紫花苜蓿MsMYB58基因克隆及抗旱功能鑒定

劉 佳,王少鵬,史 昆,周 仂,王 贊

(中國農業(yè)大學草業(yè)科學與技術學院,北京 100193)

紫花苜蓿(Medicagosativa)是世界上廣泛種植的重要豆科牧草之一。在我國,紫花苜蓿廣泛種植于東北、華北和西北等干旱、半干旱地區(qū),其產業(yè)發(fā)展嚴重受到干旱環(huán)境的制約。因此挖掘紫花苜?？购迪嚓P的基因資源,探索紫花苜?？购祷蛟诟珊得{迫應答過程中的功能,對紫花苜蓿的遺傳改良具有重要作用。

轉錄因子是植物響應生物和非生物脅迫調控機制中的重要調節(jié)因子[1-2]。MYB轉錄因子家族是成員數(shù)量最多、參與生物學過程最廣泛的轉錄因子家族之一,在植物生長發(fā)育及脅迫應答中均發(fā)揮著重要作用[3-4],廣泛參與植物次生細胞壁的形成。例如,AtMYB58參與在SND1介導的次生細胞壁合成的轉錄調控網絡中,主要通過特異性激活木質素生物合成基因的轉錄,調控次生壁的形成[5];AtMYB58的同源基因EjMYB1在枇杷(Eriobotryajaponica)果實貯藏期間調節(jié)木質素的生物合成[6];在水稻(Oryzasativa)和柳枝稷(Panicumvirgatum)中也有報道MYB58參與次生壁的合成[7-8]。植物次生細胞壁顯著影響植物對脅迫的耐受性[9]。例如,過表達白樺(Betulaplatyphylla)BplMYB46可以促進木質素的沉積,提高轉基因白樺對鹽脅迫和滲透脅迫的耐受性,表明轉基因白樺的非生物脅迫反應和木質素的生物合成途徑可能是相互交叉的[10];Ji等發(fā)現(xiàn)擬南芥AtTCF1基因通過調節(jié)木質素的生物合成來調控抗凍性[11]。目前,關于MYB58的研究主要圍繞其調控次生細胞壁形成的機制,其參與植物抗逆性的研究較少,因此有必要對紫花苜蓿MsMYB58基因進行抗逆性相關研究。

本研究克隆了MsMYB58基因,在生物信息學的基礎上分析該基因在紫花苜蓿不同組織器官以及不同逆境脅迫下的表達模式,確定MsMYB58蛋白的亞細胞定位,并分析MsMYB58異源表達轉基因煙草的抗旱表型,初步分析該基因在紫花苜?？购敌灾械墓δ堋Ｑ芯拷Y果為進一步深入研究MsMYB58響應紫花苜蓿脅迫的分子機制提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

植物材料為‘中苜1號’(‘Zhongmu No.1’)紫花苜蓿和本氏煙草(N.benthamiana),均由中國農業(yè)大學草業(yè)科學與技術學院牧草基因資源與遺傳改良實驗室保存并提供。2022年8月試驗所用材料均播種于苗缽中,生長待用。

1.2 基因的克隆及生物信息學分析

以紫花苜蓿的cDNA為模板,根據特異性引物MsMYB58-F/R進行PCR擴增,獲得MsMYB58全長。利用NCBI網站對MsMYB58蛋白質的理化特性進行分析。采用SOPMA二級結構預測分析軟件預測了MsMYB58蛋白質的二級結構。用MEGA7軟件使用鄰接法將MsMYB58蛋白與其他物種的MYB58蛋白進化樹分析。

1.3 亞細胞定位

根據基因序列設計帶有酶切位點PACI和ASCI的MsMYB58-GFP引物,進行PCR擴增,將擴增產物連接到pMDC83上,挑取單克隆通過菌落PCR鑒定后測序,將測序正確的質粒利用基因槍轟擊洋蔥表皮細胞[12],使用激光共聚焦顯微鏡(Nikon A1R HD25,日本)進行觀察,確認熒光蛋白表達的位置。

1.4 組織特異性及不同脅迫處理下表達模式分析

對紫花苜蓿不同組織(根、莖、葉、花)進行取樣。將紫花苜蓿幼苗分別放置在200 mmol·L-1NaCl溶液(0,2,4,8,12,24 h)、100 μmol·L-1脫落酸(Abscisic acid,ABA)溶液(0,2,4,8,12,24 h),以及自然干旱(0,4,8,12,16,18 d)處理下,分別在對應時間點進行取樣,樣品保存在-80℃。以紫花苜蓿MsActin-qPCR-F/R作為內參基因(表1),應用Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix熒光定量試劑盒進行qPCR,采用2-ΔΔct[13]的算法計算表達量。

表1 引物序列Table 1 Primer list

1.5 轉基因煙草的獲得及抗旱性分析

通過全式金同源重組試劑盒pEASY?-Uni Seamless Cloning and Assembly Kit,以pBI121-MsMYB58-F/R為引物進行PCR擴增,將擴增產物連接到超表達pBI121載體上,通過測序獲得正確的重組質粒。采用凍融法[14]將35S∶∶MsMYB58-GUS重組質粒轉入農桿菌GV3101,通過菌落PCR驗證后,-80℃保存。采用農桿菌轉化的葉盤法將重組質粒轉入煙草[15],獲得轉基因材料并在DNA和RNA水平上鑒定陽性植株。在同一生長環(huán)境下,待WT和轉基因材料生長1個月后,開始進行干旱處理,處理18 d后進行表型拍照,并測定葉綠素熒光參數(shù),收集樣品測定過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶活性以及丙二醛和脯氨酸含量。對干旱處理后的植株進行復水一周的處理,并拍照記錄表型,每組處理共3個生物學重復。過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶活性均采用可見分光光度法[16]進行測定。丙二醛和脯氨酸含量分別采用硫代巴比妥酸(Thiobarbituric acid,TBA)比色法[17]和茚三酮比色法[18]進行檢測。葉綠素熒光參數(shù)[光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)利用效率(Quantum yield of photosystem II,Phi2),非光化學猝滅(Non-photochemical quenching,NPQt),光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學量子產量(Maximum efficiency of photosystem II,Fv/Fm)]由便攜式葉綠素熒光儀MultispeQ(Photosynq,美國)進行測定。

1.6 數(shù)據處理

分別采用SPSS 24.0和GraphPad Prism 8對數(shù)據進行統(tǒng)計分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 MsMYB58克隆與生物信息學分析

本研究以‘中苜1號’紫花苜?；蚪M[20]為參考基因組,克隆得到了MsMYB58基因,通過測序確定了其序列(1 002 bp,圖1A)。通過對MsMYB58蛋白進行理化分析發(fā)現(xiàn),MsMYB58編碼333個氨基酸,分子量是37.80 kDa,理論等電點是4.75。通過對MsMYB58蛋白進行二級結構預測分析,結果表明該蛋白的二級結構以無規(guī)則卷曲為主,占總體的51.95%,α-螺旋占30.63%,β轉角占6.31%,延伸鏈占11.11%(圖1B)。MsMYB58氨基酸序列具有植物MYB轉錄因子家族的特異性結構域SANT-myb DNA結合結構域,屬于R2R3-MYB亞家族(圖1C)。

圖1 MsMYB58的生物信息學分析Fig.1 Bioinformatics analysis of MsMYB58注:A,MsMYB58的克隆;B,MsMYB58蛋白質二級結構的預測;C為MsMYB58保守結構域分析Note:A,cloning of MsMYB58;B,prediction of MsMYB58 protein secondary structure;C,conserved domain analysis of MsMYB58

將MsMYB58與蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula) MtMYB63(XP_013464259.1)、紅三葉(Trifoliumpratense) TpMYB10(XP_045799731.1)、鷹嘴豆(Cicerarietinum) CaMYB63(XP_004488797.1)、狹葉羽扇豆(Lupinusangustifolius) LaMYB308(XP_019443727.1)、赤小豆(Vignaumbellata) VuMYB7(XP_047180024.1)、大豆(Glycinemax) GmMYB63(XP_006598214.2)、野大豆(Glycinesoja) GsMYb63(XP_028203131.1)、落花生(Arachishypogaea) AhMYB58(XP_025674104.1)、毛果楊(Populustrichocarpa) PtMYB58(XP_002310679.1)、擬南芥(Arabidopsisthaliana) AtMYB58(NP_173098.1)、小麥(Triticumaestivum) TaMYB58(XP_044441013.1)、玉米(Zeamays) ZmMYB58(XP_020401111.1)、粳稻(Oryzasativasubsp.Japonica) OsMYB58(XP_015634881.2)共13個物種的MYB蛋白進行系統(tǒng)發(fā)育樹的構建。系統(tǒng)發(fā)育樹分析表明,MsMYB58與蒺藜苜蓿、紅三葉、鷹嘴豆等豆科的同源蛋白的親緣關系較近,與粳稻OsMYB58親緣性關系較遠(圖2)。

圖2 MsMYB58蛋白的系統(tǒng)進化樹構建Fig.2 Phylogenetic tree analysis of MsMYB58 proteins

2.2 MsMYB58亞細胞定位

構建了35S∶∶MsMYB58-GFP的載體,轉化洋蔥表皮細胞后,通過激光共聚焦顯微鏡進行觀察。結果顯示,當空載轉化洋蔥表皮細胞后,細胞內均可以觀察到綠色熒光的出現(xiàn),而轟擊表達載體35S::MsMYB58-GFP的洋蔥表皮細胞在細胞核、細胞壁和細胞膜中均觀察到綠色熒光(圖3),因此MsMYB58定位在細胞核、細胞壁和細胞膜中,但具體機制需進一步研究。

圖3 MsMYB58的亞細胞定位Fig.3 Subcellular localization of MsMYB58注:圖中白色箭頭代表細胞核的位置,黃色箭頭代表細胞膜的位置,紅色箭頭代表細胞壁的位置Note:The white arrows in the figure represent the location of the nucleus,the yellow arrows represent the location of the cell membrane,and the red arrows represent the location of the cell wall

2.3 紫花苜蓿MsMYB58的表達分析

采用qRT-PCR技術分析MsMYB58在紫花苜蓿中的組織特異性。結果表明,MsMYB58在紫花苜蓿的根、莖、葉和花中均有不同程度的表達,其中在莖中表達量最高,其次是葉和花,根中的表達量最少(圖4)。

對紫花苜蓿幼苗進行ABA,NaCl以及自然干旱處理,檢測了不同處理時間下MsMYB58的表達量。結果表明,在ABA處理下,MsMYB58的表達量呈現(xiàn)先上升后下降的變化趨勢,在12 h表達量最高,為對照的25倍(圖4B);NaCl處理24 h時表達量達到最高水平,為對照的26倍(圖4C)。MsMYB58的表達量隨著自然干旱處理時間的遞增呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢,在16 d時其表達量達到最高,在18 d時雖有下降但仍顯著高于0 d(圖4D)。以上結果表明,MsMYB58在紫花苜蓿響應非生物脅迫中具有重要作用。

2.4 異源超表達MsMYB58煙草的抗旱性

通過DNA(圖5A)和RNA水平(圖5C)的檢測,選取其中3個相對表達量高的轉基因株系(OE-1,OE-2和OE-3)進行后續(xù)的干旱處理。結果表明,干旱脅迫18 d后,WT植株葉片的萎蔫程度比轉基因株系更嚴重;復水1周后,轉基因株系的葉片恢復正常,但野生型沒有恢復(圖5B)。試驗結果說明超表達MsMYB58增強了轉基因煙草的抗旱性。

圖5 過表達MsMYB58提高了轉基因煙草的抗旱性Fig.5 Overexpression of MsMYB58 improved drought resistance of transgenic tobacco注:A為轉基因株系DNA水平的驗證;M為DNA分子量標準DNA,+表示陽性對照;B為干旱脅迫下過表達MsMYB58轉基因株系的表型;C為轉基因株系中MsMYB58相對表達量,*表示不同株系的表達量與WT相比差異顯著(P<0.05)Note:A,verification of DNA levels of transgenic lines;M,DNA marker;+,positive control;B,phenotypes of transgenic lines overexpression MsMYB58 under drought stress;C,the relative expression of MsMYB58 in transgenic lines,* indicates significant differences in expression in different tissues compared to WT (P<0.05)

2.5 MsMYB58轉基因煙草在干旱脅迫下的生理與光合響應

植物在干旱脅迫過程中通過提高過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的酶活來抵制活性氧帶來的傷害[16]。正常情況下,與WT相比過表達株系的過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶的酶活性無顯著差異。在干旱脅迫下,轉基因煙草的過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶均顯著高于WT(圖6A-C)。丙二醛含量的變化趨勢則相反,干旱脅迫下過表達株系的丙二醛含量顯著低于WT,而脯氨酸含量的變化與過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶酶活性的變化趨勢相同(圖6D-E)。近年來,葉綠素熒光參數(shù)作為常用指標來反映脅迫條件下植物光合生理作用的特性[21]。正常情況下,與WT相比,過表達株系的Phi2,NPQt和Fv/Fm均無顯著性差異。在干旱脅迫下,轉基因株系的Phi2和Fv/Fm均顯著高于WT,而NPQt則相反(圖6F-H)。以上結果表明在干旱脅迫下,過表達株系通過提高光合作用能力和抗氧化能力來增強其抗旱性。

圖6 WT與異源超表達MsMYB58轉基因植株的抗性生理指標與葉綠素熒光參數(shù)Fig.6 Physiological index of resistance and chlorophyll fluorescence parameters of transgenic plants with WT and heterogeneously overexpressing MsMYB58注:*表示處理之間差異顯著(P<0.05)Note:* indicates significant differences between treatments (P<0.05)

3 討論

植物中大多數(shù)MYB轉錄因子屬于R2R3-MYB亞家族[22-23]。R2R3-MYB亞家族在植物響應逆境脅迫的調控中具有重要的作用。近年來有大量關于R2R3-MYB亞家族參與植物非生物脅迫的報道,如擬南芥、小麥、煙草、水稻和大豆的相關報道中分別鑒定出了137個、393個、174個、95個和288個R2R3-MYB亞家族基因,其中部分已被證明參與響應干旱、鹽堿及高溫等非生物脅迫[24-29]。本研究通過克隆獲得了MsMYB58,其氨基酸序列具有植物MYB轉錄因子家族的特異性結構域SANT-MYB的DNA結合結構域,屬于R2R3-MYB亞家族(圖1C),并且其表達受干旱脅迫、NaCl和ABA處理的誘導。絕大多數(shù)轉錄因子只在細胞核中定位和發(fā)揮作用。然而,在某些條件下,一些轉錄因子也可以定位于細胞膜中。例如,SiMYb42,屬于R2R3-MYB亞族,其亞細胞定位在細胞核與細胞膜上,推測是由于細胞膜上的SiMYB42蛋白在經過某些蛋白修飾后,進入細胞核中行使其功能[30]。辣椒中轉錄因子WRKY30的亞細胞定位同樣在細胞核及細胞膜上[31]。本研究也發(fā)現(xiàn)MsMYB58定位于細胞核、細胞膜和細胞壁中,這表明MsMYB58可能存在某些轉錄后修飾,使其亞細胞定位發(fā)生了轉移,但具體的機制需要進一步研究。

干旱是限制紫花苜蓿產量和品質的主要因素之一,因此有研究學者通過基因工程技術提高紫花苜蓿對干旱脅迫的耐受性,來增加紫花苜蓿的產量。例如,MsHSP70在紫花苜蓿中受到高溫脅迫、ABA和過氧化氫脅迫的誘導,轉入擬南芥后增強了植株對PEG和ABA脅迫的耐受性[32]。MsNTF2L通過促進活性氧清除、降低氣孔密度、ABA誘導氣孔關閉和表皮蠟質積累來增強紫花苜蓿的抗旱性[33]。Ma等[34]發(fā)現(xiàn)超表達MsTMT的轉基因紫花苜蓿中α-生育酚和總生育酚水平顯著高于對照,轉基因紫花苜蓿的抗旱性顯著提高。干旱脅迫下,在擬南芥中過表達MsMYB2L促進了脯氨酸、可溶性糖等滲透調節(jié)物質的合成,從而提高了轉基因擬南芥的抗旱性[35]。本研究中發(fā)現(xiàn)MsMYB58顯著受干旱脅迫的誘導,并且超表達MsMYB58可以適當提高煙草對干旱脅迫的耐受性。

在逆境條件下,植物會產生大量的活性氧(Reactive oxygen species,ROS),這些活性氧分子對植物的生長發(fā)育產生負面影響[36]。本研究發(fā)現(xiàn),ABA處理可以顯著誘導MsMYB58表達,且超表達MsMYB58可以顯著增加轉基因煙草在干旱脅迫下過氧化物酶、過氧化氫酶、超氧化物歧化酶的活性以及脯氨酸的含量。ABA作為脅迫信號在調節(jié)植物的干旱反應中具有重要作用,Wang等[18]研究發(fā)現(xiàn)黃瓜(Cucumissativus)中CsATAF1通過上調ABA應答基因參與ABA信號通路來提高其抗旱性。Zhou等[12]研究發(fā)現(xiàn)在煙草中MsNAC51通過調控脯氨酸合成基因MsP5CS和活性氧清除基因MsPOD-P7的表達來增強其抗旱性。因此,干旱脅迫下,MsMYB58可能通過對ABA的響應,激活了相關抗性基因的表達,如過氧化物酶基因、脯氨酸合成酶基因等,通過減少干旱脅迫引起的氧化脅迫,增強植物的抗旱性。

另外,在一些物種中MYB58被報道正調控次生細胞壁的形成。近年來,許多研究都表明次生壁形成可以提高植物的抗逆性。如OsCSLD4是參與調控植物細胞壁糖類合成的基因,而過表達OsCSLD4則顯著提高了水稻的耐鹽性,表明OsCSLD4不僅參與植物細胞壁的合成而且在響應鹽脅迫中也具有重要作用[37]。RL14通過調控水稻中纖維素和木質素的合成,增強水稻的抗旱能力[38]。因此,MsMYB58可能也參與次生細胞壁形成,從而提高抗旱性。MsMYB58參與紫花苜蓿次生細胞壁形成的功能和機制解析,需在紫花苜蓿中進一步研究。

4 結論

紫花苜蓿MsMYB58開放閱讀框全長1 002 bp,編碼333個氨基酸,在莖中表達量最高;定位于細胞核、細胞膜和細胞壁中;其表達受自然干旱、ABA和NaCl等脅迫的誘導。在煙草中異源超表達MsMYB58增強了干旱脅迫下轉基因煙草的光合能力和抗氧化能力,顯著提高了轉基因煙草的抗旱性。本研究確認了MsMYB58的抗旱功能,為紫花苜?？购涤N提供了潛在的基因資源,具體的抗旱分子機制仍需進一步研究。