高效液相色譜法同時(shí)測定密胺制品中14 種熒光增白劑殘留量及遷移量

賀敏 李銳 周瑩 林依哲

（國家食品軟包裝產(chǎn)品及設(shè)備質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心（廣東））

熒光增白劑（fluorescent whitening agengts,FWAs）是具有對稱共軛的有機(jī)芳環(huán)和共軛雙鍵的熒光染料，受300~400 nm 紫外光激發(fā)后，可輻射出420~480 nm 的藍(lán)、紫光，在視覺上達(dá)到增白的效果，提高產(chǎn)品亮度[1]。我國塑料用熒光增白劑主要有4 類[1-3]：苯并惡唑類（如FWA184、FWA 393 等）；二苯乙烯基苯類（如FWA199 等）；香豆素類（如FWA140、FWA162 等）；二苯乙烯基聯(lián)苯類（如FWA378、FWA351 等）。熒光增白劑雖可以顯著提升產(chǎn)品的外觀性能，但有文獻(xiàn)表明，熒光增白劑本身含有芳香胺基和苯乙烯結(jié)構(gòu)，在毒理上具有潛在的致癌風(fēng)險(xiǎn)，并且FWAs 中的活潑結(jié)構(gòu)較易遷移到皮膚和血液中，在人體內(nèi)與蛋白質(zhì)結(jié)合后難以代謝，危害血液與肝臟健康。對此，國內(nèi)外都將熒光增白劑作為食品接觸材料及制品中的添加劑進(jìn)行監(jiān)管，并發(fā)布了相關(guān)法規(guī)和標(biāo)準(zhǔn)來規(guī)定熒光增白劑的限用量和特定遷移量。我國GB 9685-2016 和歐盟（EU）NO.10-2011規(guī)定塑料食品接觸材料（PP、PE、PET、PS、ABS、PC 等）中FWA 184 的最大使用量為0.015~0.6%，特定遷移量（SML）均為0.6 mg/kg；FWA393 的最大使用量為 0.025%，特定遷移量均為 0.05 mg/kg；FWA236 的最大使用量為0.02~0.035%，特定遷移量則不得檢出，但塑料密胺制品中熒光增白劑的最大使用量和遷移量并未規(guī)定。因此，一些產(chǎn)商向密胺制品中添加可遷移性熒光增白劑以增加產(chǎn)品的白度和鮮艷度，這類產(chǎn)品在使用中熒光增白劑可能遷移到食物中，危害人體健康。所以，發(fā)展快速高效的方法來檢測密胺制品中熒光增白劑的殘留量和遷移量對密胺制品的質(zhì)量安全生產(chǎn)具有重要意義。

目前，熒光增白劑的檢測方法集中在紙制品、化妝品、洗滌劑、紡織品和塑料制品（PS 制品、食品包裝袋、兒童玩具）等方面，而塑料密胺制品中熒光增白劑的研究極為少見。熒光增白劑的分析方法一般有分子熒光光度法、紫外分光光度法、高效液相色譜法和液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[2-4]。分子熒光光度法和紫外分光光度法只能定量，而無法定性。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定性定量準(zhǔn)確，但儀器昂貴，檢測成本高，難以普及。所以，本文采用高效液相色譜法同時(shí)檢測密胺制品中14種熒光增白劑的殘留量和遷移量，以期為密胺產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管和相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)制定提供技術(shù)支持。

1. 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高效液相色譜儀（FLD）：1260 型，安捷倫科技（中國）有限公司；超聲波清洗器：AS2205115型，天津奧特賽恩斯科技有限公司；電子天平：CPA225D 型，感量0.05 mg，梅特勒托利多科技（中國）有限公司；全自動(dòng)樣品快速研磨儀：JX-FASTPRP 型，上海凈信科技有限公司。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：熒光增白劑 220（FWA220，CAS:16470-24-9）、熒光增白劑210（FWA210，CAS:28950-61-0）、熒光增白劑351（FWA351，CAS:27344-41-8）、熒光增白劑162（FWA162，CAS:3271-05-4）、熒光增白劑 135（FWA135，CAS:1041-00-5）、熒光增白劑 199（FWA199，CAS:13001-40-6）、熒光增白劑367（FWA367，CAS:5089-22-5）、熒光增白劑 393（FWA393，CAS:1533-45-5）、熒光增白劑 368（FWA368，CAS:5242-49-9）、熒光增白劑 184（FWA184，CAS:7128-64-5）；熒光增白劑 85（FWA85，CAS:12224-06-5）、熒光增白劑 33（FWA33，CAS:61902-19-0）；熒光增白劑140（FWA140，CAS:91-44-1）、熒光增白劑 378（FWA378，CAS:40470-68-6）；甲醇、乙腈均為HPLC 級，四丁基溴化銨（TBAB，99%）、三乙胺（AR）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

于100 mL 棕色容量瓶中分別稱取14 種熒光增白劑標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg 溶解，定容至刻度，所得標(biāo)準(zhǔn)儲備液濃度100 mg/L。其中FWA220，F(xiàn)WA 210 用水溶解、FWA85、FWA140 用甲醇溶解，F(xiàn)WA351、FWA378 用乙腈/水溶解，F(xiàn)WA33、FWA 162、FWA135 用甲醇/乙腈溶解，F(xiàn)WA199、FWA 367、FWA393、FWA368、FWA184 用甲醇/二氯甲烷溶解。

1.3 樣品前處理

將密胺制品處理成較小塊狀物后，經(jīng)液氮冷凍10 min，通過樣品研磨儀快速研磨成粉末狀。準(zhǔn)確稱取0.5 g 粉末狀樣品于25 mL 比色管中，加入20 mL 提取液(MeCN:H2O:Et3N = 40:60:1)，超聲提取后靜置過濾，提取液定容至25 mL。

1.4 高效液相色譜條件

色譜柱：OSAKA SODA CAPCELL PAK PFP(4.6 mm×250 mm×5 μm)；流動(dòng)相：A 相為20 mmoL TBAB 甲醇水溶液（甲醇:水=95:5，三乙胺調(diào)節(jié)溶液pH=9），B 相為乙腈，C 相為甲醇；流速：0.8 mL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；熒光檢測器激發(fā)波長為350 nm，發(fā)射波長為430 nm。梯度洗脫程序如表1 所示。

表1 梯度洗脫程序

2. 結(jié)果與討論

2.1 液相色譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇

本文主要考察了3 種常用色譜柱（OSAKA SODA CAPCELL PAK PFP (4.6 mm×250 mm×5μm)、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18(4.6 mm× 250 mm × 5 μm) 和 Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm×5 μm)）對14 種熒光增白劑的分離情況。結(jié)果表明，C18 柱和SB-C18柱對FWA220 和FWA210、FWA367 和FWA393等結(jié)構(gòu)和極性類似的熒光增白劑難以實(shí)現(xiàn)色譜分離，而PFP 五氟苯基柱對具有相似苯環(huán)結(jié)構(gòu)的化合物可實(shí)現(xiàn)較好的分離，并通過進(jìn)一步調(diào)節(jié)流動(dòng)相比例、流速和柱溫，增加分析時(shí)間來改善 14種熒光增白劑的峰型和分離情況。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇

本文研究的14 種熒光增白劑含有一部分帶強(qiáng)極性磺酸基的水溶性化合物，這類物質(zhì)在C18柱上保留較差。因此為了增強(qiáng)其保留，在堿性條件下加入正離子對試劑四丁基溴化銨（TBAB）與磺酸基結(jié)合來減小極性，并參考相關(guān)文獻(xiàn)所提出的色譜條件[6-7]，選擇10 mmoL TBAB 甲醇水溶液（甲醇:水=95:5，三乙胺調(diào)節(jié)溶液pH=9）為A 相，通過調(diào)節(jié)B 相乙腈，C 相甲醇的比例進(jìn)行流動(dòng)相優(yōu)化，部分熒光增白劑色譜峰拖尾較為嚴(yán)重。當(dāng)流動(dòng)相A 中四丁基溴化銨濃度增加至20 mmoL，14 種熒光增白劑的峰形得到改善，且實(shí)現(xiàn)成功分離，如圖1 所示。而使用20 mmoL 乙酸銨-甲醇水溶液（甲醇:水=95:5，三乙胺調(diào)節(jié)溶液pH=9），色譜峰拖尾嚴(yán)重且無法實(shí)現(xiàn)分離，無法滿足檢測要求。此外，研究了流動(dòng)相流速（0.5、0.8、1.0 mL/min）對14 種熒光增白劑分離情況的影響，流速較大，F(xiàn)WA220 和FWA210、FWA184和FWA378 色譜峰部分重疊，難以分離。

圖1 20 mmoL TBAB 甲醇水溶液

2.2 熒光增白劑殘留量提取條件優(yōu)化

2.2.1 提取溶劑的優(yōu)化

本文考察了70%DMF 溶液、乙腈-水-三乙胺（40:60:1）、4%乙酸溶液、三氯甲烷、甲醇-水（1:1）、乙腈-水（1:1）、甲醇-水-三乙胺（40:60:1）7 種提取溶劑對密胺制品中熒光增白劑的提取效果，如圖2 所示。結(jié)果表明，乙腈-水-三乙胺（40:60:1）對密胺制品中熒光增白劑的提取效果最好。同時(shí)，鑒于本文所研究的熒光增白劑大多為陰離子型熒光增白劑，堿性環(huán)境更有利提取和檢測，因此，我們對4%乙酸提取液用三乙胺堿化后進(jìn)行檢測，對檢測結(jié)果影響不大。

圖2 不同提取溶劑對熒光增白劑的提取效果

2.2.2 提取溫度的優(yōu)化

超聲溫度和超聲時(shí)間是影響提取效率的重要因素。本文考察了超聲提取溫度（30、50、70、80℃）對密胺制品中熒光增白劑提取量的影響。結(jié)果表明，超聲提取溫度為50℃時(shí)，提取量達(dá)到最大值，隨后溫度增加，提取量下降，可能是因?yàn)闇囟壬?，提取液中有機(jī)溶劑揮發(fā)，提取效率下降，如圖3 所示。因此，選擇50℃為提取溫度。

圖3 提取溫度對熒光增白劑的提取效果

2.2.3 提取時(shí)間的優(yōu)化

其次，本文考察了超聲提取時(shí)間（30、60、90、120 min）對密胺制品中熒光增白劑提取量的影響。結(jié)果表明，超聲提取時(shí)間越長，提取效率越高，但是超聲提取60 min 后，提取效率增長緩慢，提取量趨于穩(wěn)定，如圖4 所示。因此，選擇60 min 為提取時(shí)間。

圖4 提取時(shí)間對熒光增白劑的提取效果

2.3 線性范圍和檢出限

本文在上述最優(yōu)色譜條件下，對14 種熒光增白劑的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，以質(zhì)量濃度X(mg/L)為橫坐標(biāo)，峰面積Y 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，計(jì)算線性方程及相關(guān)系數(shù)，并采用空白加標(biāo)的方法，以3 倍信噪比確定方法檢出限，10 倍信噪比確定定量限，如表2 所示。

表2 14 種熒光增白劑的線性范圍、檢出限和定量限

由表2 可知，14 種熒光增白劑在一定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均不低于0.998，滿足分析要求。當(dāng)稱樣量為0.5 g、定容體積為25 mL 時(shí)，14 種熒光增白劑的檢出限為0.01~0.3 mg/kg，定量限為0.03~1.0 mg/kg。

2.4 回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差

本文采用在空白樣品中添加標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法進(jìn)行加標(biāo)回收重復(fù)性實(shí)驗(yàn)，設(shè)置低、中、高3 個(gè)加標(biāo)水平，每個(gè)加標(biāo)樣品平行測定8 次，回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表3。結(jié)果表明，14 種熒光增白劑加標(biāo)回收率為88.55%~114.23%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.28% ~ 8.90%，方法的重復(fù)性和精密度均能滿足定量分析的要求。

表3 14 種熒光增白劑的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=8）

2.5 實(shí)際樣品中熒光增白劑殘留量和遷移量的測定

應(yīng)用所建立的分析方法，對市售50 批次密胺制品（碗、碟、盤）進(jìn)行殘留量和遷移量的檢測。殘留量檢測結(jié)果表明密胺制品中檢出FWA 33，含量為0.35~7.05 mg/kg；FWA 184 含量為0.015~0.034 mg/kg；FWA 378 含量為0.017~0.067 mg/kg；其他熒光增白劑均未檢出。隨后，按照GB 31604.1-2015 和GB 5009.156-2016 的要求，本文在70℃，2 h 和100℃，2 h 兩種遷移條件下，采用4%乙酸、50%乙醇和橄欖油3 種食品模擬物對密胺制品進(jìn)行三次遷移試驗(yàn)，檢測結(jié)果表明，第三次遷移試液中均未檢出熒光增白劑。

3. 結(jié)論

本文建立了高效液相色譜-熒光法同時(shí)檢測密胺制品中14 種熒光增白劑殘留量和遷移量的分析方法，此法前處理簡便、靈敏度高、重復(fù)性優(yōu)異，其線性關(guān)系、精密度和準(zhǔn)確度均能滿足定量分析的要求。該法可成功用于實(shí)際樣品中熒光增白劑殘留量和遷移量的檢測，可為密胺制品質(zhì)量安全監(jiān)管提供科學(xué)依據(jù)。