丹參素?；?L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯中間體縮合反應(yīng)工藝?

余麗麗,譚 雄,2,張怡心,2,胡婭琪,楊 寬,秦 蓓??

(1.西安醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥物研究所西安市多靶協(xié)同抗高血壓創(chuàng)新藥物研制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,陜西西安 710021;2.成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,四川成都 610500)

高血壓是一種復(fù)雜的的心血管綜合癥,是具有多因素、多通路、多靶點(diǎn)的生物網(wǎng)絡(luò)性疾病,其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、治療較為困難[1]。普利類抗高血壓藥物屬于血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACEI)類抗高血壓藥物,是臨床采用的一線藥物[2]。臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)普利類藥物可引起干咳、腎衰竭、血管性水腫等副作用[3],降低或者避免副作用是普利類藥物開發(fā)的要點(diǎn)。丹參素具有腦保護(hù)、心肌保護(hù)、肝保護(hù)、腎臟保護(hù)、血管保護(hù)等活性,且能與血管緊張素轉(zhuǎn)化酶活性中心的鋅離子絡(luò)合,實(shí)現(xiàn)協(xié)同降壓[4]。冰片具有抗炎、抗心肌缺血、芳香開竅、促小分子的透膜吸收的作用,能夠提高藥物的生物利用度[5]。據(jù)此,在組合中藥分子化學(xué)的策略下,前期研究證實(shí)基于以上理論設(shè)計(jì)篩選出來的普利母核候選化合物(丹參素酰基-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯)具有良好的降壓功效,能夠?qū)崿F(xiàn)臟器保護(hù)。

丹參素酰基-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的合成路線見圖1[6-7],其中涉及了5種中間體的合成。

圖1 丹參素?；?L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的合成路線

其中,Boc-L-脯氨酸冰片酯和Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯中間體的合成屬于縮合反應(yīng)。為提高工業(yè)化生產(chǎn)的可行性,作者對中間體Boc-L-脯氨酸冰片酸、Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的合成工藝進(jìn)行重點(diǎn)研究,為丹參素?；?L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的工業(yè)化生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

DCM、DMF、四氫呋喃(THF)、二甲基亞砜(DMSO)、三氯氧磷(POCl3)、三乙胺(TEA):分析純,天津市恒興化學(xué)試劑公司;Boc-L-脯氨酸(Boc-L-Pro)、Boc-L-丙氨酸(Boc-L-Ala)、1-羥基苯并三唑(HOBT)、EDCI、DMAP、2-(7-氮雜苯并三氮唑)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸鹽(HATU)、O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)、六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷(Py BOP)、N,N-二異丙基乙胺(DIPEA):分析純,純度≥99%,上海阿拉丁公司;冰片、丹參素:西北大學(xué)。

高效液相色譜儀:Agilent 1260,三重四級桿質(zhì)譜:Agilent 6460,美國安捷倫公司;核磁共振波譜儀:AVANCE Ⅲ(400MHz),德國瑞士Bruker公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀:N-1210,真空干燥箱:VOS-210C,日本RIKAKIKAI EYELA;紫外分析儀:ZF-7N,上海嘉鵬科技;磁力加熱攪拌器:HJ-2A,常州國華電器;電子分析天平:FA224,上海舜宇恒平科學(xué)儀器。

1.2 丹參素酰基-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯合成過程中縮合反應(yīng)方法

1.2.1 Boc-L-脯氨酸冰片酯的合成

常壓,在燒瓶內(nèi)分別加入150 m L PCM、DMF、THF等溶劑,加入冰片充分溶解后,加入Boc-L-脯氨酸,溶解完全后加入縮合劑,反應(yīng)一定時(shí)間,通過薄層色譜(TLC)檢測反應(yīng)是否完全。通過紫外、碘熏、茚三酮顯色劑、香草醛顯色劑等多種方式進(jìn)行TLC顯色檢測。待反應(yīng)完全后,加入乙酸乙酯(10 m L),用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌,水相用乙酸乙酯萃取3次,合并有機(jī)相,用飽和碳酸氫鈉、蒸餾水、w(HCl)＝10%水溶液、飽和氯化鈉洗滌有機(jī)相,用無水硫酸鈉干燥后,濃縮、真空干燥后,稱量,計(jì)算產(chǎn)率。

1.2.2 Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的合成

稱取一定量的化合物5,分別加入PCM、DMF、THF等溶劑,攪拌使Boc-L-脯氨酸冰片酯充分溶解。再加入Boc-L-丙氨酸,溶解后加入縮合劑,反應(yīng)一定時(shí)間,TLC 監(jiān)控反應(yīng)。加入少量乙酸乙酯后,用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌。水相用乙酸乙酯萃取3~4次,合并有機(jī)相,用飽和碳酸氫鈉水溶液洗滌3 次,蒸餾水洗滌1 次,w(HCl)＝10%水溶液洗滌3 次,飽和氯化鈉水溶液洗滌2次。洗滌后用無水硫酸鈉干燥、濃縮、真空干燥后,稱量,計(jì)算產(chǎn)率。

2 結(jié)果與討論

2.1 Boc-L-脯氨酸冰片酯合成工藝優(yōu)化

2.1.1 縮合劑種類和用量的考察

采用1.2.1的合成方法,固定Boc-L-脯氨酸、冰片以及選定的2種縮合劑的物質(zhì)的量比為1∶1∶1∶1,如果是一種縮合劑,則物質(zhì)的量之比為1∶1∶1,V(反應(yīng)溶劑)∶m(Boc-L-脯氨酸)為1∶6 ml/g,固定反應(yīng)時(shí)間為6 h,考察縮合劑種類對實(shí)驗(yàn)的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表1。

表1 縮合劑種類對化合物5合成產(chǎn)率的影響

由表1可知,單獨(dú)使用縮合劑EDCI,產(chǎn)率較低,通過TLC發(fā)現(xiàn)體系復(fù)雜、雜質(zhì)含量多,這是因?yàn)轸人岜籈DCI活化后形成的中間體不穩(wěn)定,易轉(zhuǎn)化為副產(chǎn)物脲,通?？梢约尤氪呋瘎┤鏒MAP、HOBT 等能形成相對穩(wěn)定的活性中間體,進(jìn)而實(shí)現(xiàn)羧酸與醇的縮合酯化[8]。實(shí)驗(yàn)以EDCI 與DMAP為復(fù)合縮合劑,發(fā)現(xiàn)反應(yīng)的處理和純化相對容易,反應(yīng)產(chǎn)率高,體系的雜質(zhì)較少。此外,實(shí)驗(yàn)還考察了EDCI和HOBT組合、EDCI和TEA組合及DMAP,發(fā)現(xiàn)均不能得到反應(yīng)的目標(biāo)產(chǎn)物。實(shí)驗(yàn)還通過POCl3將羧酸轉(zhuǎn)化成酰氯后與醇反應(yīng)生成酯[9-10],同時(shí)加入有機(jī)堿作為縛酸劑促使反應(yīng)正向進(jìn)行。由表1可知,POCl3參與的反應(yīng)雖然能夠進(jìn)行,但是產(chǎn)率較低,最終確認(rèn)EDCI、DMAP為最優(yōu)縮合劑。

考察了縮合劑n(EDCI)∶n(DMAP)的對反應(yīng)產(chǎn)率的影響,結(jié)果見圖2。

圖2 縮合劑比例對化合物5產(chǎn)率的影響

由圖2可知,隨著EDCI投入量逐漸加大,反應(yīng)產(chǎn)率表現(xiàn)出先上升后下降趨勢,n(EDCI)、n(DMAP)＝1.5∶0.1反應(yīng)產(chǎn)率最高,為98.5%。

2.1.2 反應(yīng)溶劑的考察

據(jù)文獻(xiàn)[12]報(bào)道,常用于酯縮合反應(yīng)的溶劑有DCM、DMF、THF 等非質(zhì)子型溶劑,因此將以上溶劑及其混合溶劑作為考察溶劑。實(shí)驗(yàn)固定n(Boc-L-脯氨酸)∶n(冰片物質(zhì))＝1∶1,縮合劑n(EDCI)、n(DMAP)＝1.5∶0.1,n(反應(yīng)溶劑)∶n(Boc-L-脯氨酸)＝6∶1 m L/g,反應(yīng)時(shí)間為6 h,考察不同反應(yīng)溶劑對實(shí)驗(yàn)的影響,結(jié)果見圖3。

圖3 溶劑對化合物(5)產(chǎn)率的影響

由圖3可知,以DCM 作為溶劑,反應(yīng)產(chǎn)率最高,可達(dá)85.08%,TLC結(jié)果顯示雜質(zhì)較少。而以DMF、THF、DCM＋DMF、DCM＋THF、DMF＋THF為反應(yīng)溶劑,產(chǎn)物中雜質(zhì)較多,產(chǎn)率較低。因此確定DCM 為最優(yōu)反應(yīng)溶劑。

2.1.3 反應(yīng)物投料比和反應(yīng)時(shí)長的考察

縮合劑n(EDCI)∶n(DMAP)＝1.5∶0.1,V(DCM)∶m(Boc-L-脯氨酸)＝6∶1 mL/g,反應(yīng)時(shí)間為6 h,考察n(Boc-L-脯氨酸)∶n(冰片)對反應(yīng)的影響,結(jié)果見圖4。由圖4a可知,n(Boc-L-脯氨酸)∶n(冰片)＝1.2∶1,產(chǎn)率最高,為97.55%。

圖4 反應(yīng)物投料比和反應(yīng)時(shí)間對化合物(5)產(chǎn)率的影響

固定n(Boc-L-脯氨酸)∶n(冰片)∶n(EDCI)∶n(DMAP)＝1∶1∶1.5∶0.1,V(DCM)∶m(Boc-L-脯氨酸)＝6∶1 m L/g,考察了反應(yīng)時(shí)間對產(chǎn)率的影響,結(jié)果見圖4b。由圖4b可知,隨反應(yīng)時(shí)間的增加,目標(biāo)物產(chǎn)率逐漸增大,當(dāng)t＝5 h產(chǎn)率趨于平穩(wěn),因此確定最佳反應(yīng)時(shí)間5 h。

2.2 Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯合成工藝優(yōu)化

2.2.1 縮合劑的考察

酰胺化反應(yīng)較難發(fā)生,需加入縮合劑促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行,常見的縮合劑有EDCI、鎓鹽類縮合劑等。其中,EDCI屬于碳二亞胺類縮合劑,在多肽生產(chǎn)中應(yīng)用較為廣泛,但在進(jìn)行片段縮合時(shí),易導(dǎo)致消旋,所以通常與DMAP、HOBT 一起使用,以抑制消旋化[11]。鎓鹽類縮合劑活性較高,常用的有HATU、HBTU、PyBOP等,其中PyBOP活性最高,一般在其他方法不反應(yīng)時(shí)使用[11-12],而HATU 活性高于HBTU。DIPEA 則常用作堿配合鎓鹽類縮合劑來催化反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)采用1.2.2的合成方法,固定Boc-L-脯氨酸冰片酯、Boc-L-丙氨酸、2種縮合劑的物質(zhì)的量之比為1∶1∶1∶1,V(反應(yīng)溶劑)∶m(Boc-L-丙氨酸)＝12∶1 m L/g,控制反應(yīng)時(shí)間為6 h,對以上的幾種縮合體系進(jìn)行了篩選,結(jié)果見圖5a。

圖5 縮合劑種類和縮合劑用量對化合物8產(chǎn)率的影響

由圖5a可知,實(shí)驗(yàn)選擇的幾種常用縮合體系產(chǎn)率均高于80%的,EDCI和DMAP的組合的產(chǎn)率最高,超過90%,實(shí)驗(yàn)過程中,綜合考察了TLC監(jiān)控結(jié)果和原料的成本等各方面問題,確定EDCI/DMAP為最優(yōu)縮合體系。

此外考察了EDCI/DMAP 的比例對產(chǎn)率的影響,結(jié)果見圖5b。由圖5b 可知,發(fā)現(xiàn)隨著EDCI投入量逐漸加大,反應(yīng)產(chǎn)率表現(xiàn)出先上升后下降趨勢,n(EDCI)∶n(DMAP)＝3∶1反應(yīng)產(chǎn)率最高,為92.1%。

2.2.2 反應(yīng)溶劑的考察

以DMAP/EDCI為縮合劑時(shí),常采用的溶劑有DCM、DMF、THF、DMSO,固定n(Boc-L-脯氨酸冰片酯)∶n(Boc-L-丙氨酸)∶n(DMP)∶n(EDCI)＝1∶1∶1∶3,V(溶劑)＝16 m L,t＝6 h,考察常規(guī)溶劑及其溶劑之間的混合使用對反應(yīng)的影響,結(jié)果見圖6。

由圖6可知,以上6種情況反應(yīng)均能夠順利進(jìn)行,并且產(chǎn)率均高于到80%,其中在V(DCM)∶V(DMF)＝1∶1,混合溶劑中產(chǎn)率最高,為97.02%,因此確定其為最佳反應(yīng)溶劑。

2.2.3 反應(yīng)物投料比和反應(yīng)時(shí)長的考察

固定縮合劑n(DMAP)∶n(EDCI)＝1∶3,反應(yīng)溶劑為16 m L DCM 和DMF 混合溶劑,t＝6 h。反應(yīng)物投料比和反應(yīng)時(shí)間對化合物8產(chǎn)率的影響見圖7。

圖7 反應(yīng)物投料比和反應(yīng)時(shí)間對化合物8產(chǎn)率的影響

由圖7a可知,反應(yīng)物投料比對產(chǎn)率具有顯著的影響,主要表現(xiàn)為隨著Boc-L-丙氨酸量的增加,產(chǎn)率先增后減,n(Boc-L-脯氨酸冰片酯)∶n(Boc-L-丙氨酸)＝1∶1.1產(chǎn)率最高,為97.23%,為最佳投料比。研究發(fā)現(xiàn)n(Boc-L-脯氨酸冰片酯)∶n(Boc-L-丙氨酸)分別為1∶1.2、1∶1.3、1∶1.4時(shí)均出現(xiàn)顯著的低極性雜質(zhì)。由圖7b可知,產(chǎn)率隨著時(shí)間推移逐漸增大,t＝6 h后趨于平穩(wěn),產(chǎn)率超過97%,故最佳反應(yīng)時(shí)間為6~7 h。

2.3 結(jié)構(gòu)表征

通過核磁共振氫譜和質(zhì)譜對化合物Boc-L-脯氨酸冰片酯5、Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯8的結(jié)構(gòu)進(jìn)行表征。

Boc-L-脯氨酸冰片酯5:1H-NMR(400 MHz,Chloroform-d)δ4.95~4.80(m,1 H,f),4.23(ddd,J＝38.3,8.6,2.9 Hz,1 H,e),3.56~3.26(m,2 h,b),2.43~2.02(m,2 h,d),1.93~1.79(m,4 H,g,c),1.73~1.59(m,2 h,g),1.39(s,3 H,a),1.36(s,6 h,a),1.26~1.12(m,2 h,g),0.92(ddd,J＝17.2,14.0,3.4 Hz,1H,g),0.84(d,J＝5.9 Hz,3 H,h),0.80(d,J＝4.8 Hz,3 H,h),0.76(d,J＝6.1 Hz,3H,h)?；衔?的相對分子質(zhì)量為351.5,質(zhì)譜檢測獲得m/z＝725.70,為(2M＋Na),相對分子質(zhì)量符合。

Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯8:1H-NMR(400 MHz,Chloroform-d),δ4.98(ddd,J＝10.1,3.4,2.0 Hz,1 H,h),4.58(dd,J＝8.8,3.7 Hz,1 H,f),4.55~4.40(m,1H,d),3.79~3.59(m,2H,a),2.36(tt,J＝9.8,4.1 Hz,1H,c),2.30~2.22(m,1 H,c),2.05(tdd,J＝12.1,7.9,3.1 Hz,3 H,b,g),1.90(ddd,J＝14.5,9.9,4.4 Hz,1H,b,g),1.80~1.69(m,2 H,b,g),1.45(s,9 H,j),1.38(d,J＝6.8 Hz,3H,i),1.29(dt,J＝7.2,3.8 Hz,2 H,g),1.10~0.94(m,1 H,g),0.91(s,3 H,e),0.89(s,3 H,e),0.83(s,3H,e)?；衔?的相對分子質(zhì)量為422.6,質(zhì)譜檢測獲得m/z＝423.40,為(M＋1),相對分子質(zhì)量符合。

3 結(jié) 論

針對丹參素?；?L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯合成中的關(guān)鍵中間體Boc-L-脯氨酸冰片酯和Boc-L-丙氨酰脯氨酸冰片酸、Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的合成工藝進(jìn)行優(yōu)化。

(1)Boc-L-脯氨酸冰片酯的最優(yōu)合成工藝為以n(EDCI)∶n(DMAP)＝1.5∶0.1為縮合劑,以DCM 為溶劑,n(Boc-L-脯氨酸)∶n(冰片)＝1.2∶1,反應(yīng)時(shí)長5 h。

(2)Boc-L-脯氨酸冰片酸、Boc-L-丙氨酰-L-脯氨酸冰片酯的最優(yōu)合成工藝為以n(EDCI)∶n(DMAP)＝3∶1作為縮合劑,以DCM 和DMF(1∶1)為溶劑,n(Boc-L-脯氨酸冰片酯)∶n(Boc-L-丙氨酸)＝1∶1.1反應(yīng)時(shí)間為6~7 h。

優(yōu)化后的縮合工藝,減少了副反應(yīng)的發(fā)生和雜質(zhì)的升恒,提高了產(chǎn)率,更利于后期的工藝的放大。