Gas6/MerTK通路誘導線粒體自噬在肺癌進展的機制研究

陸 勤, 張婷婷, 陳明治

(江蘇省宜興市人民醫(yī)院/江蘇大學附屬宜興醫(yī)院, 江蘇 宜興 214200)

肺癌是世界范圍內最常見且最致命的惡性腫瘤之一[1],全球每年新增病例約220萬例,死亡人數約為180萬人,中國新發(fā)病例占其中1/3[2]。值得關注的是,在中國最常見的10種癌癥中,肺癌的5年存活率最低。目前,肺癌的死亡率持續(xù)上升,已嚴重威脅公共健康。生長停滯特異性蛋白6(Growth arrest specific protein 6,Gas6)/Mer原癌基因酪氨酸酶(Mer Protooncogene tyrosinase,MerTK)通路在非小細胞肺癌細胞增殖中發(fā)揮重要作用[3],深入研究該通路在肺癌中的機制,可能為肺癌的治療提供新的策略。在不同的腫瘤病變中,線粒體自噬的作用不同。既往研究表明,自噬可能在肺癌的發(fā)展過程以及治療中發(fā)揮關鍵作用[4]。然而,Gas6/MerTK信號通路是否可通過調控肺癌細胞中的線粒體自噬從而影響肺癌的發(fā)生發(fā)展,尚未闡明。本研究利用Calu-1和A-427兩種肺癌細胞系,通過加入AVB-500抑制Gas6的表達,進而加入自噬誘導劑雷帕霉素(Rapamycin,RAPA)探究Gas6/MerTK信號對肺癌細胞線粒體自噬及肺癌進展的影響。

1 材料與方法

1.1試劑與儀器:Gas6抗體(美國Sigma-Aldrich)、MerTK抗體(英國abcam公司)、LC3Ⅱ抗體(美國CST公司)、Beclin1抗體、GAPDH抗體(美國Affinity生物技術公司)、AVB-500、雷帕霉素(上海皓元生物醫(yī)藥科技有限公司)、CCK-8試劑盒(北京愛思力克科技有限公司)、熒光倒置顯微鏡(德國Leica公司)、酶標儀(美國Thermo Scientific公司)。

1.2實驗分組與方法

1.2.1分組和干預:培養(yǎng)Calu-1與A-427細胞系,根據實驗設計分組:(1)對照組、Gas6干預組(25μmoL/L AVB-500干預24h);(2)對照組、雷帕霉素(RAPA,10μmoL/L干預24h)組;各組均設置6個重復樣本。

1.2.2Western blotting 檢測肺癌細胞中Gas6、MerTK、LC3Ⅱ、Beclin1蛋白表達水平:收集干預各組Calu-1與A-427細胞,根據細胞數量加入細胞裂解液,渦旋震蕩后置于冰上靜置,再離心5min,靜置15min,上清液即為蛋白液,將蛋白原液分裝,在100℃金屬浴中進行蛋白變性,配制上樣體系和合適濃度的凝膠,向各個膠塊孔道中加入相同質量的樣品進行電泳,轉膜,封閉,在4℃冰箱中分別孵育Gas6抗體(1∶1000)、MerTK抗體(1∶1000)、LC3Ⅱ抗體(1∶1000)、Beclin1抗體(1∶1000)、室溫孵育二抗(1∶5000)、每個間隙均使用PBST清洗10min,重復3次,最后將條帶用發(fā)光液均勻浸沒曝光,并用ImageJ軟件統計分析。

1.2.3透射電鏡檢測Calu-1與A-427細胞自噬小體:收集干預各組Calu-1與A-427細胞,加入2.5%戊二醛避光固定30min,離心去上清加入1%瓊脂糖溶液懸浮細胞,加入1%鋨酸避光固定細胞,每個間隙均用磷酸緩沖液漂洗。將各組Calu-1與A-427細胞在上行梯度酒精中脫水,在37℃培養(yǎng)箱中使用丙酮和812包埋劑混合劑處理2h,將包埋板烘烤48h,將樹脂塊超波切片。使用2%醋酸鈾飽避光染色8min,枸櫞酸鉛溶液染色8min,各個間隙使用去離子水清洗,干燥過夜。透射電鏡觀察各組細胞自噬小體。

1.2.4平板克隆檢測Calu-1與A-427細胞增殖能力:將Calu-1與A-427細胞接種到6孔板,分組干預并培養(yǎng)至克隆團數量超過50個,PBS清洗,加入甲醛溶液處理15min后棄去甲醛溶液,使用結晶紫染色克隆團10min,清洗染色液,最后拍照并用ImageJ軟件計數。

1.2.5CCK-8檢測Calu-1與A-427細胞活力:將Calu-1與A-427細胞接種到96孔板中,培養(yǎng)一定時間,對照組不進行處理,Gas6干預組和RAPA組細胞干預24h后,將各組分別在0h、24h、48h、72h內加入CCK-8溶液,培養(yǎng)2h,待酶標儀溫度升至37℃檢測各孔OD值,最后計算各組細胞活力。

1.2.6細胞劃痕實驗檢測Calu-1與A-427細胞遷移能力:將Calu-1與A-427細胞接種到6孔板,分組干預后待細胞長至85%,用20μL的滅菌槍頭在各孔正中央劃一條直線,培養(yǎng)至0h和24h取出后用PBS清洗,分別在顯微鏡下拍照記錄,培養(yǎng)至0h觀察后的細胞加入新鮮培養(yǎng)基(無血清)置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)至24h,使用ImageJ測量遷移距離。

1.2.7免疫熒光染色檢測Calu-1與A-427中LC3表達情況:將Calu-1與A-427細胞接種到12孔板,分組干預后待細胞長滿后用PBS清洗,棄去PBS,多聚甲醛固定肺癌細胞處理25min,加入配置的0.5%TritonX-100處理5min,加入配套的封閉液處理30min,PBS清洗后,加入LC3抗體(1∶200)在4℃冰箱中孵育過夜,次日,PBS清洗后,加入對應的二抗(1∶50)避光孵育,使用DAPI染細胞核8min,最后在黑暗的環(huán)境中使用熒光顯微鏡觀察拍照。

2 結 果

2.1抑制Gas6對肺癌細胞Gas6、MerTK 的蛋白水平的影響:與對照組相比,Gas6干預組Calu-1細胞Gas6(F=17.34,P<0.05)、MerTK(F=13.86,P<0.05)與A-427細胞Gas6(F=19.01,P<0.05)、MerTK(F=8.31,P<0.05)蛋白水平顯著降低(圖1)。

圖1 Calu-1細胞與A-427細胞中Gas6、MerTK的蛋白表達水平

圖2 Calu-1細胞與A-427細胞自噬水平

圖3 Calu-1細胞與A-427細胞克隆、活性、遷移能力

圖4 誘導自噬對Calu-1細胞與A-427細胞克隆、增殖、遷移能力

2.2抑制Gas6對肺癌細胞線粒體自噬能力的影響:與對照組相比,Gas6干預組Calu-1細胞LC3Ⅱ(F=7.55,P<0.05)、Beclin1(F=9.03,P<0.05)與A-427細胞LC3Ⅱ(F=7.80,P<0.05)、Beclin1(F=8.87,P<0.05)的蛋白水平顯著增加(圖2A-B),且Calu-1細胞與A-427細胞中自噬小體形成,大量自噬空泡聚集(圖2C)。

2.3抑制GAS6對肺癌細胞克隆、活性、遷移的影響:與對照組相比,Gas6干預組Calu-1細胞克隆能力顯著降低(圖3A-B,F=6.23,P<0.05)、細胞活力顯著降低(圖3C,F=3.68,P<0.05)、細胞遷移距離顯著減少(圖3D-E,F=19.60,P<0.05)。A-427細胞細胞克隆能力顯著降低(圖3A-B,F=10.28,P<0.05)、細胞活力顯著降低(圖3C,F=3.79,P<0.05)、細胞遷移距離顯著減少(圖3D-E,F=11.62,P<0.05)。

2.4誘導線粒體自噬對肺癌細胞克隆、活性、遷移的影響:與對照組相比,Calu-1細胞中,RAPA組LC3蛋白表達增加(F=6.43,P<0.05)、Cas6干擾組的LC3蛋白表達增加(F=8.71,P<0.05),A-427細胞中RAPA組LC3蛋白表達增加(F=7.84,P<0.05),Cas6干擾組的LC3蛋白表達增加(圖4A,F=8.26,P<0.05);與對照組相比,Calu-1細胞中RAPA組細胞克隆能力顯著降低(圖4B,F=7.90,P<0.05)、細胞活力顯著降低(圖4C,F=3.02,P<0.05)、細胞遷移距離顯著減少(圖4D-E,F=10.47,P<0.05),A-427細胞細胞克隆能力顯著降低(圖4B,F=9.26,P<0.05)、細胞活力顯著降低(圖4C,F=3.46,P<0.05)、細胞遷移距離顯著減少(圖4D-E,F=12.25,P<0.05)。

3 討 論

肺癌是北美和其他發(fā)達國家癌癥相關死亡疾病的首要原因,通常晚期才被診斷出[5],且只有不到7%的患者在診斷后存活達到10年[6]。目前仍缺乏有效的治療藥物,這提醒我們需要更深入了解導致肺癌進展的可能影響機制。Gas6是一種維生素K依賴性分泌蛋白,參與自身免疫性疾病、腫瘤、血栓性疾病、病毒感染等疾病的過程[7-8]。Gas6在肺、腫瘤組織、心臟等組織中高表達,可與其受體Axl、Tyro3和MerTK結合,調控下游信號通路從而影響腫瘤的生長、遷移[9-10]。MerTK在人類多種癌組織中高表達,臨床試驗顯示以MerTK為干預點的療法可能具有抗癌效果[11]。既往研究顯示,干預Gas6/MerTK信號通路,在抗癌中發(fā)揮有效作用。值得關注的是,Gas6/MerTK通路在非小細胞肺癌細胞增殖中發(fā)揮重要作用[3],因此,深入研究其涉及的更多可能分子機制或許可為臨床攻克肺癌這一大難題提供新的線索。

線粒體自噬是細胞利用溶酶體酶特異性清除損傷或多余線粒體的過程,在肺癌細胞的增殖、遷移中發(fā)揮重要作用[12]。謝利等[13]研究發(fā)現,沉默Gas6可調控自噬參與石英塵小鼠的肺部炎癥損傷。高雅婷等[14]研究顯示,芪玉三龍湯可上調Beclin1、LC3的蛋白表達,促進LC3Ⅰ向LC3Ⅱ轉化,從而誘導肺癌細胞自噬。這提示肺癌病變機制中可能也存在Gas6調控自噬過程。本研究通過選用人肺癌細胞系Calu-1與A-427進行研究,實驗結果顯示,肺癌細胞中Gas6、MerTK蛋白高表達,通過抑制Gas6蛋白表達,上述蛋白表達下降的同時線粒體自噬相關蛋白LC3Ⅱ、Beclin1蛋白水平增加,肺癌細胞胞質中可見自噬空泡聚集,肺癌細胞的克隆能力下降、細胞活力降低、細胞遷移相對距離減少。為了進一步驗證Gas6/MerTK信號通路與線粒體自噬在肺癌細胞中的作用機制,我們使用自噬誘導劑RAPA進行研究,結果顯示肺癌細胞中LC3表達增加,細胞克隆能力下降、細胞活力降低、細胞遷移相對距離減少。

綜上所述,Gas6/MerTK信號通路與線粒體自噬在肺癌進展中發(fā)揮重要作用,下調Gas6/MerTK信號通路可誘導肺癌細胞線粒體自噬,使肺癌細胞增殖、遷移能力下降。然而,本研究選用的是肺癌細胞系,若是收集臨床肺癌標本、提取原代肺癌細胞或許能更具有說服力。此外,本研究只是初步探究了在肺癌細胞中Gas6/MerTK信號通路與線粒體自噬可能關系,關于二者之前可能存在的具體機制仍有待研究。