì)體的釋放量為9.9×106個(gè)/mL，制備得到的雙孢蘑菇和巨大口蘑的原生質(zhì)體如圖1 所示。

圖1 巨大口蘑（A） 和雙孢蘑菇（B） 的原生質(zhì)體（10×）Fig.1 Macrocybe gigantea (A) and Agaricus bisporus (B) protoplasts (10×)

2.2 PEG 濃度對(duì)原生質(zhì)體融合的影響

PEG 濃度是影響原生質(zhì)體融合的關(guān)鍵因素，研究表明分子量為4 000～6 000 的PEG 對(duì)原生質(zhì)體的融合效果較好[25]。將分子量為6 000 的PEG 作為融合劑，不同PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)下巨大口蘑和雙孢蘑菇的原生質(zhì)體融合率見圖2。

圖2 PEG 濃度對(duì)巨大口蘑和雙孢蘑菇原生質(zhì)體融合的影響Fig.2 Effect of PEG concentration on protoplast fusion between Macrocybe gigantea and Agaricus bisporus

由圖2 可知，當(dāng)PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí)，巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質(zhì)體的融合率達(dá)到最高，為0.010 7%，在此基礎(chǔ)上PEG 的濃度再增大或者減小，融合率都開始下降。這是因?yàn)榈蜐舛鹊腜EG 會(huì)使原生質(zhì)體破裂而失去穩(wěn)定性，濃度過高則會(huì)導(dǎo)致原生質(zhì)體失水收縮，從而融合率降低，且高濃度的PEG 還有一定的毒性。因此巨大口蘑和雙孢蘑菇原生質(zhì)體融合的最佳PEG（分子量為6 000） 的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%，可觀察到出現(xiàn)2 個(gè)或2 個(gè)以上原生質(zhì)體融合現(xiàn)象，見圖3。

圖3 PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí)融合子電鏡圖（100×）Fig.3 Electron micrograph of fusion at 30% PEG mass fraction (100×)

2.3 融合時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體融合的影響

不同融合時(shí)間下巨大口蘑和雙孢蘑菇的原生質(zhì)體融合率見圖4。

圖4 融合時(shí)間對(duì)巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質(zhì)體融合的影響Fig.4 Effect of fusion time on protoplast fusion between Macrocybe gigantea and Agaricus bisporus

由圖4 可知，當(dāng)融合時(shí)間為20 min 時(shí)，巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質(zhì)體融合率最高，為0.013 6%。融合時(shí)間過長(zhǎng)或者過短都會(huì)使融合率下降，這是因?yàn)槿诤蠒r(shí)間過短，原生質(zhì)體沒有充分的融合；融合時(shí)間過長(zhǎng)，可能使已經(jīng)形成的原生質(zhì)體橋斷裂，融合率和再生率都降低。因此，巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質(zhì)體融合的最佳時(shí)間為20 min。

2.4 融合溫度對(duì)原生質(zhì)體融合的影響

不同融合溫度下巨大口蘑和雙孢蘑菇的原生質(zhì)體融合率見圖5。

圖5 融合溫度對(duì)巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質(zhì)體融合的影響Fig.5 Effect of fusion temperature on protoplast fusion between Macrocybe gigantea and Agaricus bisporus

由圖5 可知，當(dāng)溫度從20 ℃升高到30 ℃時(shí)，巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質(zhì)體融合率一直處于上升的趨勢(shì)，說明融合過程中適當(dāng)提高溫度能促進(jìn)原生質(zhì)的融合，溫度高于30 ℃時(shí)融合率開始下降?？紤]到低溫原生質(zhì)體的活性低，而高溫又對(duì)原生質(zhì)體有一定的損傷，因此，巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質(zhì)體融合時(shí)溫度應(yīng)以30 ℃為宜。

2.5 融合子的再生

在pH 為8.5、PEG 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%、融合時(shí)間為20 min、融合溫度為30 ℃、三羥甲基氨基甲烷（Tris）濃度為0.016 mol·L-1、CaCl2的濃度為0.014 mol·L-1的條件下，巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質(zhì)體的融合率為0.038 7%，顯微鏡觀察下的融合子見圖6。

如圖6 所示，挑選出14 個(gè)融合子進(jìn)行再生培養(yǎng)，從中篩選出有利于穩(wěn)定傳代培養(yǎng)的7 個(gè)融合菌株進(jìn)行下一步培養(yǎng)鑒定試驗(yàn)。

2.6 融合菌株的鑒定

2.6.1 菌落特征觀察

對(duì)2 個(gè)親本菌株和篩選出的7 個(gè)融合菌株進(jìn)行培養(yǎng)，菌落特征見圖7。

圖7 7 個(gè)融合菌株與2 個(gè)親本菌株的菌落形態(tài)Fig.7 Colony morphology of 7 fusion strains and 2 parent strains

由圖7 可知，親本巨大口蘑的菌絲潔白且粗壯，菌落邊緣較整齊，表面平坦、光滑，呈絨毛狀；而雙孢蘑菇的菌絲細(xì)密，菌落邊緣不規(guī)整，呈菌束狀并且疏松。融合菌株的菌落形態(tài)介于2 個(gè)親本之間，菌株H49、H99、H100 菌絲形態(tài)接近巨大口蘑，菌絲致密、粗壯，表面呈絨毛狀，貼合培養(yǎng)基生長(zhǎng)；而菌株612、41、710、75 的菌絲形態(tài)接近雙孢蘑菇，菌絲細(xì)密，呈菌束狀并且疏松，菌落邊緣大多不整齊。

2.6.2 拮抗試驗(yàn)結(jié)果

7 個(gè)融合菌株分別與2 個(gè)親本菌株進(jìn)行拮抗試驗(yàn)，結(jié)果見圖8。

圖8 融合菌株與親本菌株的拮抗試驗(yàn)結(jié)果Fig.8 Results of antagonism test between fusion strains and parent strains

如圖8 所示，7 個(gè)融合菌株均與親本菌株形成明顯的拮抗線。其中融合菌株H49、H99、H100 與親本巨大口蘑發(fā)生強(qiáng)烈的拮抗反應(yīng)，菌絲接觸位置形成明顯隆起的拮抗線，并且通過菌落形態(tài)可以觀察出與巨大口蘑的同源性較大。融合菌株612、41、710、75 與親本雙孢蘑菇的拮抗線明顯，并且通過菌落形態(tài)可以觀察出與雙孢蘑菇的同源性較大。

2.6.3 菌絲形態(tài)觀察

對(duì)菌絲形態(tài)進(jìn)行觀察，具有鎖狀聯(lián)合的4 個(gè)融合菌株和2 個(gè)親本菌株的菌絲形態(tài)見圖9。

圖9 4 個(gè)融合菌株與2 個(gè)親本菌株的菌絲顯微圖片（16×40）Fig.9 Mycelial micrograph of 4 fusion strains and 2 parent strain (16×40)

由圖9 可知，親本巨大口蘑的菌絲較細(xì)，有鎖狀聯(lián)合體。親本雙孢蘑菇菌絲較巨大口蘑菌絲粗，沒有鎖狀聯(lián)合體，橫隔膜較明顯。融合菌株H99 鎖狀聯(lián)合較多，菌絲細(xì)密，而融合菌株H49、H100、612 菌絲有較少鎖狀聯(lián)合，菌絲寬度介于巨大口蘑與雙孢蘑菇之間。融合菌株41、710、75 的菌絲無鎖狀聯(lián)合，且結(jié)合前期菌落特征觀察和拮抗試驗(yàn)結(jié)果，表明融合菌株41、710、75 與雙孢蘑菇較為接近，因此后續(xù)不再進(jìn)行研究。

2.6.4 母種的菌絲生長(zhǎng)速度

篩選出的4 個(gè)融合菌株與2 個(gè)親本菌株的母種生長(zhǎng)情況見表1。

表1 4 個(gè)融合菌株與2 個(gè)親本菌株的母種菌絲生長(zhǎng)情況比較Tab.1 Comparison of the mycelial growth of stock culture between 4 fusion strains and 2 parent strains

由表1 可知，各菌株菌絲生長(zhǎng)速度顯著快于親本巨大口蘑（P＜0.05）。在相同的培養(yǎng)條件下，親本雙孢蘑菇的菌絲生長(zhǎng)速度較快，巨大口蘑的菌絲生長(zhǎng)速度較慢。融合菌株H49、H99、H100 菌絲生長(zhǎng)速度與雙孢蘑菇相比較慢，但顯著快于巨大口蘑菌絲生長(zhǎng)速度，且菌絲長(zhǎng)勢(shì)濃密，形態(tài)接近巨大口蘑。融合菌株612 的生長(zhǎng)速度顯著快于雙孢蘑菇，且菌絲形態(tài)接近于雙孢蘑菇，因此后續(xù)沒有進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.6.5 栽培種的菌絲生長(zhǎng)速度

對(duì)篩選出的融合菌株H49、H99、H100 與親本巨大口蘑開展進(jìn)一步的比較試驗(yàn)，記錄從接種到不同培養(yǎng)時(shí)間段栽培種的平均菌絲生長(zhǎng)速度，結(jié)果見表2。

表2 融合菌株與親本巨大口蘑栽培種的菌絲生長(zhǎng)速度比較Tab.2 Comparison of spawn mycelial growth rates between fusion strains and parent Macrocybe gigantea

由表2 可知，3 個(gè)融合菌株的栽培種菌絲生長(zhǎng)速度顯著快于親本巨大口蘑（P＜0.05）。并且在試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，接種后培養(yǎng)7 d，融合菌株即可明顯觀察到菌絲生長(zhǎng)，而親本巨大口蘑的菌絲生長(zhǎng)不明顯，說明融合菌株的菌絲活性明顯優(yōu)于親本巨大口蘑。

2.6.6 出菇試驗(yàn)

對(duì)3 個(gè)融合菌株與親本巨大口蘑進(jìn)行出菇試驗(yàn)，結(jié)果見表3 和圖10。

表3 3 個(gè)融合菌株與親本菌株巨大口蘑出菇時(shí)間比較Tab.3 Comparison of fruiting time between 3 fusion strains and parent Macrocybe gigantea

圖10 3 個(gè)融合菌株與親本菌株巨大口蘑出菇圖Fig.10 Fruiting of parental strain Macrocybe gigantea and 3 fusion strains

由表3 和圖10 可知，在相同的培養(yǎng)條件下，融合菌株的出菇時(shí)間明顯短于母本菌株巨大口蘑。栽培試驗(yàn)中，融合菌株在溫度和濕度都隨天氣改變的條件下也能正常出菇，只是出菇量相對(duì)減少，表現(xiàn)出明顯的抗逆性，進(jìn)一步說明融合菌株具有與母本優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)的優(yōu)良性狀。融合菌株與母本菌株相比菌柄更加粗壯，朵形優(yōu)美，菇形整齊，長(zhǎng)勢(shì)較好。

3 結(jié)論與討論

食用菌原生質(zhì)體融合根據(jù)誘導(dǎo)因子不同，分為化學(xué)融合、物理融合和生物融合三大類，目前PEG誘導(dǎo)的化學(xué)融合應(yīng)用最為廣泛，影響原生質(zhì)體PEG融合的因素主要有PEG 的濃度、融合時(shí)間、融合溫度等[26]。PEG 誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合機(jī)制主要是通過氫鍵和原生質(zhì)體的結(jié)合水結(jié)合，引起膜結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致原生質(zhì)體失水，引起原生質(zhì)體凝集作用，發(fā)生原生質(zhì)體融合。分子量為4 000～10 000 的PEG 均能誘導(dǎo)原生質(zhì)體的全融合，小分子量的PEG 較大分子量的PEG 處理的融合率低，而大分子量的PEG 處理則易出現(xiàn)多核融合。在食用菌原生質(zhì)體融合過程中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為25%～45%的PEG 處理可獲得較高的原生質(zhì)體融合率，與本試驗(yàn)中得到的PEG（分子量為6 000） 質(zhì)量分?jǐn)?shù)為30%時(shí)融合率高的結(jié)果相符[27-30]。融合時(shí)間和融合溫度都會(huì)對(duì)原生質(zhì)體的融合率產(chǎn)生影響，融合時(shí)間過長(zhǎng)PEG 對(duì)原生質(zhì)體的毒性增加，融合溫度直接影響原生質(zhì)體的流動(dòng)和活性。本試驗(yàn)中篩選的融合時(shí)間為20 min，融合溫度為30 ℃，與前人的研究基本相符。最終在pH 8.5、Tris 濃度為0.016 mol·L-1、Ca2+濃度為0.014 mol·L-1條件下，融合率達(dá)0.038 7%，建立了巨大口蘑與雙孢蘑菇原生質(zhì)體PEG 融合體系。

融合子的驗(yàn)證可以從多個(gè)方面進(jìn)行，本試驗(yàn)從形態(tài)學(xué)特征、拮抗試驗(yàn)結(jié)果、菌絲生長(zhǎng)速度和出菇試驗(yàn)多個(gè)角度和層次，確切地表明了融合菌株是不同于親本的新菌株。形態(tài)學(xué)是菌種鑒定的基礎(chǔ)，形態(tài)的差異表明菌株的生理代謝存在差異；通過拮抗線說明融合菌株和親本菌株之間存在排異現(xiàn)象；再通過母種和栽培種生長(zhǎng)速度的測(cè)定更確切地驗(yàn)證了融合菌株是不同于親本的新菌株，比親本菌株具有更多優(yōu)勢(shì)；最后應(yīng)用出菇試驗(yàn)進(jìn)一步證明了融合是成功的，實(shí)現(xiàn)了科間融合成功。試驗(yàn)中雖然獲得了多株融合菌株，但是沒有對(duì)類似于雙孢蘑菇的菌株進(jìn)行進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)中選育出的穩(wěn)產(chǎn)、栽培周期較短的巨大口蘑融合新菌株，為食用菌的生產(chǎn)提供了可穩(wěn)定擴(kuò)繁的優(yōu)良雜交菌系，這對(duì)巨大口蘑品種的更新?lián)Q代和在原生質(zhì)體水平上成功開展巨大口蘑雜交育種提供了范例，可為巨大口蘑育種、栽培提供一定的指導(dǎo)。