星狀風(fēng)毛菊藥材分析及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

馬家麟 ，王 碩 ，陳 濤 ，宋 霞 ，喬亞玲 ，杲秀珍 ，申 誠 ，海 平 ，李玉林

（1.中國科學(xué)院西北高原生物研究所，青海 西寧 810001；2.青海省藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院 中藥（藏藥）質(zhì)量控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海省中藥（藏藥）現(xiàn)代化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016）

星狀風(fēng)毛菊為菊科鳳毛菊屬植物星狀風(fēng)毛菊（Saussurea stellaMaxim.）的干燥全草，又名星狀雪兔子，藏文名為“蘇爾公瑪?！盵1-2]，主要分布于青海、西藏、甘肅、四川、云南省及自治區(qū)，生長于海拔2 500～5 400 m 的高山草甸、河邊或沼澤草地.星狀風(fēng)毛菊是藏區(qū)較常用的藏藥材，性味苦，微寒，具有清熱利濕、解毒、接骨、消炎止血的功效，主要用于治療中毒性熱癥、跌打損傷、骨折、創(chuàng)傷化膿等癥狀[3-5].

在《青海植物志》中對(duì)星狀風(fēng)毛菊僅載有形態(tài)和資源分布，文獻(xiàn)調(diào)研僅有少量關(guān)于其理化鑒別項(xiàng)、化學(xué)成分研究，究其原因是相關(guān)基礎(chǔ)研究較少，缺乏質(zhì)控指標(biāo)，難以制訂完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，嚴(yán)重影響星狀風(fēng)毛菊藥材的開發(fā)利用.因此，本研究以星狀風(fēng)毛菊為對(duì)象，通過對(duì)藥材性狀、粉末顯微特征、薄層色譜鑒別、檢查（水分、灰分、醇溶性浸出物）和含量測(cè)定5 項(xiàng)內(nèi)容進(jìn)行深入研究，找到檢驗(yàn)該藥材的專屬性方法，制定合理的限度，對(duì)星狀風(fēng)毛菊藥材質(zhì)量進(jìn)行有效的控制提供方法和依據(jù).

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

梅特勒-托利多AG135 精密電子天平（梅特勒-托利多儀器上海有限公司）；CAMAG 薄層點(diǎn)樣和成像系統(tǒng)（瑞士卡瑪公司）；Shimadzu LC-2030C 高效液相色譜儀（日本島津公司）；PDA 檢測(cè)器（日本島津公司）；Axio IMAGE Z2 光學(xué)顯微鏡（德國ZISSI公司）；DZKW-4 電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業(yè)）；SX2-4-10 馬弗爐（上海實(shí)驗(yàn)儀器廠）.

星狀風(fēng)毛菊來自青海、四川省，樣品信息如表1所列.經(jīng)中國科學(xué)院西北高原生物研究所孫菁研究員鑒定11 批樣品均為菊科鳳毛菊屬植物星狀風(fēng)毛菊Saussurea stellaMaxim.干燥全草.綠原酸對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110753-202018）；硅膠G 薄層板（上海麥克林）；甲醇為色譜純（市售）；其余試劑為分析純（市售）；水為超純水.

表1 星狀風(fēng)毛菊藥材采集信息Table 1 Sample collection informations of Saussurea stella Maxim.

1.2 薄層鑒別

對(duì)照品溶液配制：精密稱取綠原酸對(duì)照品10.0 mg，置于10 mL 容量瓶中，加甲醇超聲溶解后定容，即得對(duì)照品溶液（1.0 mg/mL）.

供試品溶液配制：取本品粉末約1.0 g，加50%乙醇50 mL 置于熱水浴中熱回流1 h，過濾，濾液減壓濃縮蒸干，精密加入5 mL 甲醇溶解即得.

在室溫、相對(duì)濕度70%條件下，依照《中華人民共和國藥典》四部2020 年版通則0502[6]薄層色譜法，分別量取對(duì)照品溶液及供試品溶液5 μL，點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水（體積比10∶6∶1∶2）為展開劑展開，取出晾干后，噴以含1%亞硝酸鈉的甲醇溶液，105 ℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光下檢視.

1.3 水分、總灰分、浸出物檢查

精密稱定各批次星狀風(fēng)毛菊藥材粉末2.0 g，平行試驗(yàn)2 份，依照《中華人民共和國藥典》四部2020 年版通則0832[6]烘干法測(cè)定11 批藥材水分；依照2302 總灰分測(cè)定法測(cè)定11 批藥材總灰分；依照2201 熱浸法，以45%乙醇為溶劑測(cè)定11 批藥材浸出物含量.

1.4 綠原酸含量測(cè)定

1.4.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack GIST C18（4.5 mm×260 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇為A 相，0.1%乙酸-水為B 相；分離條件：A∶B（體積比為25∶75）；流速：1.0 mL/min；檢測(cè)波長：326 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL.

1.4.2 對(duì)照品溶液配制

精密稱取綠原酸對(duì)照品10.0 mg，置于10 mL容量瓶中，加甲醇超聲溶解后定容，即得對(duì)照品儲(chǔ)備液（1.0 mg/mL）.

1.4.3 供試品溶液配制

精密稱定本品粉末（過5 號(hào)篩）1.0 g，置于具塞錐形瓶，精密加入50%乙醇50 mL，稱定重量，置于水浴中加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用50%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過0.45 μm 濾膜后待測(cè).

2 結(jié)果與討論

2.1 定性鑒別

2.1.1 性狀鑒別

星狀風(fēng)毛菊原植物及藥材性狀如圖1 所示.藥材根圓柱形，表皮黃褐色，斷面灰白色，有少量須根.幾乎無莖，葉皺縮，呈褐色，完整葉呈披針形，葉基部紫紅色，無毛.頭狀花序呈紫紅色，在蓮座狀葉叢中密集成半球形.瘦果，表面黑色.冠毛淡褐色，外層較短，糙毛狀，長約0.3～0.6 cm，內(nèi)層羽毛狀，長約0.8～1.3 cm.花果期為每年7～9 月.氣微，味微苦.

圖1 星狀風(fēng)毛菊性狀鑒別圖（a）原植物形態(tài)，（b）藥材性狀Fig.1 Photos of Saussurea stella Maxim.(a) original plant morphology, (b) medicinal materials properties

2.1.2 顯微鑒別

通過光學(xué)顯微鏡，觀察星狀風(fēng)毛菊藥材粉末樣品的結(jié)構(gòu)特征，其顯微特征如圖2 所示.由圖2 可見，本品粉末呈棕褐色.花粉粒呈橢圓形或圓球形，外壁有短刺及疣狀雕紋，萌發(fā)孔3 個(gè).導(dǎo)管短，多為環(huán)紋.非腺毛，單細(xì)胞.纖維成束，壁平直，含有草酸鈣方晶.木栓細(xì)胞較多，呈類長方形.淀粉團(tuán)充滿細(xì)小淀粉粒.長管道狀分泌細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)充滿棕色物.表皮細(xì)胞呈長方形或多角形，均有氣孔.

圖2 星狀風(fēng)毛菊顯微特征圖（a）花粉粒，（b）環(huán)紋導(dǎo)管，（c）非腺毛，（d）纖維束，（e）木栓細(xì)胞，（f）淀粉團(tuán)，（g）長管道狀分泌細(xì)胞，（h）表皮細(xì)胞Fig.2 Microscopic characteristics images of Saussurea stella Maxim.(a) pollen grain, (b) annular vessel, (c) non-glandular hair, (d) fiber bundle, (e) cork cell, (f) starch granule,(g) secretory cell, (h) epidermal cell

2.1.3 薄層鑒別

按1.2 項(xiàng)下薄層鑒別方法進(jìn)行分析，其結(jié)果如圖3 所示.可見供試品、綠原酸對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同的黃色斑點(diǎn)，且分離度高.

圖3 星狀風(fēng)毛菊TLC 鑒別圖譜（S1～S11）供試品，（A）綠原酸對(duì)照品Fig.3 TLC identification of Saussurea stella Maxim.(S1～S11) test samples, (A) reference substance of chlorogenic acid

2.2 水分、灰分、浸出物測(cè)定

本試驗(yàn)分別按照《中華人民共和國藥典》2020年版[6]水溶性浸出物、醇溶性（45%、稀乙醇、70%）浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的冷浸法、熱浸法（附錄XA）測(cè)定浸出物.相比于冷浸法，熱浸法測(cè)定星狀風(fēng)毛菊浸出物效果更佳，因此采用熱浸法提取.最終試驗(yàn)結(jié)果表明，浸出物含量：45%乙醇浸出物＞水溶性浸出物＞稀乙醇浸出物＞70%乙醇浸出物.因此采用醇溶性浸出物測(cè)定法項(xiàng)下的熱浸法測(cè)定藥材浸出物.

11 批藥材水分、灰分、浸出物測(cè)定結(jié)果如表2所列.根據(jù)測(cè)定結(jié)果并結(jié)合《中華人民共和國藥典》2020 年版中藥材的標(biāo)準(zhǔn)，水分、總灰分均以平均值的120%設(shè)限，浸出物以平均值的80%設(shè)限，擬定星狀風(fēng)毛菊藥材水分含量不得大于10.0%，灰分含有量均不得大于11.0%，醇溶性浸出物含有量不得小于16.0%.

表2 星狀風(fēng)毛菊水分、灰分、浸出物和綠原酸含量測(cè)定結(jié)果Table 2 Determination results of water content, total ash,ethanol soluble extractives and chlorogenic acid/（%，n=2）

2.3 綠原酸含量測(cè)定

2.3.1 條件優(yōu)化

經(jīng)文獻(xiàn)調(diào)研，國內(nèi)外針對(duì)星狀風(fēng)毛菊展開的研究較少，現(xiàn)有資料表明，星狀風(fēng)毛菊主要含有黃酮、黃酮醇、木質(zhì)素、酚醛等多類成分[7-11]，但對(duì)其主要有效成分的研究未見報(bào)道.前期研究表明，星狀風(fēng)毛菊全草乙醇浸提物用石油醚-乙酸乙酯-正丁醇萃取后由高效液相色譜儀（HPLC）檢測(cè)顯示化合物A、B 含量較高（如圖4 所示），經(jīng)核磁共振法鑒定以及文獻(xiàn)對(duì)比，確定化合物A、B 分別為洋薊素和綠原酸.現(xiàn)代藥理學(xué)研究綠原酸具有抗菌、抗病毒、利肝膽、抗腫瘤等作用[12-13]，而且對(duì)于創(chuàng)傷的治愈、潤滑關(guān)節(jié)、防止炎癥等有治療效果[14-15]，這與星狀風(fēng)毛菊清熱利濕、解毒、接骨、消炎止血的功效相吻合.因此，本標(biāo)準(zhǔn)以綠原酸為指標(biāo)成分考察星狀風(fēng)毛菊藥材質(zhì)量具有合理性.

圖4 星狀風(fēng)毛菊正丁醇相HPLC 色譜圖（A）洋薊素，（B）綠原酸Fig.4 HPLC chromatogram of n-butanol fraction of Saussurea stella Maxim.(A) cynarin, (B) chlorogenic acid

本試驗(yàn)對(duì)星狀風(fēng)毛菊藥材提取條件進(jìn)行了優(yōu)化，分別測(cè)試了提取溶媒（40%～80%乙醇溶液）、提取方式（冷浸法、超聲提取法、加熱回流法）和提取時(shí)間（30、45、60、90 min）對(duì)綠原酸提取效率的影響，試驗(yàn)結(jié)果如圖5 所示.最終選擇提取溶劑為50%乙醇，熱回流提取方法，加熱回流60 min 進(jìn)行提取.

圖5 綠原酸提取方法考察（a）提取溶劑，（b）提取方式，（c）提取時(shí)間Fig.5 Study on extraction methods of chlorogenic acid(a) extraction solutions, (b) extraction methods, (c) extraction times

2.3.2 系統(tǒng)適用性

精密吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液進(jìn)行測(cè)定.結(jié)果如圖6 所示.結(jié)果表明，試樣中綠原酸與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，對(duì)稱因子在0.95～1.05區(qū)間內(nèi)，峰形對(duì)稱，理論塔板數(shù)≥8 000，符合藥典相關(guān)規(guī)定.

圖6 HPLC 色譜圖（a）對(duì)照品溶液，（b）供試品溶液，（1）綠原酸Fig.6 HPLC chromatograms(a) reference solution, (b) sample solution, (1) chlorogenic acid

2.3.3 線性關(guān)系考察

精密量取不同體積對(duì)照品溶液用甲醇稀釋并配制成系列濃度對(duì)照品工作液，質(zhì)量濃度分別為1.00、50.0、100、200、500 μg/mL.精密吸取對(duì)照品工作液各10 μL，注入HPLC 測(cè)定.以綠原酸質(zhì)量濃度X（μg/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積Y為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程為Y=307 03X?116 887（R2=0.999 6，n=6）.結(jié)果表明，在1.00～500 μg/mL 范圍內(nèi)綠原酸質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好.

2.3.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取1.4.2 項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μL，注入HPLC 中測(cè)定，連續(xù)進(jìn)樣6 次.測(cè)得綠原酸峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.12%（n=6），表明儀器精密度良好.

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取樣品粉末（S11）6 份，按1.4.3 項(xiàng)下方法配制供試品溶液，測(cè)得供試品溶液中綠原酸含量均值為1.34%，RSD 為0.15%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好.

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一份供試品溶液（S11）置于室溫，分別在0、2、4、8、12、24 h 進(jìn)行測(cè)定，綠原酸峰面積RSD 為0.19%（n=6），表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定.

2.3.7 加樣回收試驗(yàn)

采用加樣回收法，精密稱定已知含量的星狀風(fēng)毛菊藥材粉末（S11）0.5 g，平行9 份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入含有0.3、0.6、0.9 倍綠原酸的對(duì)照品溶液，按1.4.3 項(xiàng)下方法配制供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定并計(jì)算回收率.結(jié)果如表3 所列，3 個(gè)添加水平的平均回收率在97.6%～98.7%范圍內(nèi)，表明試驗(yàn)回收率良好，準(zhǔn)確度高，符合藥典要求.

表3 綠原酸的回收率Table 3 Recoveries of chlorogenic acid

2.3.8 含量測(cè)定

取11 批樣品（S1～S11），按1.4.3 項(xiàng)下方法制備供試品溶液.精密吸取供試品溶液和對(duì)照品溶液各10 μL，按1.4.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定.測(cè)定結(jié)果如表2 所列，11 批星狀風(fēng)毛菊中綠原酸含量的測(cè)定結(jié)果均值為0.65%，按《中華人民共和國藥典》2020 年版規(guī)定將均值的80%擬為含量限度，即本品按干燥品計(jì)算，含綠原酸不低于0.50%.

3 結(jié)論

本試驗(yàn)通過對(duì)青海、四川省多個(gè)采樣點(diǎn)星狀風(fēng)毛菊藥材進(jìn)行性狀描述、顯微鑒別及薄層色譜鑒別，可知該藥材性狀及顯微鑒別特征較為明顯，薄層色譜圖斑點(diǎn)清晰，分離度高，可作為星狀風(fēng)毛菊藥材定性鑒別的依據(jù).通過對(duì)星狀風(fēng)毛菊藥材水分、灰分及浸出物測(cè)定，初步確定各項(xiàng)限量.通過所建立的綠原酸含量測(cè)定方法，初步確定星狀風(fēng)毛菊藥材指標(biāo)性化學(xué)成分及限量要求，為民族藥星狀風(fēng)毛菊藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定及進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ).