1 株野生斑玉蕈的生物學(xué)特性及馴化栽培*

呂 童，羅紅梅，蘇開美，何 俊，唐松明，李樹紅**

（1.云南大學(xué)資源植物研究院，云南 昆明 650500；2.云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650205）

斑玉蕈（Hypsizygus marmoreus） 隸屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 傘菌綱（Agaricomycetes） 傘菌目（Agaricales） 離褶傘科（Lyophyllaceae） 玉蕈屬（Hypsizygus），野生資源主要分布于中國的云南、東北，以及日本、西伯利亞、歐洲、北美洲等地區(qū)，秋季多發(fā)生于殼斗科植物的枯木和倒木上[1-2]。

斑玉蕈因具有鮮厚嫩滑的口感為人稱道，近年研究表明斑玉蕈具有提高動物抗病性、抗疲勞以及抗癌的作用[3-6]。栽培斑玉蕈自1986 年引入中國以來，很快就在食用菌市場上大放異彩，現(xiàn)已成為我國繼金針菇（Flammulina filiformis） 與杏鮑菇（Pleurotus eryngii） 后的全國第三大食用菌工廠化栽培品種[7]。目前福建、廣東、山東、湖南、上海等?。ㄊ校?均實(shí)現(xiàn)了斑玉蕈工廠化栽培，截止到2020 年，斑玉蕈年產(chǎn)值達(dá)到416 244.63 萬元。

研究發(fā)現(xiàn)，斑玉蕈對生存環(huán)境的要求較高，多生于未被破壞的原始森林中，由于環(huán)境變化，現(xiàn)存的斑玉蕈野生種群極為稀少[1]。國內(nèi)外有關(guān)野生斑玉蕈資源開發(fā)利用的報(bào)道較少，斑玉蕈新品種選育主要利用現(xiàn)有的商品種進(jìn)行誘變和雜交[8-9]。為了適應(yīng)行業(yè)的發(fā)展，亟需新的種質(zhì)資源以選育出具有自主知識產(chǎn)權(quán)、可進(jìn)行工廠化栽培的斑玉蕈品種。我國斑玉蕈人工栽培技術(shù)較成熟，在菌種保藏、不同栽培料對斑玉蕈生長的影響、不同品種營養(yǎng)成分對比等方面均取得了一定的成果，但斑玉蕈優(yōu)質(zhì)種源獲取和品種選育方面仍是短板[10-17]。試驗(yàn)以采自西藏的野生子實(shí)體為材料，對其進(jìn)行形態(tài)和分子鑒定，開展菌株生物學(xué)特性研究，并進(jìn)行馴化栽培。旨在為實(shí)現(xiàn)選育出具有自主知識產(chǎn)權(quán)的斑玉蕈新品種和工廠化栽培奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

野生菌株子實(shí)體由李樹紅研究員于2018 年8 月25 日采集自西藏自治區(qū)林芝市（海拔3 890 m，97°58′9″ E，28°35′32″ N），該子實(shí)體生于濕潤、潮濕的腐木上。通過組織分離獲得菌株L4550，保存于云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所種質(zhì)資源庫。

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA 母種培養(yǎng)基配方：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、酵母粉2 g、硫酸鎂0.2 g、磷酸二氫鉀0.2 g、瓊脂粉16 g，水1 L，pH 自然。

試驗(yàn)基礎(chǔ)培養(yǎng)基配方：葡萄糖20 g、蛋白胨2 g、硫酸鎂0.2 g、瓊脂粉16 g，水1 L，pH 自然。

原種栽培料配方：木屑40%、玉米芯20%、米糠20%、麩皮15%、玉米粉4%、氫氧化鈣1%。根據(jù)原種栽培料配方質(zhì)量比稱取各種原材料，將木屑、玉米芯提前用水浸泡12 h，然后加水拌勻，最終含水量為60%～70%。將栽培料裝入體積為1 100 mL的栽培瓶，每瓶裝料555～560 g。

1.3 形態(tài)鑒定

參照李博等[18]的方法，對野外采集的標(biāo)本進(jìn)行拍攝，拍攝時(shí)應(yīng)將子實(shí)體的菌蓋、菌褶、菌柄拍攝清晰。新鮮標(biāo)本通過組織分離獲得菌株后，在40～60 ℃烘箱內(nèi)烘烤獲得干標(biāo)本，編號并保存。同時(shí)采用徒手切片法制作切片，用剛果紅染色后，在顯微鏡下觀察子實(shí)體菌蓋、菌柄、菌褶的顯微結(jié)構(gòu)。

1.4 分子鑒定

取L4550 菌株的純培養(yǎng)菌絲50 mg 或干標(biāo)本20 mg 置于研缽中，加入液氮用研杵對組織樣本進(jìn)行研磨，隨后用北京金沙生物科技有限公司高效植物基因組DNA 提取試劑盒提取DNA。選用通用引物ITS4、ITS5 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，點(diǎn)樣量為3 μL，電泳電壓為160 V、電流80 mA、電泳時(shí)間20 min。電泳后用紫外線凝膠成像儀觀察、拍照并記錄結(jié)果，產(chǎn)物送生工生物工程（上海） 股份有限公司進(jìn)行測序。

測序結(jié)果經(jīng)過MAFFT 對齊和BioEdit 手動調(diào)整后，以荷葉離褶傘（Lyophyllum decastes） 為外類群，使用軟件RAxML-HPC2 on XSEDE（8.2.12） 以最大似然法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。除試驗(yàn)獲得的序列外，其余序列均來自GenBank。

1.5 生物學(xué)特性分析

將L4550 菌株接種于PDA 培養(yǎng)基中活化，待菌絲長滿平板，用打孔器（直徑0.5 cm） 取邊緣菌絲接種于試驗(yàn)培養(yǎng)基中央，除溫度試驗(yàn)外，其余試驗(yàn)平板均置于22 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置6組重復(fù)。每2 天測量一次菌落直徑，觀察并記錄菌絲生長速度及菌絲疏密度。數(shù)據(jù)結(jié)果采用Excel 2021 和SPSS 27.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.5.1 單因素試驗(yàn)

1） 碳源試驗(yàn)。以不加碳源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對照（CK1），試驗(yàn)組分別加入葡萄糖、麥芽浸粉、蔗糖、果糖、乳糖，形成6 個(gè)不同的碳源處理組。

2） 氮源試驗(yàn)。以不加氮源的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對照（CK2），試驗(yàn)組分別加入蛋白胨、黃豆粉、尿素、酵母粉、硝酸鉀，形成6 個(gè)不同的氮源處理組。

3） 無機(jī)鹽試驗(yàn)。以不加無機(jī)鹽的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為空白對照（CK3），試驗(yàn)組分別加入硫酸鎂、磷酸二氫鉀、硫酸亞鐵、氯化鈣、碳酸鈣，形成6 個(gè)不同的無機(jī)鹽處理組。

4） 生長因子試驗(yàn)。以不加生長因子的基礎(chǔ)培養(yǎng)基作為空白對照（CK4），試驗(yàn)組分別添加0.01 g 的復(fù)合維生素B、維生素C、維生素E、吲哚乙酸、肌醇，形成6 個(gè)不同的生長因子處理組。

5） 溫度試驗(yàn)。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中接入菌種，將接種后的平板置于6 個(gè)不同溫度條件下培養(yǎng)，溫度分別設(shè)置為：16、18、20、22、24、26 ℃。

6） pH 試驗(yàn)。用HCL 溶液（1 mol·L-1）和NaOH溶液（1 mol·L-1） 調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH，使其初始pH 分別為自然、5、6、7、8、9。將菌種接種于6個(gè)初始pH 不同的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.5.2 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，在6 組單因素試驗(yàn)中，選擇對菌絲生長影響較大的4 個(gè)因素，在每個(gè)因素中挑選較優(yōu)的3 個(gè)水平，設(shè)計(jì)因素水平表。

1.6 馴化栽培

1.6.1 母種制備

將保存的L4550 菌株活化，接種于PDA 培養(yǎng)基中，置于22 ℃恒溫培養(yǎng)箱中暗培養(yǎng)備用。

1.6.2 原種制備

原種栽培料于121 ℃滅菌2 h，冷卻后將母種按照1 ∶6（V/V） 的比例接種，接種后置于22 ℃的培養(yǎng)室內(nèi)暗培養(yǎng)。

1.6.3 栽培種制備

按照原種栽培料配方配制栽培料，滅菌冷卻后，將原種按照1 ∶20（V/V） 的比例接種，接種后置于培養(yǎng)室內(nèi)暗培養(yǎng)。

1.6.4 出菇瓶制備

按照原種栽培料配方配制栽培料，拌料裝瓶，滅菌冷卻后，將栽培種按1 ∶20（V/V） 的比例接入栽培瓶中，標(biāo)明菌種號以及接種日期，置于培養(yǎng)室暗培養(yǎng)。

1.6.5 出菇試驗(yàn)

待菌絲長滿栽培瓶且后熟1 周后，根據(jù)劉明廣等[19]的出菇管理方法進(jìn)行搔菌處理，輕輕刮去栽培料表面的老菌皮，將栽培瓶置于溫度為14 ℃、空氣濕度為90%的人工氣候箱內(nèi)，給予一定光照并通風(fēng)，刺激原基分化，待子實(shí)體成熟后采摘。

1.7 營養(yǎng)成分分析

根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中水分的測定》（GB 5009.3-2016）[20]、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中灰分的測定》（GB 5009.4-2016）[21]、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中脂肪的測定》（GB 5009.6-2016）[22]、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測定》（GB 5009.5-2016）[23]、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》（GB 5009.8-2016）[24]、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中膳食纖維的測定》（GB 5009.88-2014）[25]、《食用菌中粗多糖含量的測定》（NY/T 1676-2008）[26]、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸的測定》（GB 5009.124-2016）[27]、《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中多元素的測定》（GB 5009.268-2016）[28]等標(biāo)準(zhǔn)，對采收和市場上購買的斑玉蕈子實(shí)體進(jìn)行營養(yǎng)成分檢測，并對比測定結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 形態(tài)特征

斑玉蕈L4550 的形態(tài)結(jié)構(gòu)特征詳見圖1。

圖1 斑玉蕈L4550 的形態(tài)特征Fig.1 Morphological characteristics of Hypsizygus marmoreus L4550

如圖1 所示，斑玉蕈L4550 子實(shí)體中型；菌蓋圓形，中間微凹，表面光滑無絨毛，橄欖棕色，直徑為2.95～6.74 cm；菌肉白色，厚0.37～0.51 cm；菌褶白色，寬0.31～0.32 mm，較密，直生，不等長，邊緣光滑；菌柄白色至淡褐色，圓柱形，中生，表面光滑，長9.93～14.79 cm，直徑0.62～1.29 cm；孢子印白色。其顯微結(jié)構(gòu)見圖2。

圖2 斑玉蕈L4550 的顯微結(jié)構(gòu)圖Fig.2 Microstructure diagram of Hypsizygus marmoreus L4550

由圖2 顯微結(jié)構(gòu)可知，菌蓋表皮細(xì)胞絲狀，薄壁，呈盤錯交織狀，細(xì)胞大小為（30.1～115.1） μm×（2.4 ～4.6） μm。擔(dān)子大小為（18.7 ～32.0） μm ×（5.2～7.5） μm，平均為22.2 μm×6.6 μm，薄壁，透明；每個(gè)擔(dān)子上有2 或4 個(gè)擔(dān)子梗，擔(dān)子梗長為1.6～3.5 μm，基部寬為0.8～1.6 μm。孢子球形或卵形，大小為[（3.1）3.3～5.0（5.7）] μm×[（2.7）3.0～4.7（4.9）] μm，平均大小為4.2 μm×3.8 μm，Q 值為0.9～1.6。不孕擔(dān)子呈棒狀，薄壁，透明，大小為（13.7～30.4） μm×（1.7～5.5） μm。菌柄細(xì)胞呈絲狀，薄壁，透明，大小為（22.1～166.2） μm×（2.7～7.0）μm。鎖狀聯(lián)合在菌蓋、菌柄和菌褶中較為常見。試驗(yàn)標(biāo)本與上官舟建[29]、林汝楷等[30]對斑玉蕈的描述相似。

2.2 分子鑒定結(jié)果

用于進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析的序列信息見表1，所構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

表1 試驗(yàn)中用于系統(tǒng)發(fā)育分析的序列清單Tab.1 List of sequences used for phylogenetic analysis in trials

圖3 基于ITS 序列構(gòu)建的玉蕈屬系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree of Hypsizygus based on ITS sequence

由圖3 可知，L4550 菌株與Hypsizygus marmoreus OP980886 最接近，序列相似率為99.41%，且2 條序列以100%的支持率聚為一支。另外2 株斑玉蕈Hypsizygus marmoreus MG735351、Hypsizygus marmoreus HQ436116 與L4550 菌株（Hypsizygus marmoreus OQ560339） 也在同一個(gè)系統(tǒng)發(fā)育分支中，且L4550 與2 個(gè)已知斑玉蕈菌株堿基差異率為1%。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定結(jié)果，支持該菌株為斑玉蕈Hypsizygus marmoreus。

2.3 生物學(xué)特性試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

菌絲生長的單因素試驗(yàn)結(jié)果詳見圖4 和圖5，圖中菌絲生長速度均為6 次重復(fù)的平均值。

圖4 不同因素對斑玉蕈菌絲生長的影響Fig.4 Effect of different factors on mycelial growth of Hypsizygus marmoreus

圖5 不同條件下L4550 菌株菌絲生長情況Fig.5 Mycelial growth of strain L4550 under different conditions

由圖4 和圖5 可知，L4550 在5 種碳源上皆可生長，結(jié)合生長速度及菌絲長勢，最優(yōu)碳源為麥芽浸粉，最差為乳糖。L4550 菌絲在含蛋白胨、黃豆粉、酵母粉的培養(yǎng)基中長勢較好，菌絲潔白濃密；其中在酵母粉培養(yǎng)基中菌絲長勢最快，且與其他處理組差異顯著；在尿素培養(yǎng)基中菌絲生長最緩慢，且菌絲稀疏。L4550 菌絲對無機(jī)鹽適應(yīng)性較強(qiáng)，除碳酸鈣外，菌絲對試驗(yàn)所用其他無機(jī)鹽反應(yīng)差異不顯著。與空白對照（CK4） 相比，復(fù)合維生素B、維生素C、維生素E、吲哚乙酸、肌醇對L4550 菌絲生長速度及長勢促進(jìn)作用不明顯。L4550 在不同的溫度條件下菌絲生長有差異，當(dāng)溫度≤24 ℃時(shí)，菌絲生長速度隨溫度升高而加快；當(dāng)溫度達(dá)26 ℃時(shí)，菌絲生長速度減緩。斑玉蕈菌絲在pH 為5～9 的環(huán)境條件下皆可生長，其中菌絲生長最快時(shí)培養(yǎng)基pH 為9。

2.3.2 正交試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇對L4550 菌株影響較大的碳源（麥芽浸粉、蔗糖、果糖）、氮源（酵母粉、黃豆粉、蛋白胨）、溫度（24 ℃、26 ℃、22 ℃）、pH（9、8、自然） 4 個(gè)因素進(jìn)行四因素三水平的正交試驗(yàn)，正交試驗(yàn)表及結(jié)果詳見表2、表3、表4 和圖6。

表2 因素水平表Tab.2 Table of factors and levels

表3 斑玉蕈菌株L4550 正交表及結(jié)果Tab.3 Orthogonal and results table of Hypsizygus marmoreus L4550

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析Tab.4 Analysis of variance of orthogonal test results

圖6 正交試驗(yàn)中L4550 菌株菌絲生長情況Fig.6 Mycelial growth of strain L4550 in orthogonal test

如表3、表4 和圖6 所示，正交試驗(yàn)結(jié)果差異顯著，L4550 菌株菌絲在處理4 的培養(yǎng)基上生長速度最快，且菌絲潔白濃密。因此，L4550 菌株的最佳培養(yǎng)基配方為酵母粉2 g、蔗糖20 g、磷酸二氫鉀0.2 g，瓊脂粉16 g，水1 L，pH 自然，培養(yǎng)溫度為26 ℃。

2.3.3 馴化出菇試驗(yàn)結(jié)果

L4550 菌株在母種培養(yǎng)階段，菌絲潔白濃密，邊緣整齊，氣生菌絲強(qiáng)，10～12 d 長滿平板。在以木屑為主的栽培基質(zhì)中，菌絲呈絨毛狀，生長濃密，22 ℃條件下60～62 d 長滿瓶。馴化出菇試驗(yàn)結(jié)果詳見圖7。

圖7 斑玉蕈菌株L4550 出菇情況Fig.7 Fruiting situation of strain L4550

由圖7 可知，當(dāng)出菇溫度為14 ℃，空氣濕度為90%時(shí)，斑玉蕈原基數(shù)量較大，呈白色針頭狀。隨著原基的生長，其菌蓋逐漸分化，由白色轉(zhuǎn)變成灰棕色，20～22 d 后即可采收子實(shí)體。該菌株子實(shí)體叢生；菌蓋棕色，幼時(shí)菌蓋表面有明顯的大理石斑紋，成熟后大理石斑紋變淡；菌柄灰白色，表面覆有細(xì)絨毛。人工栽培的斑玉蕈子實(shí)體與野生子實(shí)體存在一定差異，與商品斑玉蕈（LT002） 相比，試驗(yàn)馴化的斑玉蕈子實(shí)體菌柄顏色偏白；菌蓋中央斑紋密集，邊緣斑紋不明顯；烘干后子實(shí)體海鮮味濃郁，一般可采二潮菇。

2.4 營養(yǎng)成分分析結(jié)果

將L4550 菌株子實(shí)體中的營養(yǎng)成分與市場上購買的斑玉蕈（LT002）進(jìn)行對比，結(jié)果詳見表5。

表5 營養(yǎng)成分對比數(shù)據(jù)表Tab. 5 Comparison data of nutritional components

由表5 可知，L4550 菌株子實(shí)體中的灰分、蛋白質(zhì)、膳食纖維、食用菌多糖含量明顯高于購買斑玉蕈，而脂肪的含量較低。在氨基酸組成成分中，L4550 各氨基酸含量均明顯高于LT002，其中鮮味氨基酸（谷氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、甘氨酸、酪氨酸） 和苦味氨基酸（亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、酪氨酸、組氨酸、精氨酸） 含量明顯高于LT002。在無機(jī)鹽成分中，L4550 的鉀、鎂、鐵、鋅、錳的含量高于LT002，尤其是鉀離子含量是購買的近2 倍；且L4550 中重金屬砷、汞、鎘含量均低于《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中污染物限量》（GB 2762—2017）[31]要求（鎘限量0.2 mg·kg-1、總汞限量0.2 mg·kg-1、總砷限量0.2 mg·kg-1）。

3 結(jié)論與討論

優(yōu)良的種質(zhì)資源對斑玉蕈工廠化發(fā)展至關(guān)重要，試驗(yàn)通過對采集到的野生斑玉蕈L4550 菌株進(jìn)行生物學(xué)特性及馴化栽培試驗(yàn)，以發(fā)掘其利用潛能。在生物學(xué)特性試驗(yàn)中，L4550 菌株對碳源適應(yīng)性較廣，總體來看，多糖（麥芽糖、蔗糖） 的表現(xiàn)優(yōu)于單糖（葡萄糖、果糖）。一般而言，食用菌對單糖的利用率高于雙糖和多糖，但試驗(yàn)結(jié)果與這一結(jié)論相反。付卓識[32]認(rèn)為這可能是培養(yǎng)基經(jīng)過高溫滅菌后，pH發(fā)生變化導(dǎo)致斑玉蕈菌絲對糖的攝取方式發(fā)生轉(zhuǎn)變。在氮源試驗(yàn)中，添加有機(jī)氮（蛋白胨、酵母粉、黃豆粉） 的培養(yǎng)基中菌絲生長較優(yōu)，這與顏松[33]和圖力古爾等[1]的研究結(jié)果相似。以尿素和硝酸鉀為氮源的試驗(yàn)中，菌絲生長較差。付卓識[32]和郭向華等[34]認(rèn)為，尿素在高壓滅菌時(shí)會釋放大量氨味氣體，導(dǎo)致斑玉蕈菌絲生長異常。該菌株對無機(jī)鹽的利用情況差異較小，最適無機(jī)鹽條件有待進(jìn)一步篩選。L4550 菌株對生長因子的適應(yīng)性差別較小，原因可能是所用的生長因子對L4550 菌株作用不大，也可能是所用的生長因子濃度太低，導(dǎo)致其作用效果不明顯，具體原因有待進(jìn)一步探索。斑玉蕈屬于低溫變溫型食用菌，其對溫度的反應(yīng)與付卓識等[32]的研究結(jié)果相似。高壓滅菌會使培養(yǎng)基的pH 下降，pH試驗(yàn)顯示初始pH 為9 時(shí)，L4550 菌株菌絲生長最快，故L4550 菌絲在中性或偏堿性的培養(yǎng)基中生長狀態(tài)較好。

試驗(yàn)通過人工馴化實(shí)現(xiàn)了野生斑玉蕈L4550 菌株在非自然條件下出菇，在出菇過程中該菌株表現(xiàn)出了菌絲活性強(qiáng)、原基分化量大、出菇早等優(yōu)點(diǎn)，但同時(shí)也存在出菇不整齊的缺點(diǎn)。根據(jù)食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)的方法，對L4550 菌株子實(shí)體進(jìn)行營養(yǎng)成分測定，結(jié)果表明斑玉蕈L4550 是一種營養(yǎng)價(jià)值高且低脂的健康食品。故認(rèn)為試驗(yàn)所馴化的斑玉蕈菌株具有較好的栽培研究價(jià)值，可作為選育斑玉蕈新品種的優(yōu)良材料。