miR-190和ANXA11對(duì)直腸癌新輔助放化療效用評(píng)估價(jià)值及相關(guān)性分析

徐 鈺, 胡錫池, 趙于天

(1.江南大學(xué)附屬醫(yī)院腹部放療科, 江蘇 無(wú)錫 214122 2.江蘇省無(wú)錫市第二人民醫(yī)院檢驗(yàn)科, 江蘇 無(wú)錫 214002)

直腸癌是起源于直腸內(nèi)皮細(xì)胞的惡性變異,通常發(fā)生在直腸的末段,發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而增加[1]。臨床研究顯示,直腸癌早期癥狀不顯著,臨床癥狀以腹痛、便秘、排便習(xí)慣改變等為主,因此多數(shù)患者就診時(shí)已處于疾病中晚期[2]。目前臨床對(duì)直腸癌治療仍以手術(shù)為主,而單純手術(shù)治療無(wú)法阻止腫瘤體積增長(zhǎng)及復(fù)發(fā),術(shù)前新輔助化療(neo-adjuvant chemotherapy,NAC)作為術(shù)前或術(shù)后減少腫瘤體積或預(yù)防復(fù)發(fā)的有效治療手段,可通過(guò)病理切片結(jié)果評(píng)估臨床效用,但其花費(fèi)較高、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng),為臨床療效評(píng)估帶來(lái)不便[3-4]。微小核苷酸(micronucleotide,miR)作為與原癌基因激活有密切聯(lián)系的一類(lèi)因子,其中miR-190長(zhǎng)期穩(wěn)定存在于機(jī)體中,并參與乳腺癌、結(jié)直腸癌等疾病發(fā)展過(guò)程[5]。膜聯(lián)蛋白A11(annexins A11,ANXA11)作為膜聯(lián)蛋白家族中的一員,其在胃癌中的表達(dá)意義已被臨床多數(shù)研究證[6]。但miR-190和ANXA11在直腸癌中的研究仍較少,基于此,本研究通過(guò)分析miR-190、ANXA11在直腸癌患者NAC治療后水平變化及對(duì)療效評(píng)估價(jià)值,為尋找評(píng)估直腸癌療效的有效腫瘤標(biāo)志物提供參考依據(jù),同時(shí)為探明直腸癌發(fā)病機(jī)制提供潛在思路研究。

1 資料與方法

1.1一般資料:以2019年6月至2022年8月在我院確診并接受治療的148例直腸癌患者作為研究對(duì)象,并納入直腸癌組,另選取同時(shí)期150例健康人作為對(duì)照組,其中直腸癌組共包含男性71例,女性77例,年齡42～69歲,平均年齡(55.71±8.06)歲,體質(zhì)量指數(shù)(Body mass index,BMI)為20～27(23.57±1.90)kg/m2,TNM分期Ⅰ期21例,Ⅱ期64例,Ⅲ期63例,腫瘤直徑為3.1～7.3(4.87±1.21)cm,腫瘤下緣距肛緣距離為2.1～8.5(5.28±1.73)cm;對(duì)照組包含男性78例,女性72例,年齡40～71歲,平均年齡(54.76±8.89)歲,BMI為20～27(23.76±2.02)kg/m2,兩組受試者在年齡、性別、BMI等基線(xiàn)資料方面對(duì)比無(wú)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,具有可比性(P>0.05),本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)審批進(jìn)行,所有受試者均知情并簽署知情同意書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn):①直腸癌患者符合《直腸癌規(guī)范化診療指南》[7]中相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn);②直腸癌患者近半年無(wú)應(yīng)用免疫抑制類(lèi)或腎上腺皮質(zhì)激素類(lèi)藥物;③預(yù)計(jì)生存期>6個(gè)月;④臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn):①合并嚴(yán)重糖尿病;②伴有免疫功能障礙;③對(duì)本研究化療藥物具有過(guò)敏史者;④合并其他腫瘤疾病;⑤合并精神系統(tǒng)疾病;⑥合并心臟病并發(fā)癥。

1.2方 法

1.2.1NAC方法:所有患者在術(shù)前均接受相同的NAC治療,放療前醫(yī)生通過(guò)病史、體格檢查、腸鏡檢查、組織活檢等來(lái)確定直腸癌的類(lèi)型、分期和位置,根據(jù)患者具體情況制定放化療計(jì)劃,放療之前,需通過(guò)CT掃描等影像學(xué)檢查來(lái)確保準(zhǔn)確定位目標(biāo)區(qū)域,直腸腫瘤放療劑量設(shè)置為50Gy/25Fr,對(duì)于腫瘤增至盆腔患者放療劑量調(diào)整至45Gy/25Fr,每周連續(xù)治療5d,共治療5周,在放療過(guò)程中,醫(yī)生會(huì)定期監(jiān)測(cè)患者的治療反應(yīng)和副作用,根據(jù)患者的具體情況,可能需要進(jìn)行調(diào)整治療計(jì)劃或提供支持性治療以減輕副作用和提高治療效果;放療期間同步口服卡培他濱(廠家:上海羅氏制藥有限公司,批號(hào):國(guó)藥準(zhǔn)字H20073023)825mg/m2,2次/d,連續(xù)服用5周,休息6～8周后行直腸癌腫瘤切除術(shù)。術(shù)后隨訪6個(gè)月觀察臨床療效。

1.2.2miR-190、ANXA11檢測(cè):細(xì)胞系總RNA經(jīng)紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度后反轉(zhuǎn)錄為cDNA,用ABI StepOnePlus系統(tǒng)進(jìn)行RT-PCR分析。應(yīng)用擴(kuò)增催化反應(yīng)原料環(huán)境耐熱條件:95℃以后低溫預(yù)變性5min循環(huán)1次,95℃后高溫預(yù)變性30s,60℃退火30s,7℃延伸30s,共一個(gè)周期循環(huán)40次,采用凝膠成像儀獲取Ct值,其變化以ΔCt表示。miR-190上游5’-GGTCTTTGATGATGATTCTGG-3’,下游5’-CTAGGCACAGTATTGAAGGTT-3’;ANX A11上游5’-TGGCAGTTTTCAACGAGTATCAGA-3’,下游5’-ATATCGTGGTACAGTGACTTG-3’;U6作為內(nèi)部對(duì)照,上游5’-GCGCGTCGTGAAGCGTTC-3’,下游5’-GTGCAGGGTCCGAGGT-3’。用2-ΔΔCT法計(jì)算miR-190、ANXA11相對(duì)基因表達(dá)量。

1.2.3療效評(píng)估標(biāo)準(zhǔn):以腫瘤消退分級(jí)(Tumor regression grading,TRG)[8]指南作為病理評(píng)估標(biāo)準(zhǔn),術(shù)后由兩名病理科醫(yī)生對(duì)病理切片進(jìn)行TRG分級(jí),其中光鏡檢查下無(wú)可見(jiàn)殘留腫瘤細(xì)胞視為T(mén)RG1級(jí);光鏡下顯示有少量腫瘤細(xì)胞殘留,且大部分組織呈纖維化,為T(mén)RG2級(jí);光鏡下可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞且纖維化組織超過(guò)50%,視為T(mén)RG3級(jí);光鏡下有較多腫瘤細(xì)胞殘留,且纖維化組織少于50%,視為T(mén)RG4級(jí)。光鏡下腫瘤細(xì)胞無(wú)明顯消退,且不可見(jiàn)纖維化,視為T(mén)RG5級(jí)。將TRG1～3級(jí)納入療效優(yōu)良組(n=89),TRG4～5級(jí)納入療效較差組(n=59)。

2 結(jié) 果

2.1直腸癌組與對(duì)照組血清miR-190、ANXA11 mRNA表達(dá)對(duì)比:直腸癌組患者血清miR-190顯著低于對(duì)照組,但ANXA11 mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組(均P<0.05),詳見(jiàn)圖1。

圖1 對(duì)比直腸癌組與對(duì)照組患者血清miR-190、ANXA11 mRNA表達(dá)

2.2療效優(yōu)良組與療效較差組血清miR-190、ANXA11 mRNA表達(dá)對(duì)比:療效優(yōu)良組患者血清miR-190顯著高于療效較差組,但ANXA11 mRNA表達(dá)顯著低于療效較差組(均P<0.05),詳見(jiàn)圖2。

圖2 對(duì)比療效優(yōu)良組與療效較差組患者血清miR-190、ANXA11 mRNA表達(dá)

2.3血清miR-190、ANXA11 mRNA表達(dá)與NAC療效關(guān)系:經(jīng)Spearman相關(guān)性分析顯示,miR-190表達(dá)與NAC療效呈顯著正相關(guān)(r=0.602,P<0.001),而ANXA11 mRNA表達(dá)與NAC療效呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.631,P<0.001)。

2.4血清miR-190、ANXA11 mRNA表達(dá)高低對(duì)NAC療效影響:以直腸癌患者miR-190、ANXA11 mRNA表達(dá)平均數(shù)作為分界值,高于miR-190、ANXA11 mRNA表達(dá)平均數(shù)的分別納入miR-190高表達(dá)組、ANXA11 mRNA高表達(dá)組;低于miR-190、ANXA11 mRNA表達(dá)平均數(shù)的分別納入miR-190低表達(dá)組、ANXA11 mRNA低表達(dá)組,經(jīng)Kaplan-meier生存曲線(xiàn)觀察顯示,相比于miR-190低表達(dá)組,miR-190高表達(dá)組患者NAC療效優(yōu)良率顯著升高(χ2=39.120,P<0.001);相比于ANXA11 mRNA高表達(dá)組,ANXA11 mRNA低表達(dá)組患者NAC療效優(yōu)良率顯著升高(χ2=8.772,P=0.003),詳見(jiàn)圖3、圖4。

圖3 血清miR-190表達(dá)高低對(duì)NAC療效影響

圖4 血清ANXA11 mRNA表達(dá)高低對(duì)NAC療效影響

2.5miR-190、ANXA11 mRNA單一及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)NAC臨床效用評(píng)估價(jià)值:ROC結(jié)果顯示,miR-190、ANXA11聯(lián)合檢測(cè)的曲線(xiàn)下面積(area under curve,AUC)敏感度及特異度顯著高于單一檢測(cè)(P<0.05),詳見(jiàn)表1、圖5。

表1 miR-190 ANXA11單一及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)NAC臨床效用預(yù)測(cè)效能

圖5 miR-190、ANXA11單一及聯(lián)合檢測(cè)對(duì)NAC臨床效用預(yù)測(cè)效能圖

3 討 論

目前臨床中對(duì)于直腸癌的病因尚不明確,經(jīng)不斷研究顯示,直腸癌的病因可在遺傳、環(huán)境、飲食、生活習(xí)慣等多種因素共同作用下發(fā)病[9-10]?，F(xiàn)階段對(duì)于直腸癌的治療主要采取個(gè)體化綜合治療的原則,根據(jù)患者不同身體狀態(tài)、腫瘤病理類(lèi)型、腫瘤分期,有計(jì)劃的采取不同治療手段,其中手術(shù)作為直腸癌治療的主要方式,對(duì)于早期直腸癌患者可以達(dá)到根治目的,對(duì)于中晚期直腸癌患者,通過(guò)輔以放化療的綜合療法能夠有效提高治愈率[11]。NAC作為直腸癌手術(shù)前用于阻止癌細(xì)胞生長(zhǎng),從而縮小腫瘤體積或降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的一種綜合放化療手段,其療效結(jié)果與患者預(yù)后生存期之間具有重要聯(lián)系[12]。

本研究結(jié)果顯示,對(duì)照組miR-190表達(dá)顯著高于直腸癌組,同時(shí)療效優(yōu)良組患者的miR-190表達(dá)也顯著高于療效較差組,對(duì)其內(nèi)在機(jī)制分析表示,miR-190作為高等動(dòng)物體內(nèi)具有高度保守性的一項(xiàng)miRNA,其在腫瘤組織中常呈低表達(dá),與Sun G[12]等學(xué)者研究一致,在該學(xué)者的研究中發(fā)現(xiàn)miR-190表達(dá)上調(diào)與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial mesenchymal transition,EMT)具有密切聯(lián)系,分析原因如下:隨著miR-190表達(dá)上調(diào),其可通過(guò)抑制血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)的表達(dá)水平,進(jìn)而阻止腫瘤表面血管新生,發(fā)揮減緩腫瘤進(jìn)展作用;而隨著miR-190水平的降低,其無(wú)法有效抑制VEGF對(duì)腫瘤血管新生的促進(jìn)作用,從而造成直腸癌的進(jìn)一步發(fā)展,此外,本研究相關(guān)性結(jié)果也同樣對(duì)該結(jié)論進(jìn)行證實(shí),相關(guān)性分析miR-190與NAC療效呈顯著正相關(guān),即miR-190表達(dá)越高,則患者NAC療效越好,分析機(jī)制為NAC中放療可對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生直接殺傷作用,另外利用卡西他濱能夠通過(guò)介導(dǎo)免疫調(diào)節(jié)點(diǎn)從而發(fā)揮抗腫瘤效應(yīng),降低腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲,從而達(dá)到較高的臨床療效[13]。此外,miR-190在癌細(xì)胞中上調(diào)能夠介導(dǎo)凋亡相關(guān)基因及細(xì)胞周期抑制因子P21的表達(dá),從而促進(jìn)細(xì)胞周期的進(jìn)行并減少正常細(xì)胞凋亡速度[14]。提示臨床對(duì)于miR-190高表達(dá)組患者而言,其在應(yīng)用NAC治療后的臨床療效優(yōu)良率顯著高于miR-190低表達(dá)組。

ANXA11作為編碼基因位于人類(lèi)染色體Xq28區(qū)域的一種膜結(jié)合蛋白,其主要通過(guò)與細(xì)胞膜相互作用,從而參與細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)及調(diào)節(jié),目前臨床中對(duì)于ANXA11的具體功能和機(jī)制研究尚未完全闡明,部分研究表示,其可在細(xì)胞凋亡、增殖及遷移等過(guò)程中發(fā)揮重要參與作用[15]。而本研究同樣也顯示,ANXA11在直腸癌患者及療效較差組患者中的表達(dá)顯著升高。分析其相關(guān)機(jī)制主要為:ANXA11與FPR2結(jié)合對(duì)于維持正常成纖維細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)具有重要作用,且其可與介導(dǎo)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞相互作用的黏附分子發(fā)生相互作用,從而抑制白細(xì)胞遷移到炎癥部位發(fā)揮作用,ANXA11在直腸癌中作用是可通過(guò)參與磷酸化過(guò)程從而促進(jìn)直腸癌的發(fā)生發(fā)展,其與NAC臨床療效之間呈負(fù)相關(guān)也能夠證實(shí)以上結(jié)論,說(shuō)明ANXA11表達(dá)越低,則直腸癌患者NAC療效越好[16]。另外經(jīng)Kaplan-meier分析顯示ANXA11低表達(dá)患者的NAC療效優(yōu)良率顯著高于ANXA11高表達(dá)組,同樣能夠說(shuō)明ANXA11可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、遷移過(guò)程從而介導(dǎo)直腸癌進(jìn)展。

由于miR-190、ANXA11在直腸癌及不同NAC療效患者中均具有特異性表達(dá)水平,因此本研究通過(guò)繪制ROC,進(jìn)一步分析miR-190、ANXA11聯(lián)合檢測(cè)用于評(píng)估直腸癌患者NAC療效的預(yù)測(cè)效能。結(jié)果顯示相比于單一因子檢測(cè),miR-190、ANXA11聯(lián)合檢測(cè)的AUC顯著較高,對(duì)于評(píng)估NAC臨床效用具有較高診斷價(jià)值。雖本研究取得一定臨床研究成果,但仍存在不足之處,首先本研究屬于小樣本量研究,研究準(zhǔn)確度及可信度還需進(jìn)一步大樣本量研究證實(shí);另外目前臨床暫未有研究闡明NXA11與直腸癌之間的關(guān)系,因此本研究對(duì)于兩者之間的機(jī)制分析還需后續(xù)的基礎(chǔ)研究進(jìn)一步證實(shí)。

綜上所述,miR-190、ANXA11在NAC不同療效患者之間具有顯著差異,且與NAC臨床療效之間具有密切聯(lián)系,通過(guò)聯(lián)合miR-190、ANXA11檢測(cè)能夠?qū)χ蹦c癌患者早期療效進(jìn)行有效預(yù)測(cè),同時(shí)也能夠?yàn)樘矫髦蹦c癌發(fā)病機(jī)制提供潛在靶點(diǎn),值得臨床進(jìn)一步研究。