李松蔚,周曉琴*,趙美娟,李子富,夏德華
超聲波聯(lián)合UV-LED對耐四環(huán)素大腸桿菌的滅活效能
李松蔚1,周曉琴1*,趙美娟1,李子富1,夏德華2
(1.北京科技大學(xué)能源與環(huán)境工程學(xué)院,北京 100083;2.廣東省環(huán)境污染控制與修復(fù)技術(shù)重點實驗室(中山大學(xué)),廣東 廣州 510275)
采用超聲波-UV-LED聯(lián)合工藝以期實現(xiàn)對污水中抗生素耐藥菌(ARB)的去除,通過逐一分析不同頻率超聲波(33, 120, 200kHz)、不同波長UV-LED(255, 275nm)對耐四環(huán)素大腸桿菌的滅活以及膜損傷效能,從而確定超聲波聯(lián)合UV的工藝參數(shù).結(jié)果表明,單獨超聲波作用時,33kHz超聲波效果最佳,在輸入功率為50W、輸入劑量為1080kJ/L時,大腸桿菌的滅活率為2.30log,細胞膜損傷百分比為61.09%;單獨UV-LED作用下,輻照劑量為19.92mJ/cm2的255nm UV-LED對細菌的滅活率為5.32log,細胞膜的損傷百分比為2.52%;275nm UV-LED對細菌的滅活率為4.63log,膜損傷百分比為34.95%;但是二者聯(lián)合使用未產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng).超聲波聯(lián)合UV-LED可使消毒效能顯著提升至7.45log, 細胞膜損傷提高至68.74%,且能夠有效抑制大腸桿菌的復(fù)活,復(fù)活率降低至0.4%,超聲波聯(lián)合UV-LED在細菌耐藥性控制方面顯現(xiàn)出巨大的潛力.
抗性細菌;超聲波;UV-LED;滅活效能;光復(fù)活
由于抗生素的濫用和過度使用,導(dǎo)致污水中抗生素耐藥菌(ARB)及其相關(guān)的抗生素耐藥基因(ARGs)數(shù)量劇增,目前已經(jīng)成為全球重大公共安全問題[1-2].因此,研究污水中抗性細菌及抗性基因的控制技術(shù)具有重要意義.
紫外線(UV)是一種常規(guī)的消毒手段,具有非化學(xué)、占地面積小、滅活高效且消毒副產(chǎn)物少等優(yōu)點[3].傳統(tǒng)紫外汞燈含汞毒性,易造成二次污染且壽命較短[4].2013年聯(lián)合國環(huán)境規(guī)劃署要求締約國自2020年起禁止生產(chǎn)及進出口含汞產(chǎn)品.因此,尋找傳統(tǒng)紫外汞燈的替代品尤為重要.紫外發(fā)光二極管(UV-LED)是近年來新興的紫外消毒裝置,具有環(huán)境友好、啟動速度快、波長多樣性、可發(fā)射單一固定波長等優(yōu)點,成為取代傳統(tǒng)汞燈的新型、可靠的紫外光.有研究表明使用265nm的UV-LED可滅活4~ 5log濃度的大腸桿菌,使用組合波長如260nm/ 280nm、265nm/280nm、267nm/275nm,細菌的復(fù)活率顯著降低[5-10].
超聲波也是一種消毒手段,與氯、臭氧、紫外等組合消毒,可以增強消毒效能[11].有研究發(fā)現(xiàn),使用超聲波預(yù)處理的大腸桿菌相比未經(jīng)處理的大腸桿菌,經(jīng)過UV消毒濃度降低5log時,可以減少20%以上的紫外輻照劑量,且可以有效抑制細菌的光復(fù)活.使用輸入聲密度為2.2kW/L的超聲波與UV-LED組合,作用150s后tet M和tet Q的基因去除率相比單獨使用UV-LED提高了4倍[12-13].
基于此,本文以耐四環(huán)素大腸桿菌為研究對象,分別研究了超聲波消毒(33, 120, 200kHz)、UV-LED消毒(255, 275nm)、UV-LED組合消毒、超聲波聯(lián)合UV-LED消毒對耐四環(huán)素大腸桿菌的去除特性,并借助流式細胞儀和光復(fù)活裝置研究細菌細胞膜損傷、光復(fù)活規(guī)律,以期為污水中抗性細菌的控制提供新思路.
本研究所使用的大腸桿菌()篩選自北京某污水處理廠的二級出水.使用前將接種菌株的菌液置于37℃、200r/min搖床震蕩培養(yǎng)12~14h,然后4000r/min、4℃離心15min,棄上清液收集菌體,用無菌去離子水重新懸浮,制得濃度約為109CFU/mL的抗性細菌懸液作為母液待用.實驗時將上述懸液稀釋至107CFU/mL.
本研究使用的超聲反應(yīng)器由蘇州工業(yè)園區(qū)海納科技有限公司加工制造,功率在0~200W之間可調(diào),頻率分別為33, 120, 200kHz.超聲波實際輸入功率使用功率計(型號:LCDG-ZJ1-62010)測量.
將50mL菌懸液分別加入頻率為33, 120, 200kHz的超聲波反應(yīng)器中,調(diào)節(jié)輸入功率至50W,超聲處理時間設(shè)置為18min,每3min取樣一次.依據(jù)本研究團隊前期的研究結(jié)果,采用超聲波輸入聲密度(W/L)以及單位輸入能量密度(kJ/L)作為評價超聲波能耗的參數(shù)指標(biāo),根據(jù)式(1)和(2)計算獲得[13].
基于此,試驗進行0, 3, 6, 9, 12, 15, 18min對應(yīng)的超聲波單位輸入能量密度則分別為0, 180, 360, 540, 720, 900及1080kJ/L,測定對應(yīng)消毒時間的細菌滅活率以及細胞膜損傷情況,設(shè)置3組平行試驗.
本研究所使用的紫外光源為準(zhǔn)平行UV-LED光束器(山東青島杰森電氣有限公司),該光源由6個直徑為9mm的UV-LED燈珠按照兩行三列形式排列,平行管高20cm,可發(fā)射波長為255和275nm光束,可獨立控制,光強可通過電流調(diào)節(jié)(0~200mA).使用紫外光譜輻照計(HP350UV,杭州雙色智能檢測儀器有限公司)測試紫外線強度.測定時,將儀器放置在平行管下方,開啟電源,待示數(shù)穩(wěn)定后即可讀出實際的紫外輻照強度.在試驗前,使用上述輻照計對單一波長或雙波長UV-LED輻照強度分別進行測定,得到單一波長或疊加波長的實際輻照強度.
將50mL菌懸液加入到直徑90mm的石英培養(yǎng)皿中,將培養(yǎng)皿放置在磁力攪拌器上,以200r/min的轉(zhuǎn)速進行攪拌,然后將UV-LED裝置垂直放置在培養(yǎng)皿上方照射.UV-LED按照單波長、組合波長分別開展試驗.本試驗共設(shè)置6組試驗條件,每組運行20min,每5min取樣一次,設(shè)置3組重復(fù)試驗,試驗設(shè)置如表1所示.
表1 UV-LED消毒試驗條件
將50mL稀釋后的菌樣加入到33kHz超聲波反應(yīng)器中,調(diào)節(jié)輸入功率為50W,將UV-LED裝置垂直放置在超聲波反應(yīng)器上方,同時使用16.6μW/cm2255nm、38μW/cm2275nm UV-LED照射.試驗時間設(shè)置為18min,每3min取一次樣,取出的水樣于4℃下保存,用于后續(xù)分析,設(shè)置3組平行試驗.
光復(fù)活試驗采用功率為8W,波長為365nm的UVA光源(CELWLAX500,CEAULIGHT有限公司),運行電流為0.2mA.光源預(yù)熱20min,將經(jīng)過滅活的菌樣放入光復(fù)活反應(yīng)器內(nèi),UVA照射的同時使用磁力攪拌子攪拌菌樣.試驗時間設(shè)置為24h,在0.5, 1, 2, 4, 8, 12和24h取樣測定.所有試驗均在室溫(25±3)℃下進行(圖1).
圖1 超聲聯(lián)合UV-LED消毒試驗流程
采用標(biāo)準(zhǔn)平板計數(shù)法測定細菌可培養(yǎng)性,使用無菌水將試驗樣品進行梯度稀釋,使稀釋后水樣中細菌濃度處于可測濃度范圍(30~300CFU/mL).將1mL菌樣涂布于營養(yǎng)瓊脂板上,然后37℃培養(yǎng)24h后進行菌落計數(shù)(CFU/mL).
細胞膜損傷采用流式細胞儀(CytoFLEX,貝克曼,美國)測定,使用LIVE/DEAD BacLight試劑盒(L34856,賽默飛)染色,該試劑盒含有兩種熒光染料,其中 SYTO 9能夠穿透所有細胞的細胞膜與核酸結(jié)合并發(fā)出綠色熒光,PI只能穿透細胞膜損傷細胞與核酸結(jié)合并發(fā)出紅色熒光.分別用1.5μL 3.34mmol/L SYTO 9和1.5μL 30mmol/L PI對菌樣染色,25℃避光培養(yǎng)15min,將染色后的菌樣通過流式細胞儀分析.
細菌的滅活率采用式(3)計算.
滅活率=log
10
(
N
0
/N
) (3)
使用復(fù)活率來表征被滅活的大腸桿菌中復(fù)活的部分所占的比例,采用式(4)計算.
復(fù)活率= (
N
t
-
N
)/(
N
0
-
N
)×100% (4)
式中:t為光復(fù)活后的菌落計數(shù),CFU/mL;0為照射前菌落計數(shù),CFU/mL;為照射后菌落計數(shù), CFU/mL.
所有數(shù)據(jù)通過origin 2021進行分析.
圖2 超聲波頻率與功率對大腸桿菌滅活及膜損傷效果的影響
超聲波對耐四環(huán)素大腸桿菌的滅活及膜損傷效果如圖2所示.隨著超聲波處理時間增加,細菌滅活率、膜損傷程度均呈上升趨勢.試驗結(jié)束時,33, 120, 200kHz超聲波對大腸桿菌的滅活率分別為2.30log、2.10log、1.80log,相比之下,低頻超聲對于細菌的滅活效果更佳[14].降低33kHz超聲波的輸入功率至37.5W和25W,試驗結(jié)束時細菌的滅活率分別為2.17log、1.86log. 33kHz (25, 37.5, 50W)、120kHz 50W、200kHz 50W五種試驗條件下,細胞膜損傷百分比分別為43.96%、54.11%、61.09%、45.64%、38.66%.由此可見,低頻超聲波(33kHz)展現(xiàn)出較好的消毒效果,滅活效能高且更易對細菌細胞膜造成損傷.這是因為低頻超聲波(低于100kHz)與高頻率(高于100kHz)相比,可以產(chǎn)生更大的空化泡,釋放更高的能量[15-16],這些能量可以破壞大腸桿菌的細胞膜,甚至導(dǎo)致 DNA、ATP和蛋白質(zhì)泄漏,對細胞造成不可逆的損傷[17].
從圖中可以看出,超聲波處理3min,細胞膜損傷不顯著,隨著處理時間延長,細胞膜的損傷程度迅速上升,隨后速率減緩.出現(xiàn)該現(xiàn)象可能是因為初期超聲波的能量主要用于破碎菌膠團,效率較低,隨后超聲波能量絕大部分作用于大腸桿菌,其機械效應(yīng)產(chǎn)生的剪切力將細菌的細胞膜“剪碎”,對細胞膜造成了不可逆的損傷,從而導(dǎo)致細菌失去可培養(yǎng)性.基于上述結(jié)果,選擇頻率為33kHz ,輸入功率為50W的超聲條件進行后續(xù)研究.
2.2.1 單波長UV-LED的滅活 輻照強度為16.6μW/cm2的255nm與275nm UV-LED對耐四環(huán)素大腸桿菌的滅活及膜損傷效果如圖3所示.試驗結(jié)束時,255nm滅活率為5.32log,相比于275nm高出0.69log;在細胞膜損傷方面, 275nm UV-LED照射下,試驗結(jié)束時大腸桿菌細胞膜損傷百分比為34.95%,而255nm僅為2.52%,對細胞膜的損傷效果甚微.類似的研究也表明,低劑量的255nm UV-LED (10mJ/ cm2)對大腸桿菌的膜損傷可以忽略不計[18-19],即使將劑量增加到4000mJ/cm2,膜損傷程度依然很小(最高12.9%)[18-20].原因可能是255nm UV-LED接近于DNA的吸收峰(260nm),能直接穿透細胞,被DNA吸收,使DNA中相鄰的嘧啶分子形成嘧啶二聚體,從而阻止DNA的復(fù)制和蛋白質(zhì)的合成,使其失去可培養(yǎng)性[21-23].相對而言,275nm UV-LED更接近蛋白質(zhì)的吸收峰(280nm),因此,275nm的UV-LED主要作用于細菌的細胞膜,對類蛋白物質(zhì)具有氧化作用,可以對細菌細胞膜造成損傷,有助于對細菌產(chǎn)生持續(xù)的滅活效果,但是對DNA的針對性不高,從而導(dǎo)致滅活效率相對較低[10].在本試驗中,沒有觀察到“拖尾”現(xiàn)象,這與之前的研究結(jié)論不同[8],原因可能是本試驗中采用的細菌具有抗生素耐藥性且初始菌液濃度高, 同時紫外輻照強度較低所致.
圖3 255nm/275nm UV-LED對大腸桿菌的滅活和膜損傷效果
調(diào)整275nm UV-LED的輻照強度至22, 30, 38μW/cm2,得到細菌滅活及膜損傷情況如圖4所示.試驗結(jié)束時,三種試驗條件下大腸桿菌的滅活率分別為4.63log、4.70log、4.99log,對應(yīng)的細胞膜損傷百分比分別為26.76%、31.56%、34.17%.隨著輻照強度的增加,細菌的滅活率逐漸增加,但是15min后大腸桿菌滅活速率開始減緩,產(chǎn)生類似“拖尾”現(xiàn)象,可能是由于該類細菌更易產(chǎn)生莢膜物質(zhì),可以促進微生物自聚體的形成,從而降低了滅活效率[24].
圖4 輻照劑量對大腸桿菌滅活和膜損傷效果的影響
2.2.2 組合波長UV-LED的滅活 使用255nm (16.6μW/cm2)和275nm UV-LED (16.6, 22, 30, 38μW/cm2)組合消毒,得到滅活率和膜損傷效果如圖5所示.
圖5 雙波長UV-LED對大腸桿菌的滅活及細胞膜損傷
四組實驗條件中細菌滅活率最高的一組達到6.11log(255nm 16.6μW/cm2、275nm 38μW/cm2),其他三組分別為5.39log、5.38log、5.50log.相比于單波長,組合消毒未展現(xiàn)出“1+1>2”的效果. Nyangaresi等[8]采用267與275nm UV-LED組合滅活大腸桿菌同樣未觀察到協(xié)同效應(yīng).分析原因可能是275nm UV-LED對細菌造成的損傷主要作用于蛋白質(zhì)相關(guān)成分, 而255nm主要作用于細胞內(nèi)的DNA 和RNA,是降低細胞培養(yǎng)能力的主要因素,因此在275與255nm共同作用時未產(chǎn)生協(xié)同作用.在細胞膜損傷方面, UV-LED照射20min后,四種消毒條件下大腸桿菌細胞膜損傷均低于50%,細胞膜表現(xiàn)出較強的抗紫外線能力, 結(jié)合四種試驗條件下細菌的滅活率,表明細菌在膜損傷前就失去了可培養(yǎng)能力,即膜未完全受損,細菌便失去培養(yǎng)能力[25].組合波長在細胞膜損傷上表現(xiàn)出疊加而非協(xié)同效應(yīng),即“1+1=2”.并且在Wan等[26]的研究中,使用30mJ/cm2265nm 和280nm UV-LED組合,相比于單波長消毒細菌細胞膜損傷百分比降低, UV-C波段組合消毒對于細菌細胞膜的損傷機理還需要進一步的研究.
基于上述試驗結(jié)果,使用50W、33kHz超聲波與組合波長(16.6μW/cm2255nm、38μW/cm2275nm) UV-LED聯(lián)合滅活菌樣,細菌滅活率及膜損傷如圖6、7所示.聯(lián)合消毒18min,細菌的滅活率達到7.45log,相比于組合波長UV-LED滅活率提高了1.34log,表明二者聯(lián)合消毒產(chǎn)生了協(xié)同效應(yīng).
圖7為流式細胞分析結(jié)果,從圖中可以看出,隨著消毒時間的增加,細胞膜損傷百分比有明顯提升,消毒結(jié)束時細胞膜損傷百分比達到68.74%.高強度的超聲波使大腸桿菌細胞膜出現(xiàn)多處損傷,且持續(xù)的超聲波處理在破碎菌膠團的同時使細菌持續(xù)處于運動狀態(tài),使UV輻照效率變高從而使其滅活效能升高[27].此外,超聲波通過空化作用在UV系統(tǒng)中引入活性氧,增強對DNA的損傷,消毒過程中形成的·OH氧化了含ARG的DNA,使其更好地吸收紫外光,從而提高滅活效率[12-22-28].
圖6 超聲聯(lián)合雙波長UV-LED對大腸桿菌的滅活
圖7 超聲聯(lián)合雙波長UV-LED消毒的流式細胞分析結(jié)果
P1區(qū)域代表細胞膜受損的細胞
為探究超聲波聯(lián)合UV-LED消毒是否可以抑制抗性大腸桿菌的光復(fù)活,對組合波長UV-LED以及超聲波聯(lián)合UV-LED消毒后的菌樣進行光復(fù)活試驗,結(jié)果如圖8所示.使用組合波長UV-LED消毒后,大腸桿菌的濃度降低了6.11log,光復(fù)活8h內(nèi)水樣中大腸桿菌濃度迅速上升,細菌濃度增加了3.68log.8~24h,大腸桿菌濃度基本不變,表明細菌的可培養(yǎng)性基本恢復(fù)完全.由此可見,經(jīng)過UV消毒后的大腸桿菌會在一定程度上光復(fù)活,這與UV的消毒原理有關(guān).經(jīng)過UV照射后,細菌細胞內(nèi)的DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)中相鄰的嘧啶堿基形成二聚體,從而對DNA造成損傷,在光復(fù)活過程中,受損細胞的光解酶利用光子產(chǎn)生的能量直接將嘧啶二聚體分解為單體,從而實現(xiàn)損傷修復(fù),進而使細菌恢復(fù)其可培養(yǎng)性[29].
使用超聲波聯(lián)合UV-LED消毒,大腸桿菌濃度降低了7.45log,光復(fù)活前0.5h內(nèi)細菌濃度相比于消毒出水稍有降低,0.5~4h大腸桿菌濃度上升,可培養(yǎng)性恢復(fù)了1.28log.4~24h,細菌濃度逐漸降低至低于消毒出水中大腸桿菌的濃度.光復(fù)活結(jié)束時,大腸桿菌的濃度相比于消毒出水降低了0.94log.在0~0.5h細菌可培養(yǎng)性的降低說明在此期間仍有細菌喪失可培養(yǎng)性,引入超聲降低了大腸桿菌的代謝活性.Kaur等[27]使用超聲波消毒后4株大腸桿菌的代謝活性均接近于0,超聲波的空化作用產(chǎn)生的機械作用、化學(xué)作用、熱效應(yīng)對細菌細胞膜的損傷具有延時作用,超聲作用停止后,細菌細胞膜的損傷還在繼續(xù),造成細菌喪失其可培養(yǎng)性.相比于單獨UV-LED消毒,超聲波聯(lián)合UV-LED消毒最大光復(fù)活濃度的出現(xiàn)提前了4h,且降低了2.4log.引入超聲波聯(lián)合消毒顯著降低了抗性大腸桿菌的生長活力,且可以有效抑制光復(fù)活.
圖8 超聲聯(lián)合雙波長UV-LED消毒以及光復(fù)活24h內(nèi)大腸桿菌的濃度變化
將本試驗中得到的大腸桿菌光復(fù)活率與已有的研究結(jié)果進行比較,見表2.本試驗得到的光復(fù)活率遠低于已有文獻中使用單波長或組合波長UV消毒后的光復(fù)活率.研究結(jié)果表明,采用超聲波聯(lián)合UV-LED在微生物消毒領(lǐng)域具有廣泛的研究前景及應(yīng)用價值.
表2 與文獻中大腸桿菌光復(fù)活率比較
3.1 超聲波對于耐四環(huán)素大腸桿菌的滅活有一定效果,在膜損傷方面表現(xiàn)較好.低頻超聲波(33kHz)對于大腸桿菌的滅活及膜損傷效能優(yōu)于高頻超聲波(120kHz、200kHz).
3.2 UV-LED可有效實現(xiàn)對耐四環(huán)素大腸桿菌的滅活,輻照劑量越高,細菌的滅活率越高.255nm UV-LED對耐四環(huán)素大腸桿菌的滅活效能更高,而275nm UV-LED對細胞膜的損傷效能更高.兩種波長組合使用,未取得協(xié)同效應(yīng).經(jīng)過組合UV-LED滅活后,部分細菌在UV-A照射條件下可實現(xiàn)復(fù)活,降低了ARB的總體滅活效率.
3.3 低頻超聲波(33kHz)與組合波長UV-LED (255nm/275nm)聯(lián)合使用,提高大腸桿菌的滅活率,經(jīng)過二者聯(lián)合消毒后的細菌生長活力弱,二者聯(lián)用很大程度抑制了抗性細菌的光復(fù)活,對于抗生素抗性細菌的滅活以及抑制光復(fù)活表現(xiàn)出較好的應(yīng)用效果.
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The inactivation efficiency of ultrasound combined with UV-LED on tetracycline-resistant Escherichia coli.
LI Song-wei1, ZHOU Xiao-qin1*, ZHAO Mei-juan1, LI Zi-fu1, XIA De-hua2
(1.School of Energy and Environmental Engineering, University of Science and Technology Beijing, Beijing 100083, China;2.Guangdong Provincial Key Laboratory of Environmental Pollution Control and Remediation Technology(Sun Yat-sen University)), Guangzhou 510275, China)., 2023,43(12):6313~6320
In this study, the inactivation efficiency as well as membrane damage of tetracycline-resistantunder ultrasound at different frequencies (33, 120, 200kHz) and different UV-LED wavelengths (255, 275nm) were evaluated respectively, and furthermore, the optimized operation parameter were selected to form combined ultrasound and UV-LED process to control ARB in sewage effectively. The results showed that 33 kHz ultrasound alone was effective in ARB inactivation, and with an input power of 50 W accumulated to an input dose of 1080 KJ/L, the inactivation rate ofcan reach to 2.30 log, while the percentage of cell membrane damage was 61.09%. For UV-LED alone, when 255nm UV-LED irradiated at dosage of 19.92mJ/cm2, the inactivation rate of bacteria and the percentage of cell membrane damage were 5.32log and 2.52% respectively. While the inactivation rate and the percentage of cell membrane damage were 4.63 log and 34.95% respectively for 275nm UV-LED irradiation, but dual-wavelength UV-LED irradiation did not show synergistic effect in bacteria inactivation. However, ultrasound combined with UV-LED can obviously improve the disinfection efficiency, the inactivation rate increased to be 7.45log, the cell membrane damage increased to be 68.74%. Meanwhile, the photoreactivation rate of bacteria after disinfection was reduced to 0.4%. The combination of ultrasound and UV-LED shows great potential in ARB control during wastewater treatment.
resistant bacteria;ultrasound;UV-LED;inactivation efficiency;photoreactivation
X703.1
A
1000-6923(2023)12-6313-08
李松蔚,周曉琴,趙美娟,等.超聲波聯(lián)合UV-LED對耐四環(huán)素大腸桿菌的滅活效能 [J]. 中國環(huán)境科學(xué), 2023,43(12):6313-6320.
Li S W, Zhou X Q, Zhao M J, et al. The inactivation efficiency of ultrasound combined with UV-LED on tetracycline-resistant Escherichia coli [J]. China Environmental Science, 2023,43(12):6313-6320.
2023-04-20
國家重點研發(fā)計劃(2021YFC3201305);廣東省環(huán)境污染控制與修復(fù)技術(shù)重點實驗室開放基金資助項目(2020B1212060022)
* 責(zé)任作者, 副教授, zhouxiaoqin025@163.com
李松蔚(1999-),男,吉林省吉林市人,北京科技大學(xué)碩士研究生,主要研究方向為微污染物的生態(tài)效應(yīng).發(fā)表論文1篇. m202110177@xs.ustb.edu.cn.