超聲萃取-氣相色譜法測定擬南芥種子中脂肪酸含量

宜原原，羅 云，阮梅林，雷 敏

（華中科技大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，湖北 武漢，430074）

油料作物中脂肪酸主要包括棕櫚酸（C16:0）、硬脂酸（C18:0）、油酸（C18:1）、亞油酸（C18:2）、亞麻酸（C18:3）等[1-5]，具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，可加工成食用油及工業(yè)用油，是潛在的可再生能源.因此，利用遺傳多樣性及生物技術(shù)途徑，對主要油料作物進(jìn)行脂肪酸組成的全方位改良和培育含特種脂肪酸的油料作物品種，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)[6-7].

在這些研究中，脂肪酸含量和組成是評價(jià)油料作物含油量及其營養(yǎng)價(jià)值的重要指標(biāo)之一[1].擬南芥作為模式植物，在很多植物科學(xué)領(lǐng)域脂肪酸的研究中具有領(lǐng)銜地位.研究擬南芥種子中脂肪酸的代謝調(diào)控機(jī)制，有助于揭示植物種子脂肪酸積累的普遍機(jī)制，為油料作物分子育種提供基因資源和理論基礎(chǔ)，并指導(dǎo)油料作物育種實(shí)踐[8].為了加快擬南芥種子以及油料作物中脂肪酸代謝調(diào)控研究進(jìn)程，提高脂肪酸檢測效率是十分必要的.完整種子甲酯化氣相色譜法（whole seed transmethylation-GC, WSTGC）是一種被廣泛用于測定擬南芥種子中脂肪酸組成的方法[9-10]，但是該方法脂肪酸萃取時(shí)間相對較長.近年來，一些萃取效率高、萃取速度快的技術(shù)應(yīng)用廣泛，如微波輔助萃取[11]、加速溶劑萃取[12]、超聲萃取[13-14]等.其中超聲萃取法無需用到復(fù)雜的前處理設(shè)備，方便快捷，且超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)、熱效應(yīng)等可加速目標(biāo)物質(zhì)的運(yùn)動(dòng)，因而更適用于固體介質(zhì)的提取.

本文以擬南芥種子為研究對象，在WST-GC 的基礎(chǔ)上，聯(lián)合了超聲萃取法，通過優(yōu)化超聲萃取條件、氣相色譜檢測條件，建立超聲萃取-氣相色譜測定擬南芥種子中脂肪酸含量的分析方法，并將新建的方法應(yīng)用于油菜籽、花生、大豆作物中脂肪酸含量的測定.該方法簡單、快速，為高效準(zhǔn)確地測定擬南芥種子及部分油料作物中脂肪酸含量提供了方法指導(dǎo).

1 儀器設(shè)備及材料方法

1.1 儀器設(shè)備

氣相色譜儀：Agilent 6850 GC；超聲波儀：KS-7200DF，昆山市潔力美超聲儀器有限公司；氮吹儀：ZG 系列干式氮吹儀，上海梓桂儀器有限公司.

1.2 材料及試劑

擬南芥種子、油菜籽：由華中科技大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院環(huán)境資源微生物技術(shù)研究所提供.花生、大豆：市售，粉碎后備用.甲醇、甲苯：色譜純，德國Merck 公司；二丁基羥基甲苯：分析純，德國Merck 公司；正己烷、石油醚、二氯甲烷：色譜純，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；石油醚：農(nóng)殘級，沸程40～60 ℃，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；硫酸（H2SO4）、無水硫酸鈉、氫氧化鉀：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司.脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品（25 mg/支）及十九烷酸甲酯（100 mg/支）：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司.

1.3 優(yōu)化后的色譜條件

檢測器：氫火焰離子化檢測器（FID）；載氣：氮?dú)?；色譜柱：Agilent DB-23（60 m×0.25 mm，0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度：280 ℃；進(jìn)樣體積：1 μL；分流比：1∶50；柱溫箱升溫程序：50 ℃，1 min，25 ℃/min 到175 ℃，2 min，3.5 ℃/min 到230 ℃，5 min；檢測器氣體流速：氫氣為30 mL/min，空氣為400 mL/min，尾吹氣為30 mL/min.

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取十九烷酸甲酯100 mg 至5 mL 容量瓶中，加入正己烷定容至刻度線，溶解后即得到質(zhì)量濃度為20 mg/mL 的十九烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)溶液.

脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：準(zhǔn)確稱取脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)品25 mg 至5 mL 容量瓶中，加入正己烷定容至刻度線，溶解后得到質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液.

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液的配制：用移液槍分別移取脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液0.8、0.4、0.2、0.1、0.04 mL，加入10 μL 內(nèi)標(biāo)溶液，用正己烷定容至1 mL，得到質(zhì)量濃度分別為4.0、2.0、1.0、0.5、0.2 mg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液.

2 結(jié)果與討論

2.1 試驗(yàn)條件的優(yōu)化

稱取5 mg 擬南芥種子，加入1.5 mL 2.5%的H2SO4甲醇溶液（含0.01%二丁基羥基甲苯）、0.6 mL 甲苯溶液和10 μL 十九烷酸甲酯內(nèi)標(biāo)溶液.在一定溫度下進(jìn)行超聲甲酯化，取出冷卻后依次加入1.8 mL 超純水、1.0 mL 萃取劑混勻，室溫靜置萃取一定時(shí)間后，4 000 r/min 離心5 min，吸取全部上層液體，用無水硫酸鈉除水，高純氮?dú)獯蹈?，加適量萃取劑溶解后定容至1 mL，用0.22 μm 有機(jī)相濾膜過濾至進(jìn)樣瓶中，采用氣相色譜儀對其進(jìn)行分析測試.采用單因素試驗(yàn)方法[15]，分別探究甲酯化超聲時(shí)間、甲酯化超聲加熱溫度、甲酯化超聲功率、靜置萃取時(shí)間、萃取劑種類對甲酯化效率或萃取效率的影響.

2.1.1 甲酯化超聲時(shí)間

在甲酯化超聲加熱溫度為90 ℃、超聲功率為400 W、靜置萃取時(shí)間為1.5 h、萃取劑為正己烷的條件下，對比不同甲酯化超聲時(shí)間對酯化效率的影響[16].檢測到擬南芥種子中有11 種脂肪酸，分別為C16:0（棕櫚酸）、C18:0（硬脂酸）、C18:1n9t（反油酸）、C18:1n9c（油酸）、C18:2n6c（亞油酸）、C18:3n3（α-亞麻酸）、C20:0（花生酸）、C20:1n9（順-11-二十碳烯酸）、C20:2（順-11, 14-二十碳二烯酸）、C20:3n3（順-11, 14, 17-二十碳三烯酸）、C22:1n9（芥酸）.設(shè)定超聲時(shí)間為60 min 時(shí)，各脂肪酸酯化效率為100%.采用面積歸一化法，計(jì)算其他條件相對該條件的酯化效率.對各條件下11 種脂肪酸的相對酯化效率平均值進(jìn)行比較，結(jié)果如圖1 所示.由圖1 可知，在超聲時(shí)間為30 min 時(shí)，酯化效率達(dá)到最高，為104%.說明超聲加熱30 min 即可滿足試驗(yàn)需求，因此選擇超聲加熱時(shí)間為30 min.

圖1 不同甲酯化超聲時(shí)間下的相對酯化效率Fig.1 Relative methylation efficiencies at different ultrasonic times

2.1.2 甲酯化超聲加熱溫度

在甲酯化超聲功率為400 W、超聲加熱時(shí)間為30 min、靜置萃取時(shí)間1.5 h、萃取劑為正己烷的條件下，僅改變加熱溫度，檢測擬南芥種子中的脂肪酸酯化效率.設(shè)定超聲加熱溫度為90 ℃時(shí)，各脂肪酸酯化效率為100%.采用面積歸一化法，計(jì)算其他加熱溫度下的相對酯化效率，結(jié)果如圖2 所示.從圖中可以看出，在加熱溫度為0～90 ℃范圍內(nèi)時(shí)，隨著溫度的增加，酯化效率逐漸增加.加熱溫度為80和90 ℃的酯化效率分別為77%和100%，90 ℃酯化效率顯著高于80 ℃.此外，當(dāng)加熱溫度高于90 ℃時(shí)，酯化劑顯著沸騰導(dǎo)致?lián)]發(fā)嚴(yán)重，因此最終選擇超聲加熱溫度為90 ℃.

圖2 不同甲酯化溫度下的相對酯化效率Fig.2 Relative methylation efficiencies at different heating temperatures

2.1.3 甲酯化超聲功率

在甲酯化超聲加熱溫度為90 ℃、超聲加熱時(shí)間30 min、靜置萃取時(shí)間1.5 h、萃取劑為正己烷的條件下，僅改變超聲功率，檢測擬南芥種子中的脂肪酸酯化效率.當(dāng)設(shè)定超聲功率為400 W 時(shí)，各脂肪酸酯化效率為100%，計(jì)算其他超聲功率下的相對酯化效率，結(jié)果如圖3 所示.由圖可知，超聲功率為400 W 時(shí)脂肪酸酯化效率最高.因此，選擇超聲功率為400 W.

圖3 不同超聲功率下的相對酯化效率Fig.3 Relative methylation efficiencies at different ultrasonic powers

2.1.4 靜置萃取時(shí)間

在甲酯化超聲加熱溫度為90 ℃、超聲功率為400 W、超聲加熱時(shí)間30 min、萃取劑為正己烷的條件下，靜置萃取不同時(shí)間后，4 000 r/min 離心5 min，檢測擬南芥種子中的脂肪酸提取效率.設(shè)定靜置萃取時(shí)間為90 min 時(shí)，各脂肪酸提取效率為100%，計(jì)算其他萃取時(shí)間的相對萃取效率，結(jié)果如圖4 所示.由圖4 可見，隨著靜置萃取時(shí)間的延長，提取效率逐漸降低，可能原因是隨著靜置時(shí)間增加，發(fā)生了一定程度的反萃取.因此，后續(xù)選擇不靜置萃取直接離心即可.

圖4 不同靜置萃取時(shí)間下的萃取效率Fig.4 Relative extraction efficiencies under different static extraction times

2.1.5 萃取劑種類

在甲酯化超聲加熱溫度為90 ℃、超聲功率為400 W、超聲加熱時(shí)間30 min、不靜置萃取直接4 000 r/min 離心5 min 的條件下，改變萃取所用溶劑，檢測擬南芥種子中脂肪酸提取效果.結(jié)果如圖5可見，萃取劑為正己烷、石油醚、二氯甲烷時(shí)，所檢測結(jié)果無明顯差異，因此后續(xù)仍然選擇使用正己烷作為萃取劑.

圖5 不同萃取溶劑提取結(jié)果(1) C16:0, (2) C18:0, (3) C18:1n9t, (4) C18:1n9c,(5) C18:2n6c, (6) C18:3n3, (7) C20:0, (8) C20:1n9,(9) C20:2, (10) C20:3n3, (11) C22:1n9Fig.5 Results of different extraction solvents

綜上所述，脂肪酸提取的優(yōu)化條件如下：甲酯化超聲加熱溫度為90 ℃，超聲功率400 W，超聲加熱時(shí)間為30 min，萃取劑為正己烷，加入萃取劑后不進(jìn)行靜置萃取直接4 000 r/min 離心5 min.

2.2 質(zhì)量保證與質(zhì)量控制

2.2.1 工作曲線及方法檢出限、定量限

用優(yōu)化后的色譜條件，對脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度分別為4.0、2.0、1.0、0.5、0.2 mg/mL，內(nèi)標(biāo)溶液質(zhì)量濃度為2 mg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行檢測.由于擬南芥種子以及常見油料作物中所含的多為十五碳以上的脂肪酸[17]，因此本文重點(diǎn)進(jìn)行了十五碳至二十四碳脂肪酸的檢測.4.0 mg/mL 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測色譜圖如圖6 所示.由圖6可見，所有組分均能實(shí)現(xiàn)較好分離.

圖6 脂肪酸甲酯混合標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測色譜圖(1) 十五烷酸，(2) 順-10-十五烯酸，(3) 棕櫚酸，(4) 棕櫚油酸，(5) 十七烷酸，(6) 順-10-十七烯酸，(7) 硬脂酸，(8) 反油酸，(9)油酸，(10) 反亞油酸，(11) 亞油酸，(12) 內(nèi)標(biāo)：十九烷酸，(13) γ-亞麻酸，(14) α-亞麻酸，(15) 花生酸，(16) 順-11-二十碳烯酸，(17) 順-11, 14-二十碳二烯酸，(18) 二十一烷酸，(19) 順-8, 11, 14-二十碳三烯酸，(20) 花生四烯酸，(21) 順-11, 14, 17-二十碳三烯酸，(22) 二十二烷酸，(23) 順-5, 8, 11, 14, 17-二十碳五烯酸，(24) 芥酸，(25) 順-13, 16-二十二碳二烯酸，(26) 二十三烷酸，(27) 二十四烷酸，(28) 神經(jīng)酸，(29) 順-4, 7, 10, 13,16, 19-二十二碳六烯酸Fig.6 Gas chromatogram of methyl fatty acid components for mixed standard solutions(1) C15:0, (2) C15:1, (3) C16:0, (4) C16:1, (5) C17:0,(6) C17:1, (7) C18:0, (8) C18:1n9t, (9) C18:1n9c,(10) C18:2n6t, (11) C18:2n6c, (12) C19:0 (internal standard), (13) C18:3n6, (14) C18:3n3, (15) C20:0,(16) C20:1n9, (17) C20:2, (18) C21:0, (19) C20:3n6,(20) C20:4n6, (21) C20:3n3, (22) C22:0, (23) C20:5n3,(24) C22:1n9, (25) C22:2, (26) C23:0, (27) C24:0,(28) C24:1n9, (29) C22:6n3

以標(biāo)準(zhǔn)樣品濃度為橫坐標(biāo)，各脂肪酸峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比為縱坐標(biāo)，擬合脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果如表1 所列.由表1 可得，所構(gòu)建的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)R2均大于0.999 0.以目標(biāo)物質(zhì)測試信噪比（S/N）為3 時(shí)的質(zhì)量濃度作為檢出限，S/N 為10 時(shí)的質(zhì)量濃度作為定量限.試驗(yàn)結(jié)果表明，方法的檢出限為2.9～21.5 mg/kg，定量限為14.5～94.0 mg/kg.

表1 標(biāo)準(zhǔn)工作曲線及方法檢出限、定量限Table 1 Calibration curves, limits of detection, limits of quantification

2.2.2 方法的精密度

對擬南芥種子中的11 種脂肪酸在所優(yōu)化條件下重復(fù)測定7 次，采用面積歸一化法，分別計(jì)算各脂肪酸的相對百分含量和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），進(jìn)行方法精密度分析，其結(jié)果如表2 所列.由表2 可得，所檢測的11 種脂肪酸相對百分含量的RSD 在0.5%～7.9%范圍內(nèi)，表明采用超聲萃取-氣相色譜法對擬南芥種子中脂肪酸含量進(jìn)行測定的精密度較好.

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Experiment results of precision /%

2.3 擬南芥種子及不同油料作物中脂肪酸含量的檢測

按照最終優(yōu)化的試驗(yàn)方法，對擬南芥種子、油菜籽、花生、大豆中的脂肪酸種類及含量進(jìn)行測定，色譜圖如圖7 所示，定量結(jié)果如表3 所列，證實(shí)本文所建立的方法同樣適用于多種油料作物脂肪酸的提取檢測.

表3 樣品定量檢測結(jié)果Table 3 Quantification results of sample /(mg/kg)

圖7 擬南芥種子、油菜籽、花生、大豆中脂肪酸檢測色譜圖（a）擬南芥種子，（b）油菜籽，（c）花生，（d）大豆Fig.7 Gas chromatograms of Arabidopsis seeds, Rapeseed, Peanut and Soybean

3 結(jié)論

在傳統(tǒng)的WST-GC 法中，甲酯化反應(yīng)往往需要在90 ℃高溫下持續(xù)1.5 h 以上[9-10]，本文聯(lián)用了超聲萃取法后，僅需在90 ℃條件下超聲加熱30 min，酯化效率便可達(dá)到最高，大大縮短了試驗(yàn)時(shí)間.此外，在以往的研究中，未見將WST-GC 法用于檢測油料作物中脂肪酸的報(bào)道，而本文將所建立的方法應(yīng)用于多種油料作物脂肪酸含量的測定，拓寬了方法的適用性.

綜上所述，本文建立了超聲萃取-氣相色譜測定擬南芥種子中脂肪酸含量的試驗(yàn)方法，該方法操作簡單，提取效率高，為快速準(zhǔn)確測定脂肪酸含量提供了新思路，有助于加快擬南芥種子中脂肪酸代謝調(diào)控機(jī)制的研究進(jìn)程.該方法同樣適用于多種油料作物脂肪酸含量的測定，可為油料作物優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)品種篩選、育種效率提高、產(chǎn)油量性狀調(diào)控機(jī)理的研究、高品質(zhì)食用油的獲取等研究領(lǐng)域脂肪酸含量的精確測定提供指導(dǎo).