褪黑素誘導(dǎo)增強(qiáng)生防芽孢桿菌DZY 6715對(duì)油茶炭疽病的抑制作用*

劉地，楊闊，杜倩潔，周慧琴，鄧佳，，伍健榕，王芳，3

(1.西南林業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，云南 昆明 650224；2.西南山地森林資源保育與利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224；3.西南林業(yè)大學(xué) 西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224)

油茶(Camelliaoleifera)為山茶科(Theaceae)山茶屬小型常綠喬木或灌木，是我國(guó)特有的木本油料植物[1]。油茶炭疽病是油茶的主要病害，重病區(qū)產(chǎn)量可縮減40%～80%[2]。根據(jù)研究報(bào)道，油茶炭疽病的病原菌有8種，如油茶果生炭疽菌(Colletotrichumfructicola)、膠孢炭疽菌(C.gloeosporioides)和暹羅炭疽菌(C.siamense)等，其病原菌在油茶整個(gè)生育期均可侵染[3-4]。目前，對(duì)于油茶炭疽病的主要防治措施是化學(xué)防治[5]。使用化學(xué)農(nóng)藥防治油茶炭疽病，雖然能高效降低油茶損失，但由于炭疽病病原菌具有較強(qiáng)的適應(yīng)能力，容易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，還會(huì)對(duì)植物造成氧化脅迫使植物生長(zhǎng)受抑[6]。因此，尋找安全無(wú)害的防治方法是研究的重要方向。目前，利用拮抗細(xì)菌控制病害的方法顯示出了巨大的應(yīng)用前景。國(guó)內(nèi)外已有報(bào)道證明，芽孢桿菌(Bacillustequilensis)具有廣譜抑菌性，抑菌機(jī)理較為復(fù)雜，通常是多種抑菌機(jī)制協(xié)同發(fā)揮作用[7-8]。芽孢桿菌防治病原菌的方式主要有：與病原菌進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)和生態(tài)位點(diǎn)競(jìng)爭(zhēng)來(lái)防治病原菌；形成生物膜提高其生防效果[9]；產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)[10-11]來(lái)造成細(xì)胞畸變，使原生質(zhì)發(fā)生凝集和外溢[11-12]；分泌幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶等裂解酶來(lái)抑制病原菌菌絲生長(zhǎng)；通過破壞細(xì)胞膜完整性和誘導(dǎo)孢子中活性氧的積累來(lái)抑制病原菌的生長(zhǎng)[13-15]。此外，芽孢桿菌還可以通過促進(jìn)植物生長(zhǎng)并分泌次生代謝產(chǎn)物或誘導(dǎo)系統(tǒng)抗性(ISR)來(lái)防治植物病害[16]。如：徐睿等[3]發(fā)現(xiàn)以枯草芽孢桿菌YL 13發(fā)酵液對(duì)暹羅炭疽菌抑制效果可達(dá)到68.03%；曹娜等[17]發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌發(fā)酵液具有較好的穩(wěn)定性，能使病原菌菌絲發(fā)生形態(tài)變化。

芽孢桿菌DZY 6715是一株內(nèi)生拮抗芽孢桿菌，對(duì)油茶炭疽病害有很好的生防效果[18]，但是其防治效果與化學(xué)殺菌劑相比仍有很大差距。褪黑激素(melatonin，MT)在植物體生理調(diào)節(jié)、增強(qiáng)植物抗逆性方面起著非常重要的作用[19-20]，可激活冷害[21]、干旱[22]和鹽脅迫等多種非生物脅迫下植物的抗氧化系統(tǒng)，通過提高植物防御酶活性和其相對(duì)基因表達(dá)量等來(lái)提高植物的抗逆性[21]。劉亞萍[23]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)白菜(Brassicarapavar.glabra)灌施400 μmol/L的褪黑素溶液時(shí)，可有效降低根腫病的病情指數(shù)和發(fā)病率。目前，關(guān)于MT誘導(dǎo)的植物抗病內(nèi)容較為豐富，但當(dāng)MT作為一種誘導(dǎo)因子直接作用于拮抗細(xì)菌進(jìn)而提高其生防效力的研究目前尚無(wú)報(bào)道。本研究以油茶為實(shí)驗(yàn)材料，研究特基拉芽孢桿菌DZY 6715對(duì)暹羅炭疽菌的生防效果，以探究褪黑素誘導(dǎo)芽孢桿菌DZY 6715抗油茶炭疽病的抗病機(jī)理。該研究結(jié)果將為探尋提高DZY 6715生防效力的途徑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試菌

炭疽病原菌 暹羅炭疽菌(CS)。

生防菌 特基拉芽孢桿菌DZY 6715(BacillustequilensisDZY 6715)，由西南林業(yè)大學(xué)西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存。

1.1.2 油茶品種

2 a生的油茶幼苗(長(zhǎng)林系列)，購(gòu)買于江西吉安，現(xiàn)種植于西南林業(yè)大學(xué)。

1.1.3 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基。

1.1.4 誘導(dǎo)物制備

褪黑素購(gòu)于上海西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司。參考Jiang等[24]和何歡等[25]的方法配制不同濃度(0、50、100、200、400 μmol/L)褪黑素溶液并避光保存待用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 不同濃度褪黑素對(duì)芽孢桿菌DZY 6715生長(zhǎng)的影響

將預(yù)先培養(yǎng)并調(diào)整濃度為1×107CFU/mL的芽孢桿菌DZY 6715菌懸液(按1%接種量)加入至含有不同濃度MT(0、50、100、200、400 μmol/L)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(28 ℃、140 r/min)，分別于12、24、48、72、96、120 h收集菌懸液并測(cè)定OD600值。以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，菌液OD600為縱坐標(biāo)繪制其生長(zhǎng)曲線。

1.2.2 不同濃度褪黑素誘導(dǎo)下芽孢桿菌DZY 6715對(duì)炭疽菌菌絲的抑菌活性測(cè)定

平板對(duì)峙方法參照周璦婷[19]。處理組為不同誘導(dǎo)時(shí)間(24、48、72、96、120 h)和誘導(dǎo)物MT不同濃度(0、50、100、200、400 μmol/L)，對(duì)照組為水。在7 d時(shí)測(cè)量對(duì)照組病原菌菌落半徑(R1)和對(duì)峙組病原菌菌落中心到DZY 6715菌落邊緣的距離(R2)，并計(jì)算對(duì)病原菌菌絲的生長(zhǎng)抑制率(R抑)。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，公式如下。

1.2.3 不同濃度褪黑素誘導(dǎo)下芽孢桿菌DZY 6715生物膜成膜能力測(cè)定

使用結(jié)晶紫染色法，取單菌落接種到不同濃度MT(0、50、100、200、400 μmol/L)的LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、140 rpm條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，并于72 h取樣1 mL加入至24孔板中，后加入等體積的LB液體培養(yǎng)基靜止培養(yǎng)。分別于24、48、72、96 h進(jìn)行0.1%結(jié)晶紫染色，40%冰醋酸溶解，并在紫外分光光度計(jì)下測(cè)定在560 nm處的吸光值。每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 褪黑素誘導(dǎo)下芽孢桿菌DZY 6715胞外水解酶活性測(cè)定

將芽孢桿菌DZY 6715接種到不同濃度MT(0、50 μmol/L)的 LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、140 rpm條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，并于24、48、72、96、120 h收集菌懸液，測(cè)定幾丁質(zhì)酶(chitinase)和β-1,3葡聚糖酶(β-1,3-glucanase，β-1,3-GA)活性，每處理3個(gè)重復(fù)。操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行(試劑盒購(gòu)買于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)。幾丁質(zhì)酶酶活表示方法為每毫升培養(yǎng)液每小時(shí)分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生1 mg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個(gè)酶活單位〔mg/(h·mL)〕，β-1,3葡聚糖酶酶活表示方法為每1 mL血清(漿)每小時(shí)產(chǎn)生1 mg還原糖定義為一個(gè)酶活性單位〔mg/(h·mL)〕。

1.2.5 褪黑素誘導(dǎo)下芽孢桿菌DZY 6715對(duì)炭疽病原菌菌絲破壞作用

將芽孢桿菌DZY 6715接種到不同濃度MT(0、50 μmol/L)的LB液體培養(yǎng)基中，于28 ℃、140 rpm/min條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，并于72 h收集菌懸液，加入CS病原菌菌絲，制成混合液，以無(wú)菌培養(yǎng)液為對(duì)照，每處理3個(gè)重復(fù)。28 ℃、180 rpm/min培養(yǎng)后，分別于24、48、72、96、120 h取樣，測(cè)定電導(dǎo)率，10 000 rpm、4 ℃離心10 min后測(cè)定OD260，丙二醛含量(nmoL/g)和可溶性蛋白含量(mg/mL)測(cè)算按照試劑盒說明書進(jìn)行(試劑盒購(gòu)買于蘇州科銘生物技術(shù)有限公司)。

1.2.6 不同濃度褪黑素誘導(dǎo)下芽孢桿菌DZY 6715對(duì)油茶炭疽病的抑制作用

選取健康且大小一致的2 a生‘長(zhǎng)林系列’油茶葉片作為接種對(duì)象，用75%酒精將葉片消毒30 s，再用無(wú)菌水將葉片清洗3次后晾干；浸泡到MT誘導(dǎo)后的菌懸液(0、50、100、200、400 μmol/L)和不同濃度MT(0、50、100、200、400 μmol/L)溶液中，每個(gè)處理9個(gè)重復(fù)。放置2 h后，使用一次性注射器將葉片葉脈兩側(cè)挑破，接種直徑為6 mm 的炭疽菌塊，置于鋪有滅菌濾紙的培養(yǎng)皿中，每天觀察發(fā)病情況并測(cè)定病斑面積。

1.2.7 不同誘導(dǎo)時(shí)間下芽孢桿菌DZY 6715對(duì)油茶炭疽病抗病性的影響

葉片處理方法同1.2.6。葉片用菌懸液(50 μmol/L MT誘導(dǎo)72 h)浸泡處理，分別于放置2、6、12、18、24、30 h后接種直徑為6 mm 的炭疽菌塊，每天觀察發(fā)病情況并測(cè)定病斑面積。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 17.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，應(yīng)用Duncan氏新復(fù)極差法和t檢驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)(α=0.05)。采用Origin 2018軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和圖形制作，Photoshop 軟件進(jìn)行圖像處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度褪黑素對(duì)芽孢桿菌DZY 6715生長(zhǎng)的影響

芽孢桿菌DZY 6715的OD600隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，即其細(xì)胞濃度隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高并于72 h進(jìn)入穩(wěn)定期(圖1)。進(jìn)入穩(wěn)定期后，50 μmol/L MT誘導(dǎo)下DZY 6715的細(xì)胞濃度顯著高于其他濃度褪黑素誘導(dǎo)下的細(xì)胞濃度，且在50 μmol/L MT誘導(dǎo)下DZY 6715的細(xì)胞濃度在72、96、120 h分別是未誘導(dǎo)的1.57、1.17和1.52倍，表明50 μmol/L MT誘導(dǎo)處理顯著提高了芽孢桿菌DZY 6715的細(xì)胞濃度。

圖1 不同濃度MT處理的芽孢桿菌DZY 6715 的OD600

2.2 不同誘導(dǎo)時(shí)間和褪黑素濃度下芽孢桿菌DZY 6715對(duì)炭疽菌菌絲的抑菌活性

MT誘導(dǎo)的芽孢桿菌DZY 6715對(duì)炭疽菌的抑制效果顯著高于未誘導(dǎo)菌株(表1)，各處理抑菌率均高于50.00%。抑菌率隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降趨勢(shì)，其中褪黑素在50 μmol/L水平時(shí)，在不同誘導(dǎo)時(shí)間(24、48、72、96、120 h)下的抑菌率顯著高于其他處理組，且不同濃度MT(50、100、200、400 μmol/L)在誘導(dǎo)72 h時(shí)抑菌率最高，分別為76.33%、72.33%、71.67%和68.67%。

表1 不同濃度MT和誘導(dǎo)時(shí)間下芽孢桿菌DZY 6715對(duì)炭疽菌菌絲的抑制率Tab.1 Inhibition rate of Bacillus tequilensis DZY 6715 on anthracnose mycelium under different concentrations of MT and different induction time

由圖2可以看出，不同濃度MT誘導(dǎo)DZY 6715處理對(duì)炭疽菌菌絲并無(wú)明顯影響，但在MT誘導(dǎo)72 h之后，可以明顯看出芽孢桿菌DZY 6715在營(yíng)養(yǎng)體上擴(kuò)散面積最廣，這可能是其抑制率增強(qiáng)的原因。

圖2 不同濃度褪黑素誘導(dǎo)DZY 6715處理對(duì)炭疽菌菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.2 Effects of B.tequilensis DZY 6715 treatment induced by different melatonin concentrations on hyphal growth of anthrax

2.3 不同誘導(dǎo)時(shí)間誘導(dǎo)下芽孢桿菌DZY6715生物膜成膜能力

由圖3可以看出，MT處理下的生物膜與未處理的均存在差異，所有處理培養(yǎng)時(shí)間與生物膜成負(fù)相關(guān)關(guān)系，培養(yǎng)時(shí)間越久生物膜形成能力越弱。未誘導(dǎo)菌株在24～48 h生物膜產(chǎn)量逐漸上升，72～96 h產(chǎn)量下降，且在靜置培養(yǎng)96 h時(shí)，生物膜出現(xiàn)解離、浮游的狀態(tài)。經(jīng)MT誘導(dǎo)后的DZY 6715，其生物膜的產(chǎn)量明顯提高且與未誘導(dǎo)菌株的變化趨勢(shì)大致相同，但在96 h時(shí)未觀察到解離狀態(tài)；MT處理后在靜置培養(yǎng)12～24 h、24～96 h分別處于最初的黏附、成膜的穩(wěn)定的階段。50 μmol/L MT處理的DZY 6715各時(shí)間段內(nèi)生物膜產(chǎn)量均有上升，顯著優(yōu)于對(duì)照組，表明經(jīng)50 μmol/L MT處理后的DZY 6715具有較強(qiáng)的生物膜形成能力，其菌懸液在靜置培養(yǎng)24 h時(shí)OD560達(dá)到最大值，生物膜厚度明顯變厚，褶皺變多，顯著高于其他MT濃度處理組，這可能有助于其在植物表面定殖。

圖3 不同MT處理對(duì)DZY 6715生物膜OD值的影響

2.4 50 μmol/L褪黑素誘導(dǎo)下芽孢桿菌DZY 6715胞外水解酶活性

由圖4可知，經(jīng)MT誘導(dǎo)過后的菌液內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性在不同時(shí)間段內(nèi)均顯著升高。不同誘導(dǎo)時(shí)間下50 μmol/L濃度菌液幾丁質(zhì)酶活性分別為2.13、2.23、2.19、2.27、2.30 U/mL。表明MT誘導(dǎo)處理可使菌體內(nèi)幾丁質(zhì)酶活性升高，從而達(dá)到抑菌目的。菌液的β-1,3-葡聚糖酶活性呈現(xiàn)先升高后下降趨勢(shì)，且MT處理組的該酶活性均較對(duì)照組顯著升高。在72 h、 50 μmol/L濃度處理組的β-1,3-葡聚糖酶活性達(dá)到峰值4.5 U/mL，較對(duì)照組的酶活性3.46 U/mL顯著升高了31%。表明經(jīng)MT誘導(dǎo)處理后的發(fā)酵液β-1,3-葡聚糖酶活性顯著升高，能使細(xì)胞壁降解，抑制菌絲生長(zhǎng)。

圖4 褪黑素誘導(dǎo)下芽孢桿菌菌液胞外水解酶活性

2.5 芽孢桿菌DZY 6715對(duì)炭疽病原菌菌絲的破壞作用

如圖5所示，對(duì)照組MDA濃度在120 h時(shí)間段內(nèi)呈現(xiàn)先上升后下降趨勢(shì)，處理間無(wú)顯著變化；與對(duì)照組相比，相同時(shí)間50 μmol/L MT處理組菌絲體MDA濃度顯著上升(P<0.05)，均高于對(duì)照組和未誘導(dǎo)菌株，且MT處理組MDA濃度維持在較高水平，基本呈現(xiàn)拮抗越久，菌絲體MDA含量越高。

圖5 MT誘導(dǎo)芽孢桿菌對(duì)炭疽菌的破壞作用

對(duì)照組菌體培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)含量極低；經(jīng)MT誘導(dǎo)下的DZY 6715發(fā)酵液作用后，蛋白質(zhì)含量迅速增加，后趨于穩(wěn)定。在培養(yǎng)48 h時(shí)間段，50 μmol/L MT處理發(fā)酵液是對(duì)照組的13.5倍，對(duì)比未誘導(dǎo)菌株上升61.6%。推測(cè)MT誘導(dǎo)后的發(fā)酵液可能破壞了炭疽菌菌體細(xì)胞膜的完整性，導(dǎo)致培養(yǎng)液中蛋白質(zhì)含量增加。

當(dāng)微生物細(xì)胞膜遭到較大破壞時(shí)，核酸等大分子物質(zhì)也會(huì)釋放到細(xì)胞外。核酸在波長(zhǎng)260 nm處有很強(qiáng)的紫外吸收，測(cè)定細(xì)胞外OD260有助于判斷菌體細(xì)胞膜破壞程度。如圖5所示，OD值是隨著時(shí)間而升高，MT誘導(dǎo)處理與未誘導(dǎo)菌株菌液趨勢(shì)一致，但50 μmol/L MT處理發(fā)酵液OD值對(duì)比未誘導(dǎo)菌株菌液存在顯著差異，在120 h時(shí)間段中達(dá)到峰值28.43 ug/uL，說明MT誘導(dǎo)處理的DZY 6715增強(qiáng)炭疽菌核酸泄露。

在整個(gè)時(shí)段內(nèi)，MT處理和CK的菌絲相對(duì)電導(dǎo)率總體上都呈現(xiàn)一個(gè)上升的趨勢(shì)，且MT處理較對(duì)照組顯著增加，在培養(yǎng)72 h時(shí)達(dá)到最大值88.09%，是對(duì)照組的1.12倍。說明與CK相比，MT處理下的炭疽菌絲的損傷程度增大，通透性增加，加速菌體細(xì)胞質(zhì)滲漏到細(xì)胞外。

2.6 不同濃度MT誘導(dǎo)下芽孢桿菌DZY 6715在離體葉片上對(duì)炭疽菌的抑制作用

如圖6、7所示，在不同濃度MT誘導(dǎo)下，72 h的芽孢桿菌DZY 6715在離體葉片上對(duì)炭疽病病原菌都有一定的抑制作用，且MT誘導(dǎo)DZY 6715處理病斑面積均小于對(duì)照組和純培養(yǎng)，呈現(xiàn)病斑面積隨MT濃度增加而增大的趨勢(shì)。其中50 μmol/L MT處理發(fā)酵液有較好的抗病效果，病斑面積顯著縮小，是對(duì)照組的15.3%，純培養(yǎng)的28.4%。而不同濃度MT溶液對(duì)病斑面積并無(wú)明顯影響，基本呈現(xiàn)病斑面積隨MT濃度增加而減小的趨勢(shì)，說明單獨(dú)使用MT對(duì)油茶的病斑大小無(wú)顯著影響。

圖6 不同MT處理芽孢桿菌DZY6715對(duì)油茶葉片炭疽病的控制效果

圖7 不同MT處理芽孢桿菌DZY 6715和單獨(dú)MT對(duì)炭疽病的控制效果

2.7 發(fā)酵液處理葉片時(shí)間對(duì)炭疽病的控制效果

由圖8可以看出，對(duì)比對(duì)照組來(lái)說，MT處理均對(duì)葉片病斑面積的擴(kuò)增有明顯的抑制效果，其中，第2 h和24 h處理組效果比較明顯，較對(duì)照組縮小84.1%和88.46%。

圖8 發(fā)酵液處理葉片時(shí)間對(duì)炭疽病的控制效果Fig.8 Control effect of leaf time on anthracnose

3 討論與結(jié)論

已有研究證明，天然高分子化合物可有效提高生物防治效果，化合物作為激發(fā)子誘導(dǎo)培養(yǎng)可顯著提高生防菌的拮抗效力[26]，促進(jìn)生防菌生長(zhǎng)繁殖和菌株活力等。本研究結(jié)果表明低濃度MT(50 μmol/L)誘導(dǎo)DZY 6715菌懸液細(xì)胞數(shù)量增加，且顯著高于未誘導(dǎo)菌株，細(xì)胞濃度在72 h時(shí)達(dá)到峰值，說明MT作為生物激發(fā)子在低濃度條件下對(duì)菌株DZY 6715有一定促進(jìn)生長(zhǎng)作用，使細(xì)胞活力增強(qiáng)，種群密度上升。隨著MT濃度的逐漸升高，其對(duì)芽孢桿菌DZY 6715的促進(jìn)生長(zhǎng)作用逐漸降低，且隨著濃度的進(jìn)一步升高會(huì)呈現(xiàn)抑制作用，與此結(jié)果類似，有研究報(bào)道當(dāng)濃度高于1 000 μmol/L會(huì)顯著抑制芽孢桿菌的等的生長(zhǎng)[27]。推測(cè)MT對(duì)芽孢桿菌生長(zhǎng)的影響可能遵循報(bào)酬遞減規(guī)律，這與Yu等的結(jié)果相似[28]。而當(dāng)拮抗菌株達(dá)到一定的種群密度，就可能會(huì)產(chǎn)生群體效應(yīng)由單細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樯锬ば螒B(tài)[29]，幫助菌體更好地附著于植物表面，在激活植物防御反應(yīng)、拮抗病原微生物等方面幫助植物抵御病害侵染。生物膜的形成可能是拮抗菌防治病害的新機(jī)理之一。MT誘導(dǎo)可以增強(qiáng)DZY 6715的生物膜形成能力，進(jìn)而提升其對(duì)油茶炭疽菌的抑制作用。本研究結(jié)果表明，50 μmol/L MT誘導(dǎo)72 h的DZY 6715在平皿對(duì)峙試驗(yàn)中對(duì)炭疽菌的抑制率可達(dá)到76.33%，顯著高于未誘導(dǎo)菌株。同時(shí)50 μmol/L MT誘導(dǎo)72 h 的DZY 6715在葉片上也能控制炭疽病病斑的擴(kuò)展，這可能是50 μmol/L MT誘導(dǎo)72 h的DZY 6715細(xì)胞活力最強(qiáng)，能迅速占領(lǐng)空間，從而有效地與病原菌形成營(yíng)養(yǎng)與空間上的競(jìng)爭(zhēng)，抑制炭疽病菌的入侵和繁殖。此外，誘導(dǎo)菌株對(duì)油茶葉片的處理時(shí)間也顯著影響其對(duì)炭疽病原菌的控制，處理24 h時(shí)病斑面積最小，這可能是由于50 μmol/L MT誘導(dǎo)72 h 的DZY 6715菌株生物膜形成能力在24 h時(shí)最強(qiáng)，且在葉片上處理24 h后，對(duì)病原菌產(chǎn)生了系統(tǒng)抗病性。這與何方濤[30]的研究結(jié)果類似，誘導(dǎo)激發(fā)培養(yǎng)后提高了拮抗菌對(duì)病原菌的控制效力，生防菌在抑菌過程中分泌一些物質(zhì)如幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶，可破壞真菌細(xì)胞的細(xì)胞壁。林福呈等[31]研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌可以進(jìn)入真菌細(xì)胞壁繁殖并分泌溶菌物質(zhì)。本研究中MT誘導(dǎo)可以增強(qiáng)DZY 6715幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶活性，破壞真菌細(xì)胞壁。細(xì)胞膜是真菌組織結(jié)構(gòu)的一部分，能夠維持正常的生理結(jié)構(gòu)，有效調(diào)節(jié)內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，保障其正常生命活動(dòng)[32]。已有研究表明，許多芽孢桿菌可以分泌次級(jí)代謝產(chǎn)物如surfactin、fengycin和difficidin等抗菌物質(zhì)，這些物質(zhì)可以破壞真菌細(xì)胞壁，通過改變真菌細(xì)胞膜的通透性來(lái)破壞其內(nèi)外環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，從而起到抑菌作用。病原菌細(xì)胞膜受損，其內(nèi)含物外滲，培養(yǎng)液電導(dǎo)率增加。MDA是膜脂過氧化的主要產(chǎn)物，能夠衡量菌絲體的膜脂過氧化水平[32]。Yang等[33]研究發(fā)現(xiàn)戊二醛處理使病原菌細(xì)胞內(nèi)積累大量活性氧，且MDA含量劇增，表明菌絲體發(fā)生了脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，膜系統(tǒng)受損。而細(xì)胞膜被破壞，通透性增加，隨后釋放細(xì)胞內(nèi)的大分子蛋白和核酸，菌體蛋白質(zhì)和核酸外泄會(huì)嚴(yán)重影響正常的生命活動(dòng)[34]。Wang[35]等研究也發(fā)現(xiàn)，在灰霉菌細(xì)胞膜被破壞后，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的大分子蛋白和核酸釋放。本研究中，經(jīng)50 μmol/L MT誘導(dǎo)DZY 6715處理的病原菌菌絲，其電導(dǎo)率和MDA顯著高于未誘導(dǎo)菌株，OD260和可溶性蛋白的含量增加，說明MT誘導(dǎo)DZY 6715增強(qiáng)其對(duì)炭疽菌細(xì)胞結(jié)構(gòu)的破壞，使病細(xì)胞膜的通透性增加，釋放細(xì)胞內(nèi)的核酸和蛋白。綜上，MT誘導(dǎo)芽孢桿菌DZY 6715可以通過分泌相關(guān)活性酶如幾丁質(zhì)、葡聚糖酶，破壞病原菌的細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，使菌體內(nèi)含物外泄，進(jìn)而達(dá)到溶菌目的。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MT處理和未誘導(dǎo)菌株的DZY 6715菌懸液對(duì)油茶葉片的抗炭疽病效果也有不同，其中50 μmol/L MT平板對(duì)峙抑菌率為76.33%，表明誘導(dǎo)后的菌株與病原菌對(duì)峙培養(yǎng)后，能迅速占領(lǐng)空間，從而有效地與病原菌形成營(yíng)養(yǎng)與空間上的競(jìng)爭(zhēng)[35-36]。葉片離體實(shí)驗(yàn)表明，MT誘導(dǎo)后的芽孢桿菌DZY 6715處理油茶葉片，其病斑面積縮減，50 μmol/L MT處理表現(xiàn)最佳，這與何方濤[30]的研究結(jié)果類似，誘導(dǎo)培養(yǎng)后提高了拮抗菌對(duì)病原菌的控制效力。由50 μmol/L MT誘導(dǎo)的DZY 6715處理后，再放置不同時(shí)間后接種病原菌于葉片，均可誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生抗病性，從而增強(qiáng)植株自身防御反應(yīng)，且以放置24 h后病斑面積最小。這可能是因?yàn)镈ZY 6715菌株的生物膜形成能力在24 h時(shí)最強(qiáng)，可以在油茶葉片上進(jìn)行定殖，從而提高拮抗能力，而單獨(dú)施用MT對(duì)油茶葉片抗病并無(wú)明顯作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明低濃度的MT誘導(dǎo)可以促進(jìn)芽孢桿菌DZY 6715生長(zhǎng)，且50 μmol/L MT誘導(dǎo)后的菌株生防效果最好；MT作為誘導(dǎo)激發(fā)子低濃度時(shí)可以增強(qiáng)芽孢桿菌DZY 6715對(duì)暹羅炭疽菌的抑制效果，且50 μmol/L MT誘導(dǎo)72 h的DZY 6715菌株效果最好；誘導(dǎo)的DZY 6715菌株具有較強(qiáng)的生物膜形成能力，分泌幾丁質(zhì)和葡聚糖酶，破壞了病原菌菌絲的結(jié)構(gòu)，改變細(xì)胞膜的通透性，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，從而使病原菌溶解死亡。本研究結(jié)果可為油茶高效生防菌劑開發(fā)利用提供理論參考，使其大規(guī)模應(yīng)用并替代傳統(tǒng)化學(xué)殺菌劑成為可能。然而，雖然明確了MT作為誘導(dǎo)激發(fā)子可以增強(qiáng)芽孢桿菌DZY 6715對(duì)油茶炭疽病病菌的抑制作用，但其抑菌機(jī)制和抗病機(jī)理尚不明確。后續(xù)宜對(duì)植物微觀結(jié)構(gòu)、生理生化及轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)一步深入研究。