干旱脅迫下云南干熱河谷區(qū)6個鄉(xiāng)土草種生理生化特性的比較分析*

劉愛林，伏春美，羅中陽，常恩福，周云，李品榮，龐靜

(1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2.云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，云南 昆明 650201；3.云南省高黎貢山生物多樣性重點實驗室，云南 昆明 650201；4.高黎貢山森林生態(tài)系統(tǒng)云南省野外科學(xué)觀測研究站，云南 保山 678000)

干旱是全球面臨的主要環(huán)境挑戰(zhàn)之一，嚴重威脅著農(nóng)業(yè)、生態(tài)系統(tǒng)和人類社會穩(wěn)定。干旱是一種生理形式的水分虧缺，土壤可利用水分減少，對植物的代謝產(chǎn)生不利影響。葉片相對含水量是反映脅迫下植物水分有效性的指標(biāo)[1]。植物一般進化出生理調(diào)節(jié)和生化反應(yīng)等適應(yīng)機制來應(yīng)對干旱脅迫[2]。干旱對植物的影響表現(xiàn)在植物的生長、膜完整性、色素含量和滲透調(diào)節(jié)水分關(guān)系等[3-4]。有研究認為，丙二醛、脯氨酸、可溶性糖、葉綠素等可作為植物抗旱性生理評價的重要指標(biāo)[5]。此外，干旱脅迫通常會導(dǎo)致活性氧(ROS)的增加，包括過氧化氫、超氧離子和羥基自由基[6]。高濃度的ROS會破壞植物細胞內(nèi)的化合物，如蛋白質(zhì)、細胞膜等[7]。因此，為維持干旱脅迫下細胞ROS穩(wěn)態(tài)，植物進化出酶促抗氧化防御系統(tǒng)，從而緩解脅迫對植物造成的損害。主要的植物ROS清除酶包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)等[8]。因此，探究植物應(yīng)對水分虧缺產(chǎn)生的生理生化反應(yīng)對植物適應(yīng)干旱環(huán)境尤為重要。

云南干熱河谷是我國西南典型的生態(tài)脆弱地區(qū)，干旱作為當(dāng)?shù)刂匾沫h(huán)境脅迫因素，嚴重制約著植物生長和發(fā)育[9]。鄉(xiāng)土草種是干熱河谷生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分，具有很強的抗逆能力和適應(yīng)性。李建查等[10]通過盆栽模擬自然干旱，分析扭黃茅(Heteropogoncontortus)、孔穎草(Bothriochloapertusa)、擬金茅(Eulaliopsisbinata)和百喜草(Paspalumnotatum)的土壤水分變化和植株苗期抗旱生理性狀，探討干熱河谷優(yōu)勢草本植物的抗旱生理特性。趙琳等[11]對干熱河谷的車桑子(Dodonaeaviscosa)、清香木(Pistaciaweinmannifolia)兩個原生植物的抗旱性能進行系統(tǒng)綜合評價。為篩選干熱河谷地區(qū)優(yōu)良耐旱草種，本試驗以分布于金沙江干熱河谷區(qū)的蕓香草(Cymbopogondistans)、水蔗(Apludamutica)、茅葉藎草(Arthraxonprionodes)、黃花豬屎豆(Crotalariapallida)、紅毛草(Rhynchelytrumrepens)、三芒草(Aristidaadscensionis)為試驗材料，通過測定其生物學(xué)特性指標(biāo)和生理生化特性指標(biāo)，比較分析6個草種的抗旱能力，旨在為培育適合干熱河谷種植的草種并以之用于生態(tài)修復(fù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本試驗所選用的6個鄉(xiāng)土草種為黃花豬屎豆、紅毛草、三芒草、蕓香草、水蔗、茅葉藎草，均采自云南省楚雄彝族自治州永仁縣蓮池鄉(xiāng)小尖山(101°37′43″E、 26°3′6″N，海拔1 743.4 m)。

1.2 試驗設(shè)計

草種盆栽試驗于2022年8月11日，在云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院草學(xué)實驗室進行?；ㄅ鑳?nèi)直徑30 cm，高25 cm。采集干熱河谷燥紅土，風(fēng)干，過2 mm篩，裝盆，每盆裝土6 kg。在每個盆里均勻播10粒飽滿的種子，每個草種播種15盆。植株長出2～3片真葉時(播種出苗后第15 d)定株，每盆挑選5株長勢一致的幼苗。對6個草種進行持續(xù)澆水，使花盆中的土壤水分處于飽和狀態(tài)，保證其初始土壤含水量為田間持水量的75%～80%以上。待植株生長到4～5葉齡(播種出苗后第30 d)時，停止?jié)菜?，?月10日開始進行自然干旱試驗(干旱脅迫共持續(xù)37 d)。

參照植物水分梯度劃分方法[12]，設(shè)置4個水分梯度：正常水分(75%～80%以上)、輕度干旱(60%～65%)、中度干旱(40%～50%)、重度干旱(25%～35%)，每個處理3個重復(fù)。在重度干旱后進行復(fù)水，復(fù)水時使土壤含水量恢復(fù)至對照水平(田間持水量的75%～80%以上)，持續(xù)3 d后進行采樣。土壤含水量于每天早上8:00—11:00使用土壤水分測定儀(MPM-160，ICT International Pey.Ltd.)測定。當(dāng)土壤含水量降低至每個水分梯度時，每個草種從中取3盆植株進行采樣。采樣時每個處理都選取相同部位完全成熟的葉片，用錫紙迅速包裹并標(biāo)記，液氮冷凍后放入-80 ℃低溫冰箱保存以待進行各項指標(biāo)的測定。

1.3 指標(biāo)測定

用土壤水分測定儀測定土壤含水量；丙二醛(MDA)、可溶性糖(SS)、脯氨酸(PRO)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)采用蘇州格銳思生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒測定；葉片相對含水量(LRWC)采用稱重法測定[13]；葉綠素含量采用95%酒精浸泡法測定[14]。

1.4 抗旱性評價方法

抗旱性評價采用隸屬函數(shù)綜合評價法。以6種干熱河谷優(yōu)勢草在不同程度干旱脅迫下的葉片相對含水量、脯氨酸、丙二醛、葉綠素、過氧化氫酶、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、可溶性糖單項指標(biāo)進行綜合性評價。計算公式如下。

若所測指標(biāo)與植物的耐旱性呈正相關(guān)。

F1=(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)

若所測指標(biāo)與植物的耐旱性呈負相關(guān)。

F2=〔1-(Xi-Xmin)/(Xmax-Xmin)〕

式中：Xi表示第i個指標(biāo)值，Xmax表示所有品種第i個指標(biāo)的最大值，Xmin表示所有品種第i個指標(biāo)的最小值。

葉片相對含水量、脯氨酸、葉綠素、可溶性糖、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶與抗旱性呈正相關(guān)，丙二醛與抗旱性呈負相關(guān)，根據(jù)以上公式得到6個草種各指標(biāo)的具體隸屬函數(shù)值并計算出其平均值后進行比較，平均值越大表示該草種的抗旱性越強[15]。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2013進行數(shù)據(jù)處理；運用SPSS 19.0對6個草種在不同脅迫程度下的各指標(biāo)進行單因素方差分析，Duncan法對其多重比較，獨立樣本T檢驗對同一脅迫程度下各指標(biāo)進行差異性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 干旱脅迫對各草種葉片相對含水量的影響

由表1可看出，脅迫前，黃花豬屎豆葉片相對含水量顯著高于其他5個草種(P<0.05)，高出幅度為4.18%～13.86%，三芒草的葉片相對含水量最低。隨干旱程度加劇，各草種葉片相對含水量均呈降低的趨勢，各水分梯度間6個草種葉片相對含水量降幅分別為2.51%～7.56%、9.53%～23.52%和16.81%～31.94%。重度干旱時，各草種葉片相對含水量下降至最低值，此時茅葉藎草葉片相對含水量顯著高于其他草種(P<0.05)，三芒草葉片相對含水量最小。干旱條件下，三芒草葉片相對含水量降幅最大，為46.05%，茅葉藎草降幅最小，為31.29%。復(fù)水后，各草種葉片相對含水量有所上升，但未恢復(fù)至對照水平。

表1 干旱脅迫各時期草種葉片相對含水量變化Tab.1 Changes of leaf relative water contents of drought stress in different drought stress period %

2.2 干旱脅迫對各草種葉片脯氨酸含量的影響

由表2可見，正常水分及輕度干旱條件下，三芒草脯氨酸含量顯著高于其他草種(P<0.05)；中度干旱和重度干旱時，蕓香草脯氨酸含量顯著高于其他草種(P<0.05)。6個草種隨干旱加劇其葉片脯氨酸含量呈升高趨勢，蕓香草、水蔗、茅葉藎草、紅毛草4個草種在各水分梯度間顯著升高；黃花豬屎豆與三芒草脯氨酸含量在輕度干旱時沒有顯著變化，之后顯著升高。各草種脯氨酸含量在重度干旱時達到峰值，此時，蕓香草脯氨酸含量升高了3.62倍，增幅最大，紅毛草增幅最小，為0.99倍。復(fù)水后，各草種脯氨酸含量顯著降低(P<0.05)，其中，黃花豬屎豆與三芒草脯氨酸含量恢復(fù)至對照水平。

表2 干旱脅迫各時期草種葉片脯氨酸含量Tab.2 Proine content of grass varieties’leaves in different drought stress period μg/g

2.3 干旱脅迫對各草種葉片丙二醛含量的影響

由表3可看出，脅迫前，紅毛草丙二醛含量與三芒草相近，平均為15.30 nmol/g，顯著高于其他草種(P<0.05)。當(dāng)草種遭受干旱脅迫時，隨土壤水分下降，除茅葉藎草外其余5個草種丙二醛含量呈升高趨勢。茅葉藎草丙二醛含量在輕度至中度干旱時，茅葉藎草丙二醛含量沒有顯著變化。蕓香草丙二醛含量呈升高趨勢，中度干旱后趨于穩(wěn)定。各草種丙二醛含量在重度干旱時達到最大值，且顯著高于對照(P<0.05)。此時，黃花豬屎豆丙二醛含量最大，為43.74 nmol/g，蕓香草丙二醛含量最小，為29.55 nmol/g。就增幅而言，黃花豬屎豆丙二醛增幅最大，比對照升高了2.81倍，三芒草丙二醛增幅最小，比對照升高了1.20倍。復(fù)水后，各草種丙二醛含量均有所降低，但未恢復(fù)至對照水平。

表3 干旱脅迫各時期草種葉片丙二醛含量Tab.3 MDA content of grass varieties’leaves in different drought stress period nmol/g

2.4 干旱脅迫對各草種葉片葉綠素含量的影響

正常水分條件下，水蔗葉綠素含量最高，顯著高于其他草種(P<0.05)，茅葉藎草葉綠素含量最低(表4)。在干旱脅迫過程中，水蔗、茅葉藎草、三芒草葉綠素含量呈降低趨勢，但在重度干旱時，三芒草葉綠素含量有所回升，比中度干旱高出幅度為17.76%。蕓香草、黃花豬屎豆、紅毛草葉綠素含量在輕度干旱時略有升高，其升高幅度為0.33%～0.45%，之后持續(xù)降低。除三芒草外，其他5個草種在重度干旱時葉綠素含量降至最小值，其中，紅毛草葉綠素含量最高，為6.02 mg/g，茅葉藎草葉綠素含量最低，為1.67 mg/g。與對照相比，茅葉藎草葉綠素含量降幅最大，為60.98%，紅毛草降幅最小，為17.53%。復(fù)水后，6個草種葉綠素含量均顯著升高(P<0.05)，紅毛草與三芒草葉綠素含量恢復(fù)至對照水平。

表4 干旱脅迫各時期草種葉片葉綠素含量Tab.4 Chlorophyll content of grass varieties’leaves in different drought stress period mg/g

2.5 干旱脅迫對各草種葉片可溶性糖含量的影響

脅迫前，三芒草可溶性糖含量顯著高于其他草種(表5)。隨干旱程度加劇，蕓香草、水蔗可溶性糖含量呈升高趨勢。茅葉藎草、紅毛草、三芒草在輕度干旱時，可溶性糖含量顯著降低，其降低幅度分別為33.77%、20.43%和19.62%，之后持續(xù)升高。黃花豬屎豆可溶性糖含量整體呈升高趨勢，在中度干旱時出現(xiàn)降低，其可溶性糖含量降低了0.95 mg/g，之后大幅升高，提高了1.83倍。至重度干旱時，6個草種可溶性糖含量達到最大值，三芒草可溶性糖含量最高，為23.84 mg/g，茅葉藎草可溶性糖含量最低，為11.37 mg/g。與對照相比，黃花豬屎豆增幅最大，升高了1.82倍，紅毛草增幅最小，升高了0.30倍。復(fù)水后，可溶性糖含量均有所降低，其中，紅毛草與三芒草外可溶性糖含量恢復(fù)至對照水平。

表5 干旱脅迫各時期草種葉片可溶性糖含量Tab.5 Soluble sugar content of grass varieties’leaves in different drought stress period mg/g

2.6 干旱脅迫對各草種葉片過氧化物酶活性的影響

正常水分條件下，茅葉藎草POD活性顯著高于其他草種(P<0.05)，而水蔗POD活性最低(表6)。脅迫后，水蔗、茅葉藎草POD活性先降低后升高，在輕度干旱時分別下降了17.42%、23.95%。蕓香草、黃花豬屎豆、紅毛草、三芒草POD活性在干旱脅迫下呈升高趨勢，至重度干旱時POD活性達到最大值。其中，茅葉藎草POD活性最大，黃花豬屎豆POD活性最小。重度干旱時，水蔗增幅最大，比對照升高了2.81倍，黃花豬屎豆增幅最小，比對照升高了1.54倍。復(fù)水后，各草種過氧化物酶活性顯著降低(P<0.05)，且顯著高于對照水平(P<0.05)。

表6 干旱脅迫各時期草種葉片過氧化物酶活性Tab.6 Peroxidase activity of grass varieties’leaves in different drought stress period U/g

2.7 干旱脅迫對各草種葉片超氧化物歧化酶活性的影響

由表7可知，在干旱脅迫下，茅葉藎草SOD活性均顯著高于其他草種(P<0.05)。隨著干旱脅迫程度加劇，6個草種SOD活性顯著升高(P<0.05)。重度干旱時SOD活性達到最大，茅葉藎草SOD活性值最大，為1 175.25 U/g，蕓香草SOD活性值最小，為408.16 U/g。與對照相比，水蔗增幅最大，升高了3.91倍，黃花豬屎豆增幅最小，為1.67倍。復(fù)水后，6個草種SOD活性均有所降低，但未恢復(fù)至對照水平。

表7 干旱脅迫各時期草種葉片超氧化物歧化酶活性Tab.7 Superoxide dismutase activity of grass varieties’leaves in different drought stress period U/g

2.8 干旱脅迫對各草種葉片過氧化氫酶活性的影響

正常水分條件下，三芒草CAT活性顯著高于其他草種(P<0.05)，黃花豬屎豆CAT活性最小(表8)。受干旱脅迫影響，茅葉藎草、黃花豬屎豆、紅毛草CAT活性呈升高趨勢，黃花豬屎豆在中度至至重度干旱時CAT活性趨于穩(wěn)定。水蔗與三芒草在輕度干旱時CAT活性顯著降低(P<0.05)，之后CAT活性持續(xù)升高。而蕓香草在輕度、中度干旱時CAT活性顯著升高(P<0.05)，在重度干旱時CAT活性降低了63.63 U/g。重度干旱時，三芒草CAT活性最大，黃花豬屎豆CAT活性最小。此時三芒草增幅最小，僅升高了0.11倍，茅葉藎草CAT活性增幅最大，升高了0.91倍。復(fù)水后，6個草種CAT活性均顯著降低(P<0.05)，黃花豬屎豆CAT活性接近對照水平。

表8 干旱脅迫各時期草種葉片過氧化氫酶活性Tab.8 Catalase activity of grass varieties’leaves in different drought stress period U/g

表9 供試材料的抗旱性綜合評價Tab.9 Comprehensive comparison of drought resistance of experimental materials

2.9 抗旱性綜合評價

根據(jù)隸屬函數(shù)公式[15]求出6個草種在干旱脅迫下生物學(xué)特性指標(biāo)(葉片相對含水量)和7個生理生化特性指標(biāo)(脯氨酸、丙二醛、葉綠素、可溶性糖、過氧化物酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶)的隸屬函數(shù)值，并進一步計算得到抗旱性綜合得分。結(jié)果表明，干旱脅迫下6種植物抗旱性由強到弱依次是：茅葉藎草、水蔗、三芒草、蕓香草、紅毛草、黃花豬屎豆。

3 討論與結(jié)論

葉片相對含水量(RWC)能較好反應(yīng)植物葉片的水分可用性。與蒸騰作用相同，植物在進行呼吸作用時CO2通過葉片氣孔進入，水的有效性平衡著CO2的吸收和水分蒸騰[16]。植物受水分脅迫時，自身通過滲透調(diào)節(jié)作用降低滲透勢，使得植物產(chǎn)生足夠低的組織水勢，以用于持續(xù)獲取土壤水分[17]。面對干旱脅迫，植物葉片相對含水量變化幅度越小，表明其持水和保水能力越強，細胞受損程度越小，即抗旱能力越強[18]。在本試驗中，隨土壤水分含量的降低，6個草種RWC呈下降趨勢。其中，黃花豬屎豆與三芒草的RWC降幅最大，茅葉藎草降幅最小，即茅葉藎草葉片保水能力較強，而黃花豬屎豆相對較弱。本試驗中豆科草種RWC降幅大于禾本科草種，與其他研究結(jié)果不同[13]。一方面，可能土壤水分減少，植株根系吸收土壤水分減少，RWC自然降低；另一方面，黃花豬屎豆發(fā)達的根系雖具有典型的抗旱特征，但可能由于其葉面積遠超出一般豆科牧草，地上部分水分的蒸騰速率遠大于地下根系對土壤水分的吸收速率[19]。

除了三芒草，其余5個草種隨干旱時間延長其葉片葉綠素含量均有不同程度的降低，這可能是因為干旱脅迫可導(dǎo)致葉綠素合成受阻或葉綠素解體[20-21]。三芒草葉綠素含量呈先降低后升高的趨勢，重度干旱時葉綠素含量略有回升，這與其他研究顯示干旱脅迫下葉片葉綠素含量略有升高的結(jié)果一致[22]，說明在干旱后期三芒草仍具有一定的光合能力，能較強維持葉片細胞體內(nèi)光合碳素同化的進行。復(fù)水后，各草種葉綠素含量均顯著升高，且紅毛草與三芒草葉綠素含量恢復(fù)至對照水平。表明干旱脅迫并未對6個草種葉綠素的合成機制造成不可逆的損傷，而紅毛草與三芒草在復(fù)水情況下可較短時間通過自身調(diào)節(jié)機制恢復(fù)至正常水平。

干旱脅迫下，隨水分虧缺植物持續(xù)產(chǎn)生活性氧(ROS)，引起氧化損傷，脅迫對植物產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致細胞程序性死亡(PCD)[23]。脯氨酸具有較優(yōu)的水合能力，通過調(diào)節(jié)細胞滲透壓以及消除ROS，是質(zhì)膜和酶的保護性物質(zhì)[24]。丙二醛則是活性氧造成脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物，其含量越多，反映出脅迫對植物造成的損傷越大[25]。本試驗中，6個草種丙二醛和脯氨酸含量均隨干旱脅迫時間的增加而升高，且在脅迫過程中蕓香草的丙二醛積累量最高，說明6個草種受到干旱脅迫后，均受到不同程度的傷害，導(dǎo)致丙二醛含量的升高，脅迫過程中ROS的不斷積累，促使植物產(chǎn)生更多脯氨酸消除ROS，而蕓香草細胞膜是受干旱脅迫影響最大的一個草種。該結(jié)果與干旱脅迫下對不同品種早熟禾(Poaspp.)[26]、狗牙根(Cynodondactylon)[27]、以及扭黃茅[20]等的研究結(jié)果一致。同樣，可溶性糖作為植物重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，通過降低水勢，提高水分主動積累以此緩解水分虧缺對植物造成的不利影響[28-29]。本研究中，隨干旱時間增加，6個草種可溶性糖整體呈現(xiàn)增加的趨勢。其中，茅葉藎草、紅毛草、三芒草可溶性糖呈現(xiàn)先減少后增加的趨勢，其原因可能是植物在脅迫初期，植物為適應(yīng)該逆境，主動消耗部分可溶性糖完成體內(nèi)代謝調(diào)節(jié)，或者隨著脅迫時間的延長，植物本身的滲透調(diào)節(jié)機制受到抑制，即淀粉分解為葡萄糖的化學(xué)反應(yīng)受到阻礙，但隨著干旱脅迫加劇，植物在適宜環(huán)境后便不斷積累更多的可溶性糖以此減緩脅迫對植物的危害[30]。

植物在受到干旱脅迫初期，低濃度的ROS可起到調(diào)節(jié)植物生長以及發(fā)出脅迫響應(yīng)信號的作用，然而過多的ROS積累會破壞生物膜的結(jié)構(gòu)及功能?？寡趸赶到y(tǒng)會對ROS進行清除，平衡植物因脅迫產(chǎn)生的過量ROS，通常植物持續(xù)受到脅迫后會造成ROS的過量積累[31-32]。本研究結(jié)果顯示，在干旱條件下6個草種過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)含量均高于對照組，與前人研究結(jié)果一致[33-34]。植物為避免遭受干旱脅迫帶來損害，持續(xù)產(chǎn)生抗氧化劑和次生代謝物清除積累過多的ROS，保護植物生物膜結(jié)構(gòu)及功能，從而提高植物對干旱脅迫的耐受性，因此抗氧化酶活性不斷升高[35-36]。復(fù)水后，6個草種POD和SOD活性有所降低，但均未能恢復(fù)至對照水平。而水蔗、三芒草、黃花豬屎豆、紅毛草的的CAT活性低或接近對照組，蕓香草、茅葉藎草CAT活性有所降低但未能恢復(fù)至對照組。復(fù)水后大部分種質(zhì)抗氧化酶活性未能恢復(fù)至對照組，其原因可能是干旱脅迫對6個草種的損害超出了抗氧化酶清除ROS的能力范圍，水蔗、三芒草、黃花豬屎豆和紅毛草CAT活性低于或接近對照組也顯示存在復(fù)水時間不足的可能性。

綜上所述，隨著干旱程度的加深，不同草種在同一土壤水分梯度下的脅迫響應(yīng)也不盡相同，復(fù)水后，各指標(biāo)得到了一定恢復(fù)。通過隸屬函數(shù)法對干熱河谷6個鄉(xiāng)土草種在干旱脅迫下的生物學(xué)形態(tài)特征指標(biāo)和生理生化特性指標(biāo)進行綜合比較，得出茅葉藎草抗旱能力最佳，其次是水蔗、三芒草、蕓香草、紅毛草，黃花豬屎豆抗旱能力最弱。由此可見，茅葉藎草是干熱河谷地區(qū)生態(tài)修復(fù)與草地建植的較優(yōu)鄉(xiāng)土草種。