接種根瘤菌對(duì)‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’結(jié)瘤固氮及生長的影響

曹克璠,劉嘉偉,索榮臻,張慧敏,馬一鳴,吳 倩,劉 鑫,包立高,王明玖*

(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院/草地資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018; 2.包頭市農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量安全中心,內(nèi)蒙古 包頭 014010; 3.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)技術(shù)推廣中心,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030)

高加索三葉草(TrifoliumambiguumM.Bieb.)原產(chǎn)于高加索地區(qū),具有發(fā)達(dá)的地下分蘗系統(tǒng)[4],平均根冠比為2.74,巨大的地下生物量為其提供了對(duì)各種環(huán)境條件的適應(yīng)性[5]。高加索三葉草建植后,不僅產(chǎn)量高,還具有極好的營養(yǎng)品質(zhì),其粗蛋白含量高于紫花苜蓿(MedicagosativaL.)、紅三葉(TrifoliumpratenseL.)和白三葉(TrifoliumrepensL.),而纖維含量則比三者低[6]。然而,有研究學(xué)者發(fā)現(xiàn)高加索三葉草在非原產(chǎn)地的地區(qū)不能與根瘤菌形成共生關(guān)系,即使形成根瘤,大多數(shù)也是小且無效的[7]?！赊r(nóng)三葉草1號(hào)’(T.ambiguumBieb. ‘Mengnong No.1’)是內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)培育出的高加索三葉草品種。該品種在內(nèi)蒙古地區(qū)能正常建植,能夠結(jié)瘤固氮。研究團(tuán)隊(duì)將其移栽至青海省西寧市及青藏高原等地后發(fā)現(xiàn),‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’在青海地區(qū)仍然能夠自發(fā)結(jié)瘤固氮。

‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’具有強(qiáng)大的抗逆性和環(huán)境適應(yīng)性,使其能在內(nèi)蒙古正常生長。但由于無法與根瘤菌共生固氮,其產(chǎn)量潛力和推廣應(yīng)用面臨限制。目前,國內(nèi)外對(duì)高加索三葉草的研究主要集中在三葉草育種[8-9]、耐寒性[10-11]、根蘗性[12]等方面,取得顯著進(jìn)展。但關(guān)于共生固氮機(jī)制的研究還相對(duì)薄弱。個(gè)別學(xué)者探討了高加索三葉草特異性根瘤菌在新西蘭南島土壤中的持久性和有效性[13],但系統(tǒng)的根瘤菌篩選研究還不多。為充分發(fā)掘這一優(yōu)質(zhì)牧草資源的產(chǎn)量潛力和經(jīng)濟(jì)價(jià)值,亟需開展共生固氮方面的研究。

本研究采用盆栽試驗(yàn),測(cè)試5株從青海地區(qū)分離得到的‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根瘤菌菌株(No.1,No.2,No.3,No.5,No.9)對(duì)‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’的接種效果,比較不同菌株對(duì)三葉草結(jié)瘤固氮、生長和營養(yǎng)成分的影響,以篩選出最佳匹配根瘤菌菌株。該研究將有助于彌補(bǔ)該領(lǐng)域的研究空白,豐富高加索三葉草共生固氮機(jī)制的研究,并為推廣應(yīng)用提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)培育的‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1根瘤收集 取樣區(qū)為青海大學(xué)試驗(yàn)田內(nèi)的‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’種植區(qū)。將取樣區(qū)平均分為3個(gè)小區(qū),采用三點(diǎn)取樣法,每區(qū)采樣6份,共采集18份樣品。采樣時(shí),鏟去表土,下挖20～30 cm,將開花期的三葉草根系及粘附其上的根際土壤一同裝入無菌凍存管,隨后立即放進(jìn)液氮罐中,帶回實(shí)驗(yàn)室摘取其根瘤。

1.2.2根瘤菌分離、純化 把采集的根瘤沖洗干凈,選取個(gè)大、飽滿、粉紅色者,裝入無菌瓶中。從無菌瓶中取出根瘤,用0.1%升汞浸泡5 min,再用95%的酒精浸泡1 min,最后用蒸餾水洗滌3次,確保無藥劑殘留。

將滅菌后的根瘤1～2個(gè)分別置于無菌培養(yǎng)皿中,用無菌鑷子將其壓碎,擠出汁液,加入2 mL無菌水稀釋,充分混勻,制成菌懸液。取0.2 mL菌懸液于YMA培養(yǎng)基(甘露醇10 g,磷酸氫二鉀0.5 g,硫酸鈉0.2 g,氯化鈉0.05 g,酵母膏0.4 g,RH微量元素液4 mL,瓊脂15 g,蒸餾水1 000 mL)上,并用滅菌玻璃棒涂抹均勻,放入28℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。經(jīng)過48 h的培養(yǎng),在培養(yǎng)基上長出菌落。挑選生長良好的單菌落,在YMA培養(yǎng)基上反復(fù)劃線,培養(yǎng),直到得到純化的菌株為止,待分離到較純的單菌落后,將其分別轉(zhuǎn)接于YMA斜面進(jìn)行培養(yǎng),4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

本研究共分離獲得40株根瘤菌菌株。經(jīng)過反復(fù)純化培養(yǎng),從中篩選獲得發(fā)育良好的5株作為試驗(yàn)材料。

1.2.3BOX-PCR菌株基因分型

(1)PCR引物

用于根瘤菌基因組多樣性的研究的BOX-PCR引物序列為BOXA1R 5′-CTA CGG CAA GGC GAC GCT GAC G-3′[14]。

(2)BOX-PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系(25 μL體系)

反應(yīng)體系中含10×PCR緩沖液 2.5 μL,MgCl2(25 mmol·L-1)5.6 μL,dNTP(10 mmol·L-1)2.0 μL,DMSO(100%)2.5 μL,BSA(10 mg·mL-1)0.2 μL,BOXA1R(30 pmol·L-1)引物0.32 μL,TaqDNA聚合酶(2.5 U·μL-1)0.5 μL,模板DNA(50 ng·μL-1)1.0 μL,用ddH2O補(bǔ)足至25 μL。

(3)PCR擴(kuò)增條件

95℃預(yù)變性2 min;94℃變性1 min,52℃退火1 min,65℃延伸8 min,循環(huán)30次;最后65℃延伸18 min。PCR產(chǎn)物用1.0 %瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后,置于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

(4)凝膠電泳檢測(cè)

取BOX-PCR產(chǎn)物5 μL,加入1 μL的loading buffer,用1.5 %(W/V)的瓊脂糖凝膠電泳(電壓50 V)5 h。電泳結(jié)束后,放在凝膠成像儀進(jìn)行掃描分析,保存。

1.2.4接種根瘤菌與幼苗培養(yǎng)

(1)菌懸液制備

將已經(jīng)分離并鑒定后的根瘤菌分別接種至YMA液體培養(yǎng)基中,180 r·min-1,28℃搖床培養(yǎng)至光密度值(OD600值)>0.5時(shí),10 000 r·min-1離心10 min,倒掉上清液用無菌水洗下菌體,配置成OD600值為0.5的菌懸液,備用。

(2)幼苗培養(yǎng)與處理

試驗(yàn)于2021年4月在內(nèi)蒙古呼和浩特市內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)草原與資源環(huán)境學(xué)院草地資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室人工氣候室中進(jìn)行。選取子粒飽滿的‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’種子數(shù)粒,進(jìn)行表面消毒。將消毒后的種子置于鋪有濾紙的無菌培養(yǎng)皿中,26℃避光培養(yǎng)3～4 d。將發(fā)芽后的種子根部移栽至裝滿蛭石(已滅菌)的10 cm×10 cm的黑色營養(yǎng)缽中,置于28℃,16/8小時(shí)光照/黑暗循環(huán)、相對(duì)濕度70%的可控環(huán)境室中。每缽移栽3株,澆等量的Hoagland無氮營養(yǎng)液(NS1010-N-50L),培養(yǎng)1 d。在無菌條件下用移液槍將得到的菌懸液加入幼苗根部,每盆1 mL,每種菌株分別接50個(gè)營養(yǎng)缽作為重復(fù)。每盆每天定時(shí)補(bǔ)充10 mL營養(yǎng)液。

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1植株表型的測(cè)定 在‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’接種不同根瘤菌處理60 d后,從各處理中隨機(jī)選取10株植株。將植株從營養(yǎng)缽中取出,用蒸餾水沖洗根部表面殘留的蛭石,濾紙吸干。以莖基部將植株分為地上部和根部,隨后進(jìn)行如下測(cè)定:

(1)用卷尺測(cè)定植株株高;

(2)用萬分之一天平測(cè)定地上(地下)生物量鮮重(干重)、單株根瘤重;

(3)用鑷子小心取下單株的所有根瘤,統(tǒng)計(jì)單株根瘤數(shù)量、單株有效根瘤數(shù)量等表型指標(biāo)。

1.3.2植株?duì)I養(yǎng)成分測(cè)定 對(duì)接種60 d后的植株分別取樣,在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用濾袋技術(shù)改進(jìn)的范氏測(cè)定法測(cè)定酸性洗滌纖維(Acid detergent fiber,ADF)和中性洗滌纖維(Neutral detergent fibre,NDF)含量[15],利用半微量凱氏定氮法測(cè)定粗蛋白(CP)含量[16]。

1.3.3根瘤固氮酶活性的測(cè)定 利用上海優(yōu)選生物科技有限公司的植物固氮酶(Nitrogenase)ELISA檢測(cè)試劑盒與酶標(biāo)儀進(jìn)行測(cè)定。

1.3.4根瘤的石蠟切片和觀察 參考Li等[17]方法對(duì)篩選出的優(yōu)勢(shì)菌株的根瘤進(jìn)行石蠟切片,并用甲苯胺藍(lán)進(jìn)行染色,將制好的片子置于萊卡生物顯微鏡下進(jìn)行觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

利用Microsoft Excel 2010 進(jìn)行基礎(chǔ)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理,使用R 4.2.3軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、相關(guān)性分析和主成分分析。

主成分分析和綜合得分計(jì)算公式參考賀文君[18]的計(jì)算公式,公式如下所示:

Fi=U1X1+U2X2+U3X3+…+UiXi

(1)

F=F1W1+F2W2+F3W3+…+FiWi

(2)

式中,Ui表示第i主成分的得分系數(shù),Xi表示各指標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)化后數(shù)據(jù),Fi表示各主成分得分,Wi表示各主成分因子的貢獻(xiàn)率,即第i主成分權(quán)重,F表示主成分綜合得分。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的基因分型

本研究采用BOX-PCR技術(shù)對(duì)分離得到的菌株進(jìn)行基因分型,從BOX-PCR擴(kuò)增結(jié)果可以看出,所有菌株之間均有差異,表明這5株根瘤菌屬于不同的菌株(圖1)。

圖1 BOX-PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 BOX-PCR amplification results注:圖中M為100 bp Marker,1為No.1,2為No.2,3為No.3,4為No.5,5為No.9。下同Note:In the figure,M is 100 bp Marker. 1 stands for No.1 strain;2 No.2 strain;3 No.3 strain;4 No.5 strain and 5 No.9 strain. The same as below

2.2 植株生長表型分析

2.2.1接種根瘤菌對(duì)植株株高的影響 在接種不同根瘤菌菌株的處理下,各組植株的株高均較CK顯著差異(P<0.05),1,2,3,5和9號(hào)菌分別提高了53.28%,25.61%,45.02%,169.78%和71.00%。說明接種根瘤菌能夠促進(jìn)植株株高增長。其中,效果最佳的為接種5號(hào)菌的處理,株高為22.23 cm(圖2)。

圖2 接種不同根瘤菌菌株對(duì)‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’株高的影響Fig.2 Effect of inoculation of different Rhizobium strains on the plant height of ‘Mengnong Clover No. 1’注:圖中數(shù)據(jù)(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)帶有不同字母者代表處理間差異顯著(P<0.05)。下同Note:Data (mean ± standard deviation) with the different lowercase letters in the graph represents a significant difference between different treatments at the 0.05 level. The same as below

2.2.2接種根瘤菌對(duì)植株單株生物量的影響 各組植株的單株生物量的增減幅度各異。在地上生物量鮮重的比較中,各組生物量數(shù)值均顯著大于CK(P<0.05),最大的為接種5號(hào)菌的處理,達(dá)到了3.268 g;1,2,3和9號(hào)菌的處理也較CK分別提高了1.74,1.21,3.37和2.35倍(圖3a)。烘干至恒重后,地上生物量的整體變化趨勢(shì)并無較大波動(dòng),但仍差異顯著(P<0.05),由大到小依次為5,3,9,1和2號(hào)菌的處理,較CK分別增長了132.56%,11.63%,255.81%,1 704.65%和216.28%(圖3c)。在地下生物量鮮重的比較中,效果最突出的是接種5號(hào)菌的處理,地下生物量鮮重達(dá)到了2.284 g;效果最差的為接種2號(hào)菌的處理,較CK降低了34.88%,地下生物量鮮重僅為0.168 g(圖3b)。地下生物量干重與鮮重的變化幅度大致相同,效果最好的依舊為接種5號(hào)菌的處理,地下生物量干重為0.467 g(圖3d)。

圖3 接種不同根瘤菌菌株對(duì)‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’生物量的影響Fig.3 Effect of inoculation of different rhizobium strains on the biomass of ‘Mengnong Clover No. 1’

2.2.3接種根瘤菌對(duì)植株單株根瘤指標(biāo)的影響 由于CK未進(jìn)行接種處理,無法結(jié)瘤固氮,故其根瘤指標(biāo)均為0。1,2,3和9號(hào)菌處理的根瘤數(shù)平均值分別為23.7,22.4,28和23.6,而接種5號(hào)菌的植株,顯著大于其它處理(P<0.05),平均值高達(dá)45.9(圖4a)。通過肉眼觀察根瘤的外部形態(tài),其中個(gè)大、飽滿、粉紅色者,視為有效根瘤,1,2,3,5和9號(hào)菌的有效根瘤率分別為78.06%,69.64%,75.71%,73.86%和86.44%(圖4b)?？梢钥闯?盡管接種5號(hào)菌的處理會(huì)產(chǎn)生更多的根瘤,但其有效率并不高,而接種9號(hào)菌的處理所產(chǎn)生的有效根瘤較多。接種1,2和3號(hào)菌的處理之間,單株的根瘤重?zé)o顯著差異,平均值分別為0.012 g,0.011 g和0.012 g;接種9號(hào)菌處理的顯著高于這3個(gè)處理(P<0.05),平均值為0.017 g;而平均值最大的是接種5號(hào)菌的處理,平均值為0.029 g(圖4c)。

圖4 接種不同根瘤菌菌株對(duì)‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’根瘤指標(biāo)的影響Fig.4 Effect of inoculation of different rhizobium strains on the root nodule indexes of ‘Mengnong Clover No. 1’

2.3 接種根瘤菌對(duì)植株?duì)I養(yǎng)成分的影響

接種根瘤菌60 d后進(jìn)行取樣,測(cè)定其不同纖維指標(biāo)的含量,不同處理間的NDF含量變化范圍為25.339%～39.05%;其中未接種根瘤菌的植株NDF最高,為39.05%,顯著高于其他處理(P<0.05);接種根瘤菌處理下的植株NDF含量在30%左右,其中含量最低的為接種5號(hào)菌的處理,含量為25.339%,與其他處理均存在顯著性差異(P<0.05)(圖5a)。對(duì)于ADF,不同處理間的ADF含量變化范圍為19.437%～28.25%;其中未接種根瘤菌的植株ADF最高,為28.25%,顯著高于其他處理(接種3、9號(hào)菌的處理除外)(P<0.05);而含量最低的為接種5號(hào)菌的處理,含量為19.437%。通過計(jì)算得出的RFV中,數(shù)值最高的為接種5號(hào)菌的處理,高達(dá)270.86%,顯著高于其他處理(P<0.05);而數(shù)值最小的是未接種根瘤菌的處理,顯著低于其他處理(P<0.05)(圖5b)。

圖5 ‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’接種不同根瘤菌菌株后對(duì)其營養(yǎng)成分的影響Fig.5 Effect of inoculation of different rhizobium strains on the nutrient composition of ‘Mengnong Clover No. 1’

圖6 不同根瘤菌菌株的根瘤固氮酶活性測(cè)定Fig.6 Determination of nitrogen fixing enzyme activity of different rhizobia strains

不同菌株處理下,植株粗蛋白質(zhì)含量變化明顯,接種根瘤菌的處理均顯著提高了植株的粗蛋白含量(P<0.05)。其中,效果最好的是接種1、5、9號(hào)菌株的植株,粗蛋白含量較CK分別增加了38.52%,37.99%和36.91%;其次為接種2、3號(hào)菌株的處理,粗蛋白含量較CK分別增加了25.37%和26.87(圖5c)。

2.4 根瘤固氮酶活性的測(cè)定

接種根瘤菌處理后的植株均發(fā)生了結(jié)瘤現(xiàn)象。從根瘤的固氮酶活性強(qiáng)弱來看,最弱的為接種1號(hào)菌的處理,為7.30 μmol·(g·h)-1;接種2號(hào)菌的處理為1號(hào)菌的1.219倍,且存在顯著性差異(P<0.05);接種5號(hào)菌的處理,較1號(hào)菌增長了25.5%;9號(hào)菌的處理略高于1號(hào)菌的處理,為7.71 μmol·(g·h)-1。而接種3號(hào)菌的處理顯著高于其他處理(P<0.05),達(dá)到了10.21 μmol·(g·h)-1;各處理組的固氮酶活性均存在顯著性差異(P<0.05)。

2.5 優(yōu)勢(shì)根瘤的顯微結(jié)構(gòu)觀察

為觀察根瘤內(nèi)部結(jié)構(gòu),對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株(5號(hào)菌)根瘤橫、縱切面的顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察。根瘤內(nèi)部甲苯胺藍(lán)的染色較深而且著色面積較大,這就表明了根瘤菌在根瘤細(xì)胞中定殖較多且被侵染的根瘤細(xì)胞數(shù)目也較多(圖7)。

圖7 接種5號(hào)根瘤菌菌株植株的根瘤橫(左圖)縱(右圖)切面Fig.7 Transverse (left panel) and longitudinal (right panel) sections of the root nodule from plants inoculated with the rhizobium strain No.5

圖8 ‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’接種不同根瘤菌菌株后對(duì)各指標(biāo)影響的相關(guān)性熱圖Fig.8 Heat map of correlation between the individual indexes in ‘Mengnong Clover No.1’ inoculated with different rhizobium strains注:*,**和***在此表示不同的顯著性水平,分別對(duì)應(yīng)P值小于0.05,0.01和0.001Note:*,** and *** here represent different levels of significance,corresponding to P-values less than 0.05,0.01 and 0.001,respectively

2.6 接種根瘤菌對(duì)植株各指標(biāo)影響的相關(guān)性分析

采用皮爾遜相關(guān)性分析方法,分析了株高、單株生物量、根瘤指標(biāo)、營養(yǎng)成分等變量之間的線性相關(guān)性。結(jié)果顯示:

(1)株高與單株地上鮮/干重(r=0.95,P<0.01;r=0.96,P<0.01)、單株地下鮮/干重(r=0.94,P<0.01;r=0.94,P<0.01)、根瘤數(shù)(r=0.95,P<0.01)、有效根瘤數(shù)(r=0.93,P<0.01)呈顯著正相關(guān);與單株根瘤重的正相關(guān)更為顯著(r=0.98,P<0.001)。這符合株高與植株生長量之間應(yīng)存在的正相關(guān)規(guī)律。與粗蛋白(r=0.65)、固氮酶活性(r=0.49)呈正相關(guān)關(guān)系但不顯著。

(2)NDF(r=-0.91,P<0.05)和ADF(r=-0.88,P<0.05)與株高呈顯著負(fù)相關(guān)。與根瘤數(shù)量、有效根瘤數(shù)、單株根瘤重呈極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系(P<0.01)。

(3)ADF與單株地上鮮/干重(r=-0.87,P<0.05;r=-0.88,P<0.05)、單株地下鮮/干重(r=-0.89,P<0.05;r=-0.90,P<0.05)、根瘤數(shù)量(r=-0.89,P<0.05)、有效根瘤數(shù)(r=-0.83,P<0.05)、單株根瘤重(r=-0.87,P<0.05)均呈顯著負(fù)相關(guān)。

2.7 接種根瘤菌對(duì)植株各指標(biāo)影響的主成分分析

將接種根瘤菌后的各指標(biāo)進(jìn)行歸一化處理,提取了特征值大于1的2個(gè)主成分,其方差貢獻(xiàn)值分別是86.2%和11.1%,累計(jì)方差貢獻(xiàn)率是97.3%,說明提取的2個(gè)主成分解釋了接種根瘤菌對(duì)植株表型、營養(yǎng)成分的大部分積極的影響。因此,提取2個(gè)主成分,分別為y1和y2。

根據(jù)2個(gè)主成分系數(shù),得到y(tǒng)1,y2的線性組合:

y1=0.305X1+0.299X2+0.293X3+0.302X4+0.297X5+0.306X6+0.302X7+0.310X8-0.308X9-0.276X10+0.236X11+0.212X12

y2=-0.092X1-0.276X2-0.337X3-0.290X4-0.321X5+0.192X6+0.215X7+0.098X8-0.185X9+0.129X10+0.458X11+0.510X12

由上式可知,在主成分y1中,株高(X1)、地上鮮重(X2)、地上干重(X4)、根瘤數(shù)量(X6)、有效根瘤數(shù)(X7)、根瘤重(X8)的系數(shù)絕對(duì)值大于其他變量的系數(shù)絕對(duì)值,所以主成分y1是植株地上部分及根瘤指標(biāo)的綜合反映,它表示植株的地上生長和根瘤發(fā)育狀況。

在主成分y2中,地下鮮重(X3)、地下干重(X5)、粗蛋白(X11)、固氮酶活性(X12)的系數(shù)絕對(duì)值大于其他變量的系數(shù),所以主成分y2主要是由這4個(gè)指標(biāo)來綜合反映的,它表示植株地下部分發(fā)育狀況、營養(yǎng)成分及固氮酶活性等。

主成分分析進(jìn)一步證實(shí),接種5號(hào)菌的處理顯著提高了植株的研究屬性(圖9)。

圖9 ‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’接種不同根瘤菌菌株后對(duì)各指標(biāo)影響的主成分分析可視化圖Fig.9 Principal component analysis of the effects of inoculation of different rhizobium strains on each indexes in ‘Mengnong Clover No.1’

3 討論

3.1 接種根瘤菌對(duì)植株生長與結(jié)瘤的影響

在自然界中,由豆科牧草和根瘤菌組成的共生系統(tǒng)被認(rèn)為是最有效的固氮系統(tǒng)之一[18-20]。大量研究表明,豆科牧草通過接種根瘤菌可以有效提高飼草產(chǎn)量和質(zhì)量[21-22],接種根瘤菌的植株可以產(chǎn)生有效的根瘤,從而改善作物生長性能,促進(jìn)根系發(fā)育,提高單株根瘤數(shù)和根瘤鮮干重[24]。

株高是描述牧草基本生長狀況,反映牧草產(chǎn)量的重要指標(biāo)之一[25]。在本試驗(yàn)中,接種根瘤菌后的植株株高較CK明顯提高。這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果相一致[26]。高振生等[27]通過比較不同根瘤菌處理的苜蓿生物量,發(fā)現(xiàn)接種根瘤菌比不接種根瘤菌處理能顯著提高植株高度;羅彥昕[28]對(duì)紫花苜?！r(nóng)一號(hào)’和‘金皇后’2個(gè)品種進(jìn)行接種根瘤菌的研究發(fā)現(xiàn),‘公農(nóng)一號(hào)’‘金皇后’接種根瘤菌后,株高較CK增加28.92%和39.24%;而姬月梅等[29]在根瘤菌/大豆(Glycinemax(L.) Merr.)匹配試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),相比對(duì)照組,接種根瘤菌后的大豆的株高反而降低。導(dǎo)致結(jié)果不同的原因可能有以下幾點(diǎn):首先,試驗(yàn)材料不同,本研究使用的‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’與其它研究的紫花苜蓿等基因型不同,對(duì)根瘤菌的響應(yīng)可能存在差異;其次,根瘤菌菌株不同,與植物基因組匹配程度的高低會(huì)影響促生長效果。另外,在本研究中,5號(hào)菌處理的促生長效果最佳,這可能是因?yàn)?號(hào)菌株與‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’匹配性高,進(jìn)行了高效氮固定,為植株提供足夠多的氮素。同時(shí),5號(hào)菌株還可能合成并分泌了更多促生長激素,如脫落酸、赤霉素等植物生長激素,促進(jìn)植株生長。

牧草干鮮比是指牧草鮮草風(fēng)干樣品重量占牧草鮮草重量的百分比,可以反映牧草干物質(zhì)的積累和利用程度,用來揭示牧草干物質(zhì)積累的基本情況,同時(shí)作為判定牧草是否能夠用于青貯的依據(jù)[30]。接種根瘤菌可顯著提高植株的地上/地下生物量,這與宋珍、王廣達(dá)等人的研究結(jié)果相似[29-30]。一種原因可能是,在接種根瘤菌初期,植株還未出現(xiàn)結(jié)瘤現(xiàn)象,向植株施加缺氮營養(yǎng)液,造成植株的營養(yǎng)匱乏,而隨著根瘤的出現(xiàn),空氣中的N2被其固定,為植株提供營養(yǎng),植株得以迅速生長,造成植株生物量的增加;另一方面,接種根瘤菌后,植株通過促進(jìn)根系的生長和發(fā)育,為根瘤菌提供更多的位點(diǎn),造成植株地下生物量的增加。這與諸多研究學(xué)者的結(jié)論類似,如黃新等研究了接種根瘤菌對(duì)不同苜蓿品種結(jié)瘤和生物學(xué)產(chǎn)量的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn),接種匹配的根瘤菌能顯著提高紫花苜蓿的生物學(xué)產(chǎn)量[21]。

研究結(jié)果表明,接種根瘤菌后,豆科植物通過特定的識(shí)別和相互作用形成具有固氮能力的根瘤,以改善豆科植物的生長性能,促進(jìn)根系發(fā)育,提高單株根瘤數(shù)和根瘤的鮮干重[24,29]。本試驗(yàn)中,盡管5株根瘤菌菌株都能與‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’形成共生,進(jìn)行結(jié)瘤固氮,這與Mitchell等[2]的研究結(jié)果相似。但固氮和促進(jìn)植物生長效果存在明顯差異,這與胥雅馨等[33]及Matse等[34]的研究結(jié)果一致。其中5號(hào)菌株的促生長效果最佳,表明不同根瘤菌對(duì)特定植株的適配性不同,篩選匹配的菌株對(duì)獲得最佳效果至關(guān)重要。本研究初步確定5號(hào)菌株為‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’的最適匹配菌,為后續(xù)大面積應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。

本研究采用蛭石固定植株且經(jīng)過滅菌處理,配合缺氮營養(yǎng)液,可有效隔離外部氮源的影響,保證根瘤固氮作為植株唯一氮源,這種技術(shù)措施對(duì)準(zhǔn)確評(píng)價(jià)根瘤菌效應(yīng)提供了支持。今后的研究可在自然土壤環(huán)境中驗(yàn)證各菌株的效果。

3.2 接種根瘤菌對(duì)植株?duì)I養(yǎng)價(jià)值的影響

纖維素含量是影響牧草品質(zhì)的重要指標(biāo)。通常認(rèn)為纖維素含量越低,牧草的營養(yǎng)價(jià)值就越好[35]。韓華雯等[34-36]的研究結(jié)果顯示,接種根瘤菌可以降低苜蓿中性洗滌纖維(NDF)和酸性洗滌纖維(ADF)的含量。本研究也得到了類似的結(jié)論,根瘤菌處理可顯著降低‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’植株的NDF和ADF含量,增加蛋白質(zhì)含量。原因可能有以下幾個(gè)方面:首先,在根瘤菌-豆科植物共生系統(tǒng)中,根瘤固定大氣中的N2,并將其轉(zhuǎn)化為可被生物體直接利用的形式,此過程需要消耗大量的能量,作為碳水化合物如可溶性糖可直接轉(zhuǎn)化為能量供其利用,而粗纖維作為一種結(jié)構(gòu)性碳水化合物,也極有可能被消耗,因而導(dǎo)致植物干草中粗纖維含量的下降。其次,根瘤菌固氮作用提供氮源,促進(jìn)植株氮代謝,合成更多氨基酸和蛋白質(zhì),從而提高蛋白質(zhì)含量。

但是,曾長立等[21,37],的研究表明,接種根瘤菌也可能提高植株纖維含量。這可能是由于測(cè)試材料、根瘤菌菌株、試驗(yàn)條件等的差異導(dǎo)致了研究結(jié)果的不一致。本研究發(fā)現(xiàn)5號(hào)菌株處理效果最佳,可顯著降低‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’的NDF和ADF,增強(qiáng)飼料品質(zhì)。這為篩選適配‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’的功能菌株,改善草料質(zhì)量提供了依據(jù)。今后還需在更多環(huán)境下驗(yàn)證不同根瘤菌對(duì)‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’營養(yǎng)成分的影響。

4 結(jié)論

對(duì)‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’接種不同根瘤菌菌株,均會(huì)改善植株的生長表型,營養(yǎng)成分等指標(biāo)。其中,5號(hào)菌株效果最佳,可顯著提高植株株高、地上地下生物量,降低ADF,NDF含量,增加蛋白質(zhì)含量。根瘤的固氮酶活性測(cè)定表明,3號(hào)菌株酶活性最強(qiáng),其次是5號(hào)菌株。根瘤結(jié)構(gòu)觀察顯示,在5號(hào)菌株中,根瘤菌定殖較多且侵染的根瘤細(xì)胞數(shù)目也較多。本研究初步篩選出促進(jìn)‘蒙農(nóng)三葉草1號(hào)’生長的功能根瘤菌株,為后續(xù)應(yīng)用研究奠定了基礎(chǔ)。