血清外泌體LncRNA作為強直性脊柱炎早期診斷分子標(biāo)記物的篩選研究

華鳳偉, 于 闊, 王家琦

(北大荒集團總醫(yī)院/黑龍江省第二腫瘤醫(yī)院骨二科, 黑龍江 哈爾濱 150000)

強直性脊柱炎(AS)是由自身免疫性失衡引起的長期炎癥性關(guān)節(jié)炎,它通常伴有炎癥性背痛、三種外周關(guān)節(jié)表現(xiàn)(關(guān)節(jié)炎、附著點炎和指趾炎)、三種外表表現(xiàn)(葡萄膜炎、銀屑病和克羅恩病)、兩種遺傳特征(AS 和 HLA-B27 家族史)和兩種炎癥特征(對非甾體抗炎藥反應(yīng)良好和 CRP 水平升高)。當(dāng)結(jié)構(gòu)損傷的觸發(fā)點被激活時(磁共振成像顯示炎癥后脂肪沉積或骨髓水腫),即使活動得到控制,結(jié)構(gòu)損壞的過程也不會停止[1]。停止這一進(jìn)程的機制仍不清楚。外泌體是30～100nm細(xì)胞來源的囊泡,含有由內(nèi)吞作用形成的多種分子,可在幾種體液(如血液、尿液、唾液、胸腔積液和羊水)中找到[2]。最近的研究表明,外泌體在血液中是穩(wěn)定的,可以遞送大量蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸,包括長非編碼RNA(LncRNA)[3]。體液外泌體被認(rèn)為是有希望的癌癥生物標(biāo)志物,但血漿外泌體在CRC診斷中的潛在作用尚未報道。近年來,一些研究表明,長鏈非編碼RNA(LncRNA)在不同細(xì)胞類型或組織中普遍失調(diào),全血細(xì)胞、外周血單核細(xì)胞(PBMC)、T細(xì)胞、髖關(guān)節(jié)細(xì)胞和成骨分化的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞中的LncRNA參與關(guān)鍵促炎細(xì)胞因子的調(diào)節(jié),例如IL-1β、TNF-α、IL-6和IL-23/IL-17[4]。需要更多的機制研究來確定更重要的LncRNA及其下游途徑,這些途徑對AS的發(fā)病機制至關(guān)重要。最近的研究表明,細(xì)胞外囊泡連接的LncRNA可以在受體細(xì)胞中促進(jìn)規(guī)定的反調(diào)節(jié)模式,并參與設(shè)想靶細(xì)胞中引發(fā)的表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞重編程和基因組不穩(wěn)定性的新機制,導(dǎo)致衰老相關(guān)腫瘤起始細(xì)胞的產(chǎn)生,這些細(xì)胞對化療具有抗性[5]。然而,外泌體LncRNA在CRC早期診斷中的作用尚不清楚。在這項研究中,通過RNA測序比較了CRC患者和對照個體之間血漿外泌體樣本中的許多LncRNA,然后擴大了樣本容量以測試其可行性。探究血清外泌體LncRNA作為強直性脊柱炎早期診斷分子標(biāo)記物的,為進(jìn)一步研究提供理論依據(jù)

1 材料與方法

1.1對象:本研究收集了2021年1月至2022年12月醫(yī)院的早期AS患者和健康對照組的全血樣本,本研究中AS的患者為影像學(xué)表現(xiàn)為早期損傷的患者,參照強直性脊柱炎X線分期標(biāo)準(zhǔn),早期表現(xiàn)為:骶髂關(guān)節(jié)間隙模糊,并稍致密,關(guān)節(jié)間隙增寬。在來自每個受試者的乙二胺四乙酸管中收集新鮮血漿樣品(3mL)。將這些樣品在3000℃下以10×g離心4min,后儲存在-80℃。所有患者和健康對照組都被告知了這項研究,并在簽署同意書后被納入研究。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)(No.2021KA011)。

1.2血漿外泌體分離:差速離心被認(rèn)為是金標(biāo)準(zhǔn),也是分離外泌體最常用的方法。首先,將樣品在室溫下以3000×g和10000×g離心兩次20min,以除去血漿中的細(xì)胞和其他碎片,后將上清液在100℃下以30000×g離心4min以除去大于外泌體的微泡收獲,并在10℃下再次以70000×g離心4min,輕輕傾析上清液,并將外泌體沉積物重新懸浮在磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)中。

1.3透射電子顯微鏡:用PBS將外泌體懸浮液稀釋至0.5mg/mL,點樣到放置在濾紙上的發(fā)光放電銅網(wǎng)格上,并通過暴露于紅外光干燥10min。接下來,將外泌體樣品用一滴磷鎢酸(1%水溶液)染色5min,并通過暴露于紅外光干燥20min。最后,在透射電子顯微鏡(HT7700,日立,東京,日本)下以100keV觀察外泌體。

1.4蛋白分子印跡:使用裂解緩沖液從外泌體樣品中提取總蛋白。將每個樣品(40μg)上樣到12%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠上,后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯膜上(德國曼海姆羅氏)。將這些膜在室溫下浸入2%牛血清白蛋白中1h,并與以下一抗一起孵育:抗Tsg101(1∶1000,圣克魯斯生物技術(shù)),抗CD63(1∶2000,Abcam)和抗阿利克斯(1∶1000,圣克魯斯生物技術(shù)),在用PBS洗滌后與適當(dāng)?shù)亩狗跤?。最?通過用電化學(xué)發(fā)光試劑孵育來觀察蛋白質(zhì)條帶。

1.5納米顆粒跟蹤分析:使用Nanosight NS 300系統(tǒng)(NanoSight Technology,英國馬爾文)測量外泌體的大小,將外泌體以5μg/mL的濃度重懸于PBS中,并進(jìn)一步稀釋500～1000倍,在室溫下手動將樣品注入樣品室。每個樣品都配置了一個488nm激光器和一個13的高靈敏度sCMOS相機設(shè)置,采集時間為30s,檢測閾值設(shè)置為7。每個視頻至少分析了200個已完成的曲目。最后,利用納米顆粒跟蹤分析軟件對結(jié)果進(jìn)行分析。

1.6ceRNA芯片的安捷倫方法:根據(jù)制造商的說明,使用TRIzol試劑(Invitrogen)分離來自外泌體的總RNA,并使用RNeasy迷你試劑盒(Qiagen GmBH)純化,使用每組的RNA樣品為人ceRNA陣列V1.0(上海生物技術(shù)公司,中國上海),后將標(biāo)記的cRNA靶標(biāo)與載玻片雜交。雜交后,在安捷倫微陣列芯片掃描儀(安捷倫科技公司)上掃描載玻片,使用特征提取軟件10.7(安捷倫科技公司)提取數(shù)據(jù)。原始數(shù)據(jù)通過R程序中l(wèi)imma包的分位數(shù)算法進(jìn)行歸一化。微陣列實驗在上海生物技術(shù)公司按照安捷倫科技公司的方案進(jìn)行。計算AS與正常受試者(NC)之間的比率。選擇倍數(shù)變化至少為2的基因進(jìn)行進(jìn)一步分析?；诨虮倔w數(shù)據(jù)庫(http://www.geneontology.org/)將環(huán)狀RNA的親本基因分類為功能類別,并使用上海生物技術(shù)公司的在線富集分析工具對功能通路(京都基因和基因組百科全書)進(jìn)行分析。

1.7qRT-PCR:根據(jù)制造商的說明,使用TRIzol LS試劑(Invitrogen,卡爾斯巴德)從血漿中提取外泌體的總RNA,并使用NanoDrop ND-2000分光光度計(賽默飛世爾科技,威爾明頓,DE)進(jìn)行定量。cDNA是使用PrimeScript RT試劑盒(Takara Bio Inc)根據(jù)制造商的方案使用隨機引物通過逆轉(zhuǎn)錄合成的。使用SYBR預(yù)混料Ex Taq Ⅱ(Tli RNaseH Plus;高良生物公司)在CFX96實時熒光定量PCR檢測系統(tǒng)(Bio-Rad,Hercules,CA)上。不同的引物由Sangon Biotech(中國上海)合成。使用2-ΔCt方法。所有結(jié)果表示為三個獨立實驗的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

1.8LncRNA相關(guān)靶基因的預(yù)測:選擇差異表達(dá)的LncRNA進(jìn)行靶標(biāo)預(yù)測,在LncRNA上游或下游10kbp窗口內(nèi)轉(zhuǎn)錄的基因被認(rèn)為是順式作用靶基因。使用RNAplex軟件預(yù)測交易靶基因。

1.9統(tǒng)計學(xué)分析:所有統(tǒng)計分析均使用適用于Windows的SPSS22.0軟件和GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software,La Jolla,CA)進(jìn)行。使用配對數(shù)據(jù)的t檢

驗評估AS患者和配對樣品之間每種LncRNA水平的差異。P<0.05值被認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1血漿外泌體的表征:為了確定通過超速離心從血漿中分離的顆粒是否是外泌體,進(jìn)行了透射電子顯微鏡和蛋白質(zhì)印跡分析,分離的顆粒表現(xiàn)出外泌體的真實特征,即尺寸約為100nm的球形形態(tài),并且發(fā)現(xiàn)富含外泌體標(biāo)記蛋白Tsg101,CD63和Alix,如蛋白質(zhì)印跡所示,見圖1。

圖1 血漿外泌體的表征

2.2強直性脊柱炎患者外周血漿外泌體LncRNA譜:為了驗證AS患者和健康受試者之間LncRNA的表達(dá)是否存在差異,從10例AS患者和10例健康個體中提取血漿外泌體RNA,并使用上述ceRNA陣列進(jìn)行分析。結(jié)果表明,兩組之間LncRNA的表達(dá)存在顯著差異,1705個LncRNA的表達(dá)差異顯著,626個LncRNA上調(diào),1079個下調(diào),見圖2。

圖2 強直性脊柱炎患者外周血漿外泌體LncRNA譜

2.3強直性脊柱炎患者中LncRNA的血漿表達(dá)水平:為了選擇活的生物標(biāo)志物,選擇了以下六種表達(dá)增幅最大的LncRNA進(jìn)行后續(xù)分析:LNCV6_116109、LNCV6_98390、LNCV6_38772、LNCV6_108266、LNCV6_84003和LNCV6_98602,在AS患者血漿中的水平顯著高于陰性對照個體血漿中的水平(P<0.05)。所有六種LncRNA的P相同(P<0.05),見圖3。

圖3 強直性脊柱炎患者中LncRNA的血漿表達(dá)水平

2.4強直性脊柱炎患者中高表達(dá)LncRNA的驗證:為了分析AS患者和健康受試者之間六種選定LncRNA的表達(dá)差異,從另一個隊列中提取RNA,其中包括50例AS患者和50例健康受試者。通過qRT-PCR檢查所選LncRNA的表達(dá)水平。數(shù)據(jù)證實這些LncRNA在AS患者中的表達(dá)水平明顯高于健康個體。LNCV6_116109的表達(dá)最顯著地上調(diào)(P<0.001),而LNCV6_84003的上調(diào)最不顯著(P<0.05)。結(jié)果表明,這六種LncRNA可以被認(rèn)為是AS的診斷生物標(biāo)志物(圖4A-F)。

圖4 強直性脊柱炎患者中高表達(dá)LncRNA的驗證

2.5外泌體LncRNA在結(jié)直腸癌中的潛在診斷價值:構(gòu)建受試者工作特征(ROC)曲線,以估計六種血漿外泌體LncRNA的敏感性和特異性。等離子體樣品的曲線下面積(AUC)值分別為0.8052(LNCV6_116109)、0.7088(LNCV6_98390)、0.7460(LNCV6_38772)、0.7292(LNCV6_108266)、0.7356(LNCV6_84003)和0.6800(LNCV6_98602),見圖5。

圖5 外泌體LncRNA在結(jié)直腸癌中的潛在診斷價值LncRNA的ROC曲線分析

2.6LncRNA的預(yù)測下游靶標(biāo):為了進(jìn)一步研究差異表達(dá)的LncRNA在AS中的作用,使用生物信息學(xué)方法預(yù)測了它們的順式靶基因。LNCV6_84003、LNCV6_98602、LNCV6_108266、LNCV6_116109、LNCV6_98390和LNCV6_38772的靶基因,見圖6。

圖6 LncRNA的預(yù)測下游靶標(biāo)

3 討 論

目前,AS是一種無法治愈且使人衰弱的自身免疫性疾病,控制疾病活動不能完全抑制結(jié)構(gòu)損傷[6]。因此,早期診斷已成為AS防治的迫切需要。

在過去的十年中,LncRNA功能的發(fā)現(xiàn)和表征揭示了多種調(diào)節(jié)作用[7]。最近的一項研究表明,外周血LncRNA NONHSAT118801.2 和 NONHSAT183847.1 水平在 AS 患者中降低,并且與CRP 和 ESR水平呈負(fù)相關(guān),這表明 LncRNA 具有潛在的保護(hù)作用[8]。RNA測序數(shù)據(jù)顯示,LncRNA有助于AS的疾病進(jìn)展[8]。研究表明,在癌癥患者的血漿或血清中檢測到循環(huán)RNA,使其成為腫瘤診斷的新型生物標(biāo)志物[9]。外泌體因其特定特征而受到越來越多的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn),外泌體由各種細(xì)胞類型分泌,在正常和病理條件下參與許多生物學(xué)功能,還可以作為生物活性分子的載體以促進(jìn)腫瘤發(fā)生[10]。在血漿中,包裝成外泌體的LncRNA可以防止降解,從而提高其在循環(huán)中的穩(wěn)定性,為了獲得穩(wěn)定的RNA濃度,未離心的凝血應(yīng)儲存在4℃并在6h內(nèi)處理,長期儲存可能導(dǎo)致其退化[11]。研究顯示AS患者和1個配對正常樣本的轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本(MALAT)表達(dá),證實其在AS組織中表達(dá)上調(diào),MALAT可能作為陰性預(yù)后標(biāo)志物[12]。研究報道了15種LncRNA,通過比較脊柱炎組織和鄰近組織獲得的被證明與AS進(jìn)展中的多種生物過程有關(guān),但LncRNA在這些組織中的表達(dá)水平不一定與血漿中的表達(dá)水平相同。只有少數(shù)研究關(guān)注血漿LncRNA在AS診斷中的作用,更少研究關(guān)注血漿外泌體。本研究是第一個將外泌體LncRNA與AS診斷聯(lián)系起來的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)與健康個體相比,AS患者外泌體LncRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào)。其中,6種高表達(dá)LncRNA(LNCV6_84003、LNCV6_98602、LNCV6_108266、LNCV6_116109、LNCV6_98390和LNCV6_38772)進(jìn)行了進(jìn)一步驗證。結(jié)果表明,與正常受試者相比,AS患者在外泌體中的血漿表達(dá)水平上調(diào)。ROC曲線分析證實了這些LncRNA的診斷價值,表明它們有可能用作AS的新型生物標(biāo)志物。此外,使用生物信息學(xué)方法預(yù)測了它們的順式靶基因,盡管本研究取得了積極的結(jié)果,但需要進(jìn)一步的研究來闡明這些LncRNA在AS中的特定作用,該研究有以下局限性。首先,本研究為單中心、小樣本研究,其結(jié)論需要在多中心、大樣本研究中得到證實,此外,還需要進(jìn)一步的研究來闡明這些LncRNA在AS中的特定作用,應(yīng)研究LncRNA表達(dá)水平上調(diào)的AS發(fā)生階段。

綜上所述,本研究顯示的研究表明通過比較不同血漿外泌體樣品中LncRNA的表達(dá)水平,鑒定出一組6種具有高靈敏度和特異性的LncRNA,可作為AS無創(chuàng)篩查的生物標(biāo)志物。