miR-539抑制乳腺癌細胞MCF-7遷移的作用機制分析

孫煜曦,鄧英姿,張美玲,張運峰,許 可,胡 芬

(1.華北理工大學 生命科學學院,河北 唐山 063210;2.唐山師范學院 生命科學系,河北 唐山 063000)

乳腺癌(Breast cancer)是女性多發(fā)惡性腫瘤之一,晚期癌細胞會隨著淋巴管和血管向遠端肝臟、腦、肺臟、骨組織轉(zhuǎn)移,且轉(zhuǎn)移過程是一個多基因參與調(diào)控的復雜過程[1]。已有文獻報道轉(zhuǎn)化生長因子β[2]、E-鈣黏蛋白[3],基質(zhì)金屬蛋白酶[4]等多個基因與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。目前,乳腺癌的轉(zhuǎn)移機制已經(jīng)有所了解,但仍有許多問題尚未解決。

microRNAs是一類長度約為19～25個核苷酸長度的內(nèi)源性短鏈非編碼RNA,其與靶基因的mRNA的3’端非翻譯區(qū)(3’UTR)序列結(jié)合,抑制靶mRNA翻譯或促進mRNA降解,從而通過調(diào)節(jié)靶基因的表達來實現(xiàn)對生命活動的調(diào)控[5]。miR-539在多種癌癥的發(fā)生發(fā)展中有著重要的功能,在前列腺癌中miR-539通過調(diào)節(jié)SPAG5的表達抑制其發(fā)展[6],在肝癌發(fā)生中miR-539通過靶向下調(diào)E2F3蛋白水平達到抑制癌細胞的增殖[7],miR-539還抑制非小細胞肺癌[8]細胞增殖并促進其凋亡。

本研究通過檢測miR-539在乳腺癌細胞系中的表達,分析其對乳腺癌細胞遷移的影響,并進一步通過生物信息學分析其靶基因集合和信號通路及其在乳腺癌組織和正常組織間的表達差異,為深入研究miR-539在乳腺癌細胞發(fā)展中的作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 TCGA數(shù)據(jù)集分析miR-539在乳腺癌中的臨床意義

采用TCGA數(shù)據(jù)在線分析工具(http://bioinfo.life.hust.edu.cn/miR_path/index),獲得miR-539的表達譜。

1.2 細胞培養(yǎng)

ZR-75-30、MDA-MB-231、T-47D和MCF-7乳腺癌細胞系培養(yǎng)在含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素、100 U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中,在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 總RNA的提取和定量PCR

四種乳腺癌細胞總RNA的抽提和定量PCR參照胡芬等[9]的方法進行。

miR-539的檢測引物如下:5′-GGAGAAAT TATCCTTGGTGTGT-3′(上游引物),5′-GTG CAGGGTCCGAGGT-3′(下游引物)。U6為內(nèi)參基因,U6的檢測引物如下:5′-CTCGCTTCG GCAGCACATA-3′(上游引物),5′-CGAATTT GCGTGTCATCCT-3′(下游引物)。

1.4 遷移實驗

以7×104個MCF-7細胞/孔的密度接種于24孔細胞培養(yǎng)板中,待細胞密度達到80%～90%的時候,將miR-539 mimics、Negative Control、miR-539 inhibitor和microRNA inhibitor N.C(上海吉瑪生物有限公司)轉(zhuǎn)染到MCF-7細胞,轉(zhuǎn)染和遷移實驗參照胡芬等[9]的方法進行。

1.5 miR-539保守性分析

利用miRBase數(shù)據(jù)庫下載Homosapiens(人)、Canisfamiliaris(家犬)、Equuscaballus(馬)、Bostaurus(牛)、Macacamulatta(獼猴)、Musmusculus(小鼠)、Ovisaries(綿羊)、Pantroglodytes(黑猩猩)、Pongopygmaeus(猩猩)、Rattusnorvegicus(大鼠)10個物種的miR-539的成熟序列。采用MEGA7.0軟件分析其保守性。

1.6 miR-539靶基因的預(yù)測

應(yīng)用TargetScan7.1、RNA22-HSA及MIRDB靶基因預(yù)測軟件對miR-539進行靶基因預(yù)測,取三者預(yù)測數(shù)據(jù)的交集再結(jié)合miTarbase中已經(jīng)證實的靶基因形成靶基因集合用于后續(xù)分析。

1.7 KEGG分析

用KEGG(http://www.genome.jp/kegg/)數(shù)據(jù)庫對miR-539靶基因集合進行信號轉(zhuǎn)導通路分析。

1.8 GEPIA分析靶基因集合在乳腺癌和正常組織中表達差異

采用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)分析miR-539靶基因集合在浸潤性乳腺癌和正常乳腺組織中的表達差異。

2 結(jié)果

2.1 miR-539在乳腺癌細胞系中的表達

圖1 qPCR檢測乳腺癌細胞系中miR-539的表達

定量PCR實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-539在ZR-75-30、MDA-MB-231、MCF-7和T-47D四種乳腺癌細胞中均有表達,且在ZR-75-30細胞中表達量最高,在其它三種細胞的表達量相對較低(見圖1)。

2.2 miR-539抑制MCF-7遷移

Transwell結(jié)果表明,在MCF-7細胞中,相對于對照組,過表達miR-539-mimics顯著地抑制MCF-7遷移,過表達miR-539 inhibitor則促進MCF-7遷移(圖2)。

圖2 miR-539抑制MCF-7細胞遷移

2.3 miR-539的保守性分析

利用miRBase數(shù)據(jù)庫下載了10個物種的miR-539的成熟序列,利用MEGA7.0軟件分析其保守性,結(jié)果如圖3所示。miR-539的成熟序列均是22個堿基,且堿基基本完全一致(綿羊和馬除外),miR-539成熟序列在脊椎動物中具有高度的保守性。

2.4 miR-539的靶基因預(yù)測

采用TargetScan7.1、RNA22-HSA及MIRDB預(yù)測了miR-539靶基因,數(shù)量分別為6268、4674、547個,對3種預(yù)測方法的結(jié)果數(shù)據(jù)取交集后共獲得172個靶基因。miTarbase數(shù)據(jù)庫中記錄的經(jīng)雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灐estern blot和qPCR方法證實的miR-539靶基因共有2個(Twist1和ZEB1),合計共獲得174個靶基因用于后續(xù)的基因注釋和通路富集分析(見圖4)。

2.5 miR-539的預(yù)測靶基因的KEGG分析

miRNA的眾多靶基因通常情況下會協(xié)同調(diào)控細胞信號通路。為了深入了解分析miR-539預(yù)測的靶基因和集中的174個基因,本研究采用KEGG經(jīng)典通路數(shù)據(jù)庫對miR-539的靶基因集合進行了信號通路富集分析。表1結(jié)果表明,miR-539的靶基因顯著富集于RNA降解、雌激素信號通路等信號通路(P<0.01)。

表1 miR-539靶基因集合的KEGG富集分析

2.6 miR-539靶基因集合在乳腺癌中表達差異分析

GEPIA可用于分析來自TCGA和GTEx的9 736個腫瘤和8 587個正常樣本的RNA測序表達數(shù)據(jù)[10]。本研究利用GEPIA分析了miR-539靶基因集合在乳腺癌和正常乳腺組織中的表達,其中28個靶基因在乳腺癌中低表達(見圖5A),14個靶基因在乳腺癌中高表達(見圖5B),這42個基因可能與乳腺癌發(fā)生密切相關(guān)。

圖5 GEPIA分析miR-539靶基因集合在乳腺癌和正常組織中的表達。相對于乳腺正常組織,在乳腺癌組織低表達的基因(A)和高表達的基因(B)

3 討論

miR-539定位在人的14號染色體,已有文獻報道m(xù)iR-539在前列腺癌[6]、肝癌[7]、非小細胞肺癌[8]的發(fā)生發(fā)展過程中均發(fā)揮著重要的作用。本研究檢測了miR-539在4種乳腺癌細胞系中的表達,并且遷移實驗結(jié)果證明miR-539抑制乳腺癌細胞的遷移,表明miR-539可能具有抑制乳腺癌發(fā)生的作用。

microRNAs發(fā)揮功能是通過調(diào)控靶基因的表達來實現(xiàn)的,因此,找到microRNA的靶基因非常重要,但是microRNAs的靶基因?qū)ふ覅s非易事[11]。本研究通過多種生物學軟件對miR-539的靶基因進行了預(yù)測,共獲得174個靶基因,且這些基因主要參與細胞轉(zhuǎn)運、RNA聚合酶啟動子轉(zhuǎn)錄的正調(diào)節(jié)等生物學過程,為miR-539的功能研究提供了基礎(chǔ)。

乳腺癌分為激素依賴型和非激素依賴型,在激素依賴型乳腺癌細胞中,雌激素通過雌激素受體促進乳腺上皮細胞增殖,進而促進雌激素受體陽性的乳腺癌細胞的生長[12],本研究通過對miR-539的靶基因集合進行了KEGG信號通路分析,結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-539主要富集在雌激素信號通路,由此推測miR-539的功能與乳腺癌發(fā)生密切相關(guān)。

通過分析174個靶基因在TCGA和GTEx樣本中轉(zhuǎn)錄過程發(fā)現(xiàn),與正常組織相比,乳腺癌組織中的GBRC5B、MAP1B等28個基因低表達,HNRNPF、TMEM等14個基因高表達基因,縮小了乳腺癌發(fā)生過程中miR-539的調(diào)控靶基因的范圍,為闡明miR-539在乳腺癌發(fā)生中調(diào)控機制奠定了基礎(chǔ)。