1 株野生元蘑的鑒定、馴化栽培及孢子活性成分分析*

劉姿彤，王延鋒**，馬懷良，魏繼承，張 鵬，張丕奇，戴肖東，馬銀鵬，張秀豐

（1.黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院，黑龍江 牡丹江 157000；2.黑龍江省科學(xué)院微生物研究所，黑龍江 哈爾濱 150010；3.牡丹江師范學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157000；4.黑龍江華騰生物科技有限公司，黑龍江 佳木斯 154400）

元蘑（Sarcomyxa edulis） 又稱亞側(cè)耳、凍蘑、美味扇菇、黃靈菇、黃蘑等，隸屬于蘑菇目（Agaricales） 小菇科（Mycenaceae） 美味扇菇屬（Sarcomayxa）[1]。元蘑細(xì)嫩清香、味道鮮美、營(yíng)養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)、多糖、氨基酸、維生素等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，有強(qiáng)筋健骨、祛風(fēng)活血等功效[2-3]。元蘑多糖有抗腫瘤、抗輻射、提高免疫力等作用，具有很高的藥用價(jià)值[4]。野生元蘑種質(zhì)資源十分豐富，是我國(guó)東北地區(qū)著名的野生食（藥） 用菌。

元蘑人工栽培歷史較短，但隨著市場(chǎng)需求增加，產(chǎn)業(yè)規(guī)模也不斷擴(kuò)大。目前人工栽培元蘑的產(chǎn)量和品質(zhì)均不穩(wěn)定，這與菌種和栽培模式密切相關(guān)?，F(xiàn)階段研究多集中在栽培方面，對(duì)元蘑菌種及種質(zhì)資源的報(bào)道并不多見。通過(guò)對(duì)野生元蘑菌株進(jìn)行鑒定及馴化栽培，并測(cè)定其孢子的活性成分，以期為今后遺傳育種工作及藥用價(jià)值研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌株

野生子實(shí)體于2021 年采自黑龍江省牡丹江市牡丹峰自然保護(hù)區(qū)，地理坐標(biāo)為129°77′E，44°45′N，海拔520 m。采用組織分離法[5]分離菌株，菌株編號(hào)為Y19，菌種保藏于黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院牡丹江分院食用菌研究所。

1.1.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

馬鈴薯綜合培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、KH2PO40.5 g、MgSO40.5 g、瓊脂20 g，加蒸餾水定容至1 000 mL。

1.1.3 其他試劑

Ezup 柱式真菌基因組DNA 提取試驗(yàn)盒、PCR 通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′） 和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′），由生工生物工程（上海） 股份有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 形態(tài)學(xué)鑒定

觀察野生子實(shí)體形態(tài)、顏色等特征并拍照記錄，參照《中國(guó)大型菌物資源圖鑒》[6]進(jìn)行形態(tài)學(xué)初步鑒定。

1.2.2 分子生物學(xué)鑒定

將純化后的菌株Y19 接種于基礎(chǔ)培養(yǎng)基上，于25 °C 恒溫培養(yǎng)，將培養(yǎng)好的菌絲體送生工生物工程（上海） 股份有限公司進(jìn)行ITS 測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分子鑒定[7]。后將已拼接序列在NCBI 中通過(guò)BLAST 檢索比較，以香菇（Lentinula edodes） 為外群，利用MEGA 5.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.3 菌絲培養(yǎng)溫度試驗(yàn)

將菌種接種于馬鈴薯綜合培養(yǎng)基中，分別將培養(yǎng)皿至于10、15、20、25、30 °C 條件下培養(yǎng)，每個(gè)溫度條件設(shè)5 次重復(fù)，觀察和記錄菌絲生長(zhǎng)速度。

1.2.4 最適母種培養(yǎng)基試驗(yàn)

為探究不同培養(yǎng)基對(duì)母種菌絲生長(zhǎng)的影響，試驗(yàn)共設(shè)計(jì)4 組培養(yǎng)基配方，每組配方設(shè)5 次重復(fù)。

1） 配方1：麩皮20 g（水煮后取濾液）、黃豆粉10 g、葡萄糖20 g、KH2PO41 g、MgSO41 g、瓊脂20 g。

2） 配方2：馬鈴薯200 g（水煮后取濾液）、黃豆粉25 g、葡萄糖20 g、KH2PO42 g、MgSO41 g、VB10.1 g、瓊脂20 g。

3） 配方3：木屑40 g（水煮后取濾液）、馬鈴薯200 g（水煮后取濾液）、葡萄糖20 g、蛋白胨0.5 g、瓊脂20 g。

4） 配方4：馬鈴薯200 g（水煮后取濾液）、葡萄糖20 g、KH2PO41 g、MgSO41 g、瓊脂20 g。

根據(jù)以上配方配制培養(yǎng)基后均用蒸餾水定容至1 000 mL。

1.2.5 出菇試驗(yàn)

1） 原種配方：木屑86%、麩皮13%、石膏1%，pH 自然，含水量55%～58%。

2） 栽培種配方：同原種配方。

3） 裝袋及滅菌：選擇新鮮、無(wú)霉變的原料，按栽培種配方稱量原料，拌料裝袋。料袋采用規(guī)格為17 cm×35 cm×0.005 cm 的聚丙烯袋，每袋裝干料500 g。采用高壓滅菌，125 ℃維持3 h。

4） 接種培養(yǎng)：待料袋冷卻至30 ℃以下時(shí)接種。在無(wú)菌環(huán)境中接種后將菌包立即移入養(yǎng)菌室，保持室內(nèi)溫度為22～25 ℃，暗光培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)雜菌污染菌包及時(shí)挑出。

5） 出菇管理：采用棚室墻式出菇模式，出菇期溫度維持在10～20 ℃，空氣相對(duì)濕度為85%～90%。

1.2.6 孢子活性成分測(cè)定

根據(jù)《保健食品功效成分檢測(cè)方法》（2011 版）[8]測(cè)定元蘑孢子粗多糖的含量；依據(jù)《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB 5009.5-2016）[9]測(cè)定元蘑孢子蛋白質(zhì)含量；根據(jù)《保健食品理化及衛(wèi)生指標(biāo)檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》（2020 版）[10]測(cè)定元蘑孢子總?cè)坪浚桓鶕?jù)《食品中氨基酸的測(cè)定》（GB 5009.124-2016）[11]測(cè)定元蘑孢子氨基酸含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生菌株的鑒定結(jié)果

2.1.1 野生菌株的形態(tài)特征

試驗(yàn)采集的野生子實(shí)體形態(tài)特征見圖1，擔(dān)孢子形態(tài)特征見圖2。

圖1 野生子實(shí)體形態(tài)Fig.1 Morphology of wild fruit body

圖2 野生菌株Y19 擔(dān)孢子形態(tài)（標(biāo)尺：10 μm）Fig.2 Basidiospore morphology of wild strain Y19（bars: 10 μm)

由圖1 可知，該菌野生子實(shí)體為層疊狀叢生；無(wú)菌柄；菌蓋直徑6～13 cm，呈扇形，顏色為黃色且不均勻，且有黏液，邊緣平滑。由圖2 可知，擔(dān)孢子臘腸形，光滑，大小為（4.9～5.3） μm×（2.0～2.5） μm。

2.1.2 菌絲體ITS 測(cè)序分析結(jié)果

野生菌株Y19 經(jīng)ITS 序列擴(kuò)增后得到1 個(gè)約700 bp 的片段。將此片段提交至GenBank后獲得登錄號(hào)為KY962438.1，同時(shí)進(jìn)行BLAST 比對(duì)。結(jié)果顯示野生菌株Y19 與元蘑Sarcomyxa edulis（MH747086.1） 的同源性達(dá)99%以上，基于ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹見圖3。

圖3 基于ITS 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequences

由圖3 可知，菌株Y19 與數(shù)據(jù)庫(kù)中多個(gè)元蘑菌株ITS 序列聚為1 個(gè)進(jìn)化枝，結(jié)合子實(shí)體形態(tài)特征和系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，可以判定菌株Y19 為元蘑Sarcomyxa edulis。

2.2 菌絲培養(yǎng)溫度試驗(yàn)結(jié)果

不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響見圖4 和圖5。

圖4 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)速度的影響Fig.4 Effects of different temperature on mycelial growth speed

圖5 接種7 天后不同溫度條件下的菌絲長(zhǎng)勢(shì)Fig.5 Myelial growth at different temperatures after 7 days of inoculation

由圖4 和圖5 可知，菌株Y19 菌絲在10～30 ℃均能生長(zhǎng)，但在不同溫度條件下菌絲長(zhǎng)勢(shì)不同，且生長(zhǎng)速度具有顯著性差異。培養(yǎng)溫度在10～25 ℃，菌絲生長(zhǎng)速度隨溫度上升逐漸加快；25 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)速度最快，菌絲最濃密；溫度高于25 ℃時(shí)，菌絲生長(zhǎng)受到抑制，生長(zhǎng)速度減慢。綜合菌絲生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)，菌株Y19 菌絲的最適培養(yǎng)溫度為25 ℃。

2.3 最適母種培養(yǎng)基試驗(yàn)結(jié)果

不同母種培養(yǎng)基對(duì)Y19 菌株菌絲生長(zhǎng)的影響情況見表1。

表1 不同母種培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響Tab.1 The effect of different stock culture medium on mycelial growth

由表1 可知，菌株Y19 在不同母種培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)速度有顯著性差異，在配方3 中菌絲生長(zhǎng)速度最快，達(dá)6.31 mm·d-1。在配方1 和配方3 中菌絲長(zhǎng)勢(shì)強(qiáng)，在配方2 和配方4 中菌絲長(zhǎng)勢(shì)一般。綜合菌絲生長(zhǎng)速度和長(zhǎng)勢(shì)，配方3 為最適母種培養(yǎng)基。

2.4 栽培出菇

2.4.1 菌株Y19 菌絲體形態(tài)

菌株Y19 的菌絲體形態(tài)特征詳見圖6。

圖6 菌株Y19 菌絲體形態(tài)Fig.6 Mycelial morphology of strain Y19

由圖6 可知，菌株Y19 菌絲體濃密，菌落邊緣整齊，氣生菌絲發(fā)達(dá)，無(wú)革質(zhì)狀菌落，菌落色素不明顯。

2.4.2 菌株Y19 栽培出菇

元蘑菌株Y19 共制作120 個(gè)栽培袋，從接種至菌絲長(zhǎng)滿栽培袋約21 d，栽培袋長(zhǎng)滿后移至出菇棚內(nèi)避光后熟培養(yǎng)。從接種至原基形成共150 d，菇蕾較少。子實(shí)體形態(tài)特征詳見圖7。

圖7 人工栽培菌株Y19 的子實(shí)體形態(tài)Fig.7 Fruit body morphology of cultivated strain Y19

由圖7 可知，元蘑菌株Y19 菌蓋平展后中等偏大，菌蓋扇形呈不均勻黃色，邊緣平滑，子實(shí)體數(shù)量少，栽培子實(shí)體性狀與野生元蘑基本一致，一潮菇鮮品的袋平均產(chǎn)量為187.76 g。

2.5 菌株Y19 孢子活性成分分析結(jié)果

菌株Y19 孢子活性成分測(cè)定結(jié)果詳見表2。

表2 菌株Y19 孢子活性成分Tab.2 Active ingredient in spore of strain Y19

由表2 可知，孢子中含粗多糖8.91 g·100-1·g-1，比報(bào)道中未破壁靈芝孢子粉（粗多糖含量1.94～3.39 g·100-1·g-1）[12]高；蛋白質(zhì)含量為35.0 g·100-1·g-1，比子實(shí)體中（蛋白質(zhì)含量32.91 g·100-1·g-1）[13]高；總?cè)坪繛?.51 g·100-1·g-1，比未破壁靈芝孢子粉（總?cè)坪?4.24～93.12 μg·g-1）[14]高；氨基酸總量為32.4 g·100-1·g-1，比未破壁靈芝孢子粉（氨基酸總量6.07 g·100-1·g-1）[15]高。

3 結(jié)論與討論

種質(zhì)資源是食用菌育種工作的基礎(chǔ)，是食用菌優(yōu)良性狀的基因庫(kù)，食用菌野生種質(zhì)資源的采集和鑒定是食用菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的基礎(chǔ)性研究工作[16]。對(duì)采集到的野生子實(shí)體進(jìn)行形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)鑒定，確定其為元蘑。通過(guò)對(duì)菌絲體進(jìn)行不同溫度下的培養(yǎng)試驗(yàn)，明確了元蘑菌株Y19 菌絲的最佳培養(yǎng)溫度為25 ℃。進(jìn)一步篩選出最適合元蘑菌株Y19 生長(zhǎng)的母種培養(yǎng)基配方為木屑40 g（水煮后取濾液）、馬鈴薯200 g（水煮后取濾液）、葡萄糖20 g、蛋白胨0.5 g、瓊脂20 g。人工馴化栽培的元蘑菌株Y19子實(shí)體形態(tài)與野生菌株基本一致。目前廣泛使用的元蘑栽培種大多來(lái)自于野生種馴化，但主栽品種更新速度慢，退化現(xiàn)象嚴(yán)重。野生元蘑菌株Y19 的馴化成功，為下一步育種工作奠定了基礎(chǔ)。

食用菌孢子中含有多種活性成分，如多糖、三萜、蛋白質(zhì)、氨基酸等，具有抗腫瘤、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用[17]。元蘑子實(shí)體成熟時(shí)會(huì)集中散發(fā)大量孢子，對(duì)收集的孢子進(jìn)行活性成分測(cè)定，結(jié)果表明元蘑菌株Y19 的子實(shí)體孢子中所含的粗多糖、總?cè)坪桶被岷烤哂谖雌票陟`芝孢子粉，孢子中蛋白質(zhì)含量也比已報(bào)道的子實(shí)體中蛋白質(zhì)含量高，表明元蘑孢子具有很高的藥用價(jià)值。試驗(yàn)結(jié)果為進(jìn)一步研究元蘑孢子的藥理作用機(jī)制提供了理論依據(jù)。