基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的積雪草酸治療IA1期宮頸癌治療機制的研究

張軍丹,秦海霞,張運峰,李華偉

(1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 婦產(chǎn)科,河南 新鄉(xiāng) 453100;2.唐山師范學(xué)院 生命科學(xué)系,河北 唐山 063000;3.唐山師范學(xué)院 科研處,河北 唐山 063000)

宮頸癌是女性常見的惡性腫瘤之一,2020年全球女性宮頸癌新發(fā)60.4萬例[1]。宮頸癌延遲診治可對預(yù)后產(chǎn)生不利影響,因此癌前病變和宮頸癌早期階段的識別和診治至關(guān)重要。IA1期宮頸癌的診治對女性生育能力至關(guān)重要[2],研究IA1期宮頸癌的核心靶點對指導(dǎo)后期藥物開發(fā)具有重要意義。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以系統(tǒng)生物學(xué)理論為指導(dǎo),綜合生物信息學(xué)、多向藥理學(xué)、計算機科學(xué)等多學(xué)科技術(shù),系統(tǒng)研究藥物和疾病之間的相互作用[3]。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的拓撲分析與生物學(xué)中多途徑、多靶點、系統(tǒng)調(diào)控的特點相符,已成為藥物開發(fā)的新工具[4],在天然植物功能性成分靶點篩選和作用機制研究方面應(yīng)用廣泛[5]。

積雪草酸(Asiatic acid)是中草藥積雪草的功能成分,屬游離三萜酸,可通過p53/FAK信號通路抑制舌鱗癌細胞的增殖、遷移和侵襲[6],誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡[7]。積雪草酸對不同癌癥類型的作用機制存在差異,研究積雪草酸對IA1期宮頸癌的作用靶點,有助于弄清作用機制,指導(dǎo)藥物設(shè)計和開發(fā)。

1 村料與方法

1.1 作用靶點收集

以“Asiatic acid”(積雪草酸)為關(guān)鍵詞,在Pubchem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)、ETCM(http://www.tcmip.cn/ETCM/index.php/Home/Index/)、Super-PRED(https://prediction.charite.de/)和SwissTargetPrediction(http://www.swisstargetprediction.ch/)數(shù)據(jù)庫中,檢索積雪草酸的作用靶點,去除重復(fù)項,用String數(shù)據(jù)庫(https://cn.string-db.org/)對靶點進行標準化處理。

1.2 差異表達基因篩選

在GEO數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中,以“Cervical Cancer”(宮頸癌)為關(guān)鍵詞進行檢索與篩選數(shù)據(jù)集,經(jīng)GEO2R分析,獲得差異表達基因。

1.3 藥物作用與IA1期宮頸癌的靶基因交集

在Venny(https//bionfogp.cnb.csic.es/tools/venny/indx.html)數(shù)據(jù)庫中對積雪草酸靶點和宮頸癌差異基因相互映射,得到積雪草酸治療IA1期宮頸癌的潛在靶點集。

1.4 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將靶基因交集載入String數(shù)據(jù)庫,選擇Homo sapiens,獲得PPI網(wǎng)絡(luò),分析網(wǎng)絡(luò)的整體效果。

1.5 GO功能分析及KEGG通路分析

將靶點交集載入DAVID數(shù)據(jù)庫(https://david.ncice.gov/home.jsp)進行GO(gene ontology)功能分析和KEGG通路分析。

1.6 調(diào)控機制網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析

建立化合物、信號通路、治療IA1期宮頸癌潛在靶點的節(jié)點屬性表,導(dǎo)入Cytoscape3.10.1軟件中,建立“化合物-通路-疾病靶標”網(wǎng)路。

1.7 分子對接

選擇“化合物-通路-疾病靶標”網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點與積雪草酸進行分子對接,利用RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(htt://www.rcsb.org)獲取核心靶點的PDB結(jié)構(gòu),從Pubchem數(shù)據(jù)庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov)中獲取積雪草酸的PDB結(jié)構(gòu),利用AutoDock Tools1.5.6軟件完成分子對接驗證。

2 結(jié)果與分析

2.1 積雪草酸與IA1期宮頸癌相關(guān)靶點篩選

從Pubchem、ETCM、Super-PRED和SwissTargetPrediction共檢索獲得667個積雪草酸作用靶點,在GEO數(shù)據(jù)庫獲得宮頸癌數(shù)據(jù)集GSE223804(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gds/?term=GSE223804),以正常宮頸細胞為對照(n=2),IA1期宮頸癌細胞為處理(n=4),經(jīng)GEO2R分析,獲得998個差異表達基因。對積雪草酸靶點與IA1期宮頸癌差異表達基因取交集,共獲得60個靶點交集。

2.2 GO功能富集分析

靶點交集的GO功能富集分析結(jié)果表明,60個靶點顯著富集于50個生物過程(Biological Process,BP)、23個細胞組分(Cellular Component,CC)和28個分子功能(Molecular Function,MF),TOP 10如圖1所示。生物過程主要涉及細胞增殖負調(diào)控過程(negative regulation of cell proliferation)、免疫反應(yīng)過程(immune response)和G蛋白偶聯(lián)受體信號通路(G-protein coupled receptor signaling pathway),細胞組分主要為:細胞膜(plasma membrane)、細胞核(nucleus)和膜固有組分(integral component of membrane),主要分子功能有離子鋅結(jié)合(zinc ion binding)、金屬離子結(jié)合(metal ion binding)、ATP結(jié)合(ATP binding)和血紅素結(jié)合(heme binding)。以上結(jié)果表明,與IA1期宮頸癌相關(guān)的交集靶點可在不同細胞組分,通過多種生物學(xué)過程,發(fā)揮不同分子功能。

圖1 積雪草酸治療宮頸癌關(guān)鍵靶點的GO富集分析

2.3 KEGG通路分析

對交集靶點進行KEGG通路分析共得到30條信號通路,對前20條信號通路用桑基氣泡圖進行可視化,如圖2所示。積雪草酸治療宮頸癌所涉及的生物學(xué)通路主要包括炎癥性腸病(Inflammatory bowel disease)、人巨細胞病毒感染(Human cytomegalovirus infection)、TNF信號通路(TNF signaling pathway)、NF-κB信號通路(NF-kappa B signaling pathway)、脂質(zhì)和動脈粥樣硬化(Lipid and atherosclerosis)和Toll樣受體信號通路(Toll-like receptor signaling pathway)等。

圖2 交集靶點的KEGG通路富集注:根據(jù)q值排序,值越小,顏色越紅,則富集程度越高;氣泡越大、count值越大

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)

將60個交集靶點載入String蛋白數(shù)據(jù)庫,評定靶點間的連接性能。物種選定Homosampine,設(shè)定中等強度置信區(qū)間(0.4),進行蛋白互作分析,去除孤立靶點,得到PPI網(wǎng)絡(luò)(圖3)。結(jié)果顯示,60個靶點,125條邊,平均節(jié)點度值4.17,平均局部聚類系數(shù)0.517,期望邊值為41,PPI富集值P<1.0e-16,網(wǎng)絡(luò)相互作用顯著。從圖3中可以看出,連線較多的節(jié)點主要包括CCL2、CXCL8、IL1B、TLR4以及SMAD3等。

圖3 蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 積雪草酸調(diào)控IA1期宮頸癌潛在機制網(wǎng)絡(luò)圖注:圓形代表靶點,菱形代表信號通路,圖形大小代表相應(yīng)度值,中心為積雪草酸,顏色越深,表示成為核心靶點的可能性越大

2.5 調(diào)控機制網(wǎng)絡(luò)圖

將化合物、交集靶點、信號通路建立節(jié)點屬性表,載入Cytoscape,去除孤立靶點,得到積雪草酸治療IA1期宮頸癌潛在機制圖(圖4),利用Network Analysis工具進行拓撲學(xué)分析,以大于靶點度值中位數(shù)2倍為篩選標準,獲得積雪草酸調(diào)控IA1期宮頸癌的核心靶點為:TLR4、CCL2、IL1B、CXCL8。

2.6 積雪草酸與核心靶點對接驗證

小分子化合物與蛋白大分子結(jié)合能小于0,且結(jié)合能越低,結(jié)合的可能性越大。利用AutoDock Tools1.5.6軟件對核心靶點TLR4、CCL2、IL1B、CXCL8與積雪草酸進行分子對接(圖5)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),4個核心靶點與積雪草酸的結(jié)合自由能分別為:-7.2、-6.4、-8.7和-6.0 kcal/mol,說明受體蛋白和積雪草酸可以形成穩(wěn)定復(fù)合物。積雪草酸與TLR4中的氨基酸殘基ASN-579、GLY-617、CYS-609、GLU-608形成氫鍵;與CCL2中的氨基酸殘基CYS-34形成氫鍵;與IL1B中的氨基酸殘基LEU-74、MET-77、VAL-79形成氫鍵;與CXCL8中的氨基酸殘基LYS-50形成氫鍵。上述結(jié)果提示這些核心靶點在積雪草酸治療IA1期宮頸癌過程中發(fā)揮重要作用,是積雪草酸治療IA1期宮頸癌的重要靶標。

A B

C D圖5 積雪草酸與核心靶點分子對接(A)TLR4、(B)CCL2、(C)IL1B和(D)CXCL8

3 討論和結(jié)論

利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)了60個積雪草酸與IA1期宮頸癌的交集靶點,多分布在細胞膜、細胞核、膜固有組分等位置,通過結(jié)合鋅離子、ATP、血紅素發(fā)揮功能,主要涉及細胞增殖負調(diào)控過程、免疫反應(yīng)過程、G蛋白偶聯(lián)受體信號通路等生物過程,與炎癥因子、免疫抵抗、細胞應(yīng)激、血管內(nèi)皮損傷和免疫細胞活化等相關(guān)[8-10]?！盎衔?通路-疾病靶標”網(wǎng)絡(luò)分析和分子對接驗證結(jié)果發(fā)現(xiàn),IL1B、TLR4、CXCL8和CCL2等4個核心靶點在促炎、免疫逃逸、激活免疫過程和細胞浸潤中發(fā)揮重要作用。血液單核細胞和組織巨噬細胞在急性和慢性炎癥中產(chǎn)生的IL1B,促進腫瘤發(fā)生[11]。宮頸癌進一步誘導(dǎo)單核細胞產(chǎn)生IL1B,而高表達IL1B的腫瘤患者通常預(yù)后不良、總生存期較短[12]。TLR4可能與Foxp3聯(lián)合促進IA1期宮頸癌免疫逃逸[13]。CXCL8則通過調(diào)節(jié)基質(zhì)金屬蛋白酶MMP2和MMP9的分泌,促進癌細胞的浸潤、遷移和轉(zhuǎn)移[14]。趨化因子CCL2吸引和激活單核細胞、巨噬細胞及其它炎癥相關(guān)細胞,參與調(diào)節(jié)炎癥和免疫細胞的遷移,向巨噬細胞中添加CCL2可以增強其抗腫瘤活性[15]。周圍神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)膠質(zhì)細胞分泌CCL2能招募單核細胞、樹突狀細胞、自然殺傷細胞[16],促進神經(jīng)元興奮性和神經(jīng)修復(fù)[17],調(diào)節(jié)宮頸癌的神經(jīng)浸潤[18]。鑒于4個核心靶點的復(fù)雜生物過程,研究積雪草酸對四個核心靶點的調(diào)控作用時,需要注意用法、用量和聯(lián)合用藥。