納木措沿岸區(qū)可培養(yǎng)細菌多樣性季節(jié)差異及其理化影響因素

鄭艷艷,賀 凱,孟華旦尚,德 吉,郭小芳① (.西藏大學(xué)理學(xué)院,西藏 拉薩 850000;2.西藏自治區(qū)高原生物研究所,西藏 拉薩 850000)

湖泊是研究生態(tài)系統(tǒng)響應(yīng)外界環(huán)境變化的重要場所,其中蘊含著大量的微生物資源,這些微生物推動著湖泊生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)能量與元素循環(huán),維持著湖泊生態(tài)系統(tǒng)的平衡[1]。湖泊細菌作為湖泊生態(tài)系統(tǒng)中食物網(wǎng)的重要組成部分及有機物的主要分解者,探究其物種多樣性、群落分布及其對環(huán)境因素的響應(yīng),對于湖泊生態(tài)系統(tǒng)的保護有著深遠意義。

青藏高原位于亞歐大陸中南部,是我國的西南邊陲[2],該地區(qū)湖泊星羅密布,湖泊總面積超過全國湖泊總面積的50%[3]。青藏高原素有“亞洲水塔”之稱[4],這些湖泊受人為干擾較小,且多數(shù)位于封閉的內(nèi)流區(qū),因此能夠極為迅速地響應(yīng)氣候與冰凍圈的變化,是氣候變化的前哨[5-6],是研究圈層相互作用的重要紐帶[7-8]。納木措地處藏北高原東南部、岡底斯山脈與念青唐古拉山脈北麓之間,湖泊總面積為2 020 km2[9],是一個典型的高原封閉湖泊,關(guān)于納木措水體細菌免培養(yǎng)部分的研究較多[10-13],而可培養(yǎng)部分的研究較少[14]。目前系統(tǒng)針對納木措可培養(yǎng)細菌物種多樣性、群落結(jié)構(gòu)及其對水質(zhì)理化參數(shù)的響應(yīng)規(guī)律的研究鮮有報道。該研究擬在了解納木措不同季節(jié)細菌物種多樣性、群落結(jié)構(gòu)差異的基礎(chǔ)上,探究影響其多樣性與群落分布的主要水質(zhì)理化參數(shù),以期為其中特殊細菌資源的開發(fā)和利用提供資源和參考,同時也可為青藏高原湖泊生態(tài)系統(tǒng)的保護提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況與水樣采集

納木措流域(30°00′～31°10′ N,89°30′～91°25′ E)地處藏北高原東南部,流域面積約10 600 km2,湖面平均海拔約為4 718 m,湖泊北部是起伏較小的丘陵,東南部是念青唐古拉山脈,整個區(qū)域形成了一個相對封閉的盆地,具有典型的高原草地湖泊生態(tài)系統(tǒng)特征,生物多樣性豐富[15]。

分別于2020年8月(夏季)、2021年5月(春季)以及2021年10月(秋季)對納木措進行水樣采集。根據(jù)納木措水體分布情況結(jié)合地理位置差異,共選擇20個樣點采集水體(圖1),由于條件限制無法租用船只進入湖面及湖中央,因此僅在納木措沿岸區(qū)選取采樣點[16]。用無菌采樣器在距岸邊約15 m、距水表約50 cm處采集水樣,每個樣點約采集7.5 L水樣,將其平均裝入3個無菌塑料桶中,1份水樣立即送至西藏博源環(huán)境檢測有限公司測定水質(zhì)理化參數(shù),1份水樣帶回實驗室立即分離其中的可培養(yǎng)細菌[16]。

1.2 水體可培養(yǎng)細菌的分離、純化及保藏

采用直接涂布平板法與稀釋涂布平板法相結(jié)合進行細菌的分離培養(yǎng)。將各個樣點的水樣分別用移液槍取100 μL接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基平板上,使用無菌涂布器將其涂勻后,于恒溫箱中28 ℃條件下倒置培養(yǎng),每個樣點設(shè)3個重復(fù)。待平板上菌落清晰可見時取出現(xiàn)30～300個菌落數(shù)的平板進行計數(shù),其中菌落數(shù)過多的樣點則采用稀釋涂布平板法重新進行分離培養(yǎng)。根據(jù)菌落形態(tài)、顏色、大小等不同表型特征進行初步篩選,選取不同的單菌落進一步分離純化。通過平板四區(qū)劃線法獲得單菌落,將其接種于斜面培養(yǎng)基上生長2～3 d后進行菌株的分子鑒定及菌種的保藏,保藏液使用φ=20%的甘油,于-20 ℃條件下冷凍保藏[16]。

1.3 代表菌株的分子鑒定

采用16S rDNA基因測序技術(shù)進行菌株的分子鑒定。使用的上、下游引物為細菌通用引物[17],由上海生工生物工程股份有限公司合成。PCR結(jié)束將擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠檢測后送至上海生工生物工程股份有限公司進行雙向測序,所有序列均已測通[16]。

將供試菌株的測序結(jié)果進行人工處理后,在NCBI數(shù)據(jù)庫中進行同源序列搜索,從而確定細菌的分類地位。將供試菌株的序列上傳至NCBI核酸數(shù)據(jù)庫并獲取登錄號,春季供試菌株登錄號為OK036813-OK036870,夏季供試菌株登錄號為MW799879-MW799953,秋季供試菌株登錄號為OM010252-OM010326。

1.4 水質(zhì)理化參數(shù)的測定

用多參數(shù)測試筆原位測定水樣pH值、溫度、電導(dǎo)率、鹽度和總?cè)芙夤腆w量,每個參數(shù)重復(fù)測定3次?？偟?、總磷、化學(xué)需氧量、氨氮和濁度5項理化因子送至西藏博源環(huán)境檢測有限公司進行測定[16]。

1.5 數(shù)據(jù)處理及分析

數(shù)據(jù)的處理與分析使用Excel 2010、R 4.1.1、SPSS 22.0與Canoco 4.5等軟件進行,繪圖使用ArcGIS 10.5、R 4.1.1和Origin 2019b等軟件進行。樣點分布圖使用ArcGIS 10.5繪制;采用SPSS 20.0軟件,運用Duncan檢驗法對細菌總豐度進行差異性分析;采用R 4.1.1中的vegan包進行多樣性指數(shù)計算;采用Excel 2010軟件計算細菌的相對豐度、出現(xiàn)頻率及總豐度。

使用R 4.1.1軟件進行正態(tài)性檢驗與方差齊性檢驗,根據(jù)檢驗結(jié)果進行方差分析,再根據(jù)方差分析結(jié)果選擇是否進一步進行Tukey差異顯著性檢驗;使用R 4.1.1中的vegan包和ape包,對不同季節(jié)細菌群落結(jié)構(gòu)進行基于Bray-curtis距離算法的主坐標分析(PCoA),并用相似性分析檢驗組間差異是否大于組內(nèi)差異;使用R 4.1.1中的vegan包和phangorn包,運用非加權(quán)組平均法(UPGMA)計算得到β多樣性距離矩陣,再進行層級聚類分析;采用R 4.1.1進行最小顯著性差異(LSD)檢驗;使用CANOCO 4.5進行細菌群落分布與理化參數(shù)之間的排序分析;使用R 4.1.1中的vegan包對環(huán)境因子差異與群落結(jié)構(gòu)差異的相關(guān)性進行Mantel檢驗;依據(jù)赤池信息量(AIC)準則,使用R 4.1.1軟件中的多元逐步回歸分析建立各群落多樣性指數(shù)與環(huán)境因子之間的最優(yōu)模型,得出多元回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 納木措水體可培養(yǎng)細菌物種多樣性的季節(jié)差異

2.1.1水體可培養(yǎng)細菌總豐度的季節(jié)差異

對不同季節(jié)細菌總豐度進行統(tǒng)計可知,春夏秋3個季節(jié)總豐度分別為1.67×106、8.19×106、8.38×105L-1,即總豐度在夏季最高、秋季最低。Duncan差異性分析結(jié)果顯示,3個季節(jié)間細菌總豐度雖存在差異,但未達顯著水平(P>0.05)。

2.1.2水體可培養(yǎng)細菌物種多樣性的季節(jié)差異

采用細菌物種數(shù)、屬數(shù)、Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)及Pielou均勻度指數(shù)對細菌多樣性進行評估(圖2)。

*表示P<0.05。

結(jié)果顯示,細菌物種數(shù)在春季最多、夏季最少,另外4項指數(shù)均在秋季最高、夏季最低。分別對各項物種多樣性指數(shù)進行方差分析,結(jié)果表明,物種數(shù)(P=0.018)、屬數(shù)(P=0.019)、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(P=0.025)及Simpson優(yōu)勢度指數(shù)(P=0.029)在不同季節(jié)間均存在顯著差異(圖2),而Pielou均勻度指數(shù)在3個季節(jié)間差異未達顯著水平(P=0.791)。使用Tukey檢驗分別對上述各季節(jié)間存在顯著差異的4項指數(shù)進行兩兩比較,這4項指數(shù)均僅在夏秋間存在顯著差異(P<0.05),而春夏間、春秋間差異均未達顯著水平(P>0.05)。

2.2 納木措水體可培養(yǎng)細菌群落結(jié)構(gòu)季節(jié)差異

為探究細菌群落結(jié)構(gòu)差異的季節(jié)性變化,計算了不同季節(jié)水樣間的Bray-curtis距離,使用PCoA來繪制不同季節(jié)水樣的二維分布圖。由圖3可見,不同季節(jié)細菌群落結(jié)構(gòu)存在一定差異,其中春季和夏季的樣品點在坐標軸上距離相對較近,且有少量重疊部分,這表明春季和夏季水樣中細菌群落結(jié)構(gòu)比較相似;而秋季樣品點與春季、夏季樣品點在坐標軸上距離均較遠,說明秋季水樣中的細菌群落結(jié)構(gòu)與春季、夏季差異較大。此外,與秋季樣品點相比,春季、夏季樣品點在排序圖上的分布格局較疏散,而秋季樣品點分布格局較為集中,說明秋季細菌群落空間分化程度較春季和夏季低。春季和夏季受雨季降雨量大和冰川、積雪融水的影響,納木措湖泊水體擴散能力增強,從而導(dǎo)致細菌群落結(jié)構(gòu)在空間上具有較高的相似度。使用UPGMA計算β多樣性距離矩陣并進行層級聚類分析,可視化呈現(xiàn)不同季節(jié)樣本中群落結(jié)構(gòu)的相似或差異程度,其結(jié)果驗證了PCoA分析結(jié)果。

圖3 不同季節(jié)間細菌群落組成的主坐標(PCoA)分析Fig.3 Principal coordinate analysis of bacterial community composition in different seasons

通過ANOSIM檢驗組間差異顯著性來判斷分組是否有意義。從圖4可見,組間差異顯著大于組內(nèi)差異(r=0.87,P=0.001),說明分組有意義,表明隨著采樣季節(jié)的改變,水體細菌群落結(jié)構(gòu)也會發(fā)生顯著變化。

圖4 不同季節(jié)間細菌群落組成的相似性分析Fig.4 ANOSIM of bacterial communities in different seasons

2.3 納木措水體可培養(yǎng)細菌物種組成季節(jié)性比較

通過傳統(tǒng)純培養(yǎng)方法從3個季節(jié)水樣中分別獲得可培養(yǎng)細菌559、681、637株,共計1 877株。分子鑒定結(jié)果顯示,春季559株細菌隸屬于4門7綱12目16科22屬48種,夏季681株細菌隸屬于4門6綱11目15科16屬43種,秋季637株細菌隸屬于4門7綱14目20科25屬46種,所有菌株隸屬于4門7綱15目26科34屬87種。在3個季節(jié)中,春季物種數(shù)最多。

根據(jù)分類學(xué)分析結(jié)果可知不同季節(jié)各個分類單元水平上的物種組成情況。就門分類水平而言,3個季節(jié)水樣中的物種均分布于4個細菌門,分別為放線菌門(Actinobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、厚壁菌門(Firmicutes)以及變形菌門(Proteobacteria)。在春季水樣中,厚壁菌門(Firmicutes)為優(yōu)勢門,占比為51.04%;而在夏季和秋季水樣中,變形菌門為優(yōu)勢門,占比分別為72.00%和62.67%。在屬分類水平上,3個季節(jié)間共有屬包括氣單胞菌屬(Aeromonas)、芽孢桿菌屬(Bacillus)等12屬,占比為35.29%;春夏共有屬較多,包括不動桿菌屬(Acinetobacter)、氣單胞菌屬等15屬,占比為65.22%;春秋共有屬包括氣單胞菌屬、芽孢桿菌屬等14屬,占比為42.42%;夏秋共有屬包括氣單胞菌屬、芽孢桿菌屬等12屬,占夏秋所有屬的41.38%。此外,3個季節(jié)的特有屬分別為5、1、11個。就種分類水平而言,根據(jù)不同季節(jié)細菌物種數(shù)的韋恩圖(圖5)可知,3個季節(jié)共有物種包括溫和氣單胞菌(Aeromonassobria)、短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)等13種,占比為14.94%;春夏共有物種包括約氏不動桿菌(Acinetobacterjohnsonii)、米不動桿菌(Acinetobacteroryzae)等30種,占比為49.18%;春秋間共有物種包括溫和氣單胞菌、短小芽孢桿菌等16種,占比為20.51%;夏秋間共有物種包括溫和氣單胞菌、短小芽孢桿菌等17種,占比為23.61%。此外,春夏秋3個季節(jié)的特有種分別為15、9、26個,秋季細菌特有屬最多,推測秋季細菌特異性顯著高于其余2個季節(jié)是導(dǎo)致秋季細菌群落多樣性較高的原因之一。

圖5 不同季節(jié)間細菌物種數(shù)與屬數(shù)的韋恩圖Fig.5 Venn diagrams of the number of bacterial species and genera in different seasons

春季水樣中,約氏不動桿菌與波波夫氣單胞菌(Aeromonaspopoffii)為優(yōu)勢種,相對豐度分別為15.21%、14.31%,出現(xiàn)頻率分別為100.00%、95.00%;夏季水樣中,優(yōu)勢種為約氏不動桿菌和腐敗希瓦氏菌(Shewanellaputrefaciens),相對豐度分別為27.17%、18.36%,出現(xiàn)頻率分別為100.00%、95.00%;秋季水樣中,膿毒假單胞菌(Pseudomonasanguilliseptica)的相對豐度最高,為9.58%。

根據(jù)方差分析結(jié)果,選擇LSD檢驗法來篩選在各季節(jié)間差異均達顯著水平的屬和種。檢驗結(jié)果表明,就屬而言,不動桿菌屬在3個季節(jié)間均存在極顯著差異(P<0.01),其余33個屬在3個季節(jié)間差異不顯著(P>0.05);就種水平而言,約氏不動桿菌在3個季節(jié)間均存在極顯著差異(P<0.01),中間氣單胞菌(Aeromonasmedia)在3個季節(jié)間均存在顯著差異(P<0.05)(圖6),其余85個種在3個季節(jié)間差異未達顯著水平(P>0.05)。

圖6 不同季節(jié)間存在顯著差異的物種的豐度熱圖Fig.6 Heatmap of species abundance that differ significantly in different seasons

2.4 納木措各季節(jié)可培養(yǎng)細菌群落分布及多樣性對理化參數(shù)的響應(yīng)

2.4.1水質(zhì)理化參數(shù)的季節(jié)性變化

細菌作為水體中重要的微生物類別,其多樣性及群落結(jié)構(gòu)會對水體理化參數(shù)的變化作出一定響應(yīng)。對各季節(jié)水體理化參數(shù)進行方差分析,根據(jù)方差分析結(jié)果選擇是否進一步對其進行兩兩比較。方差分析結(jié)果(圖7)顯示,電導(dǎo)率、鹽度、總?cè)芙夤腆w量、化學(xué)需氧量及總氮濃度在各季節(jié)間差異未達顯著水平。

圖7 不同季節(jié)間電導(dǎo)率、鹽度、總?cè)芙夤腆w量、化學(xué)需氧量與總氮濃度的差異比較Fig.7 Comparison of EC, Salinity, TDS, COD and TN in different seasons

其余5項理化參數(shù)在不同季節(jié)間存在顯著(P<0.05)或極顯著差異(P<0.01)。就pH值而言,春季最高,夏季與秋季較低,且在春夏間(P=0.017)、春秋間(P=0.019)均存在顯著差異;就溫度而言,夏季最高,春季最低,在春夏間(P=0.000)、春秋間(P=0.001)、夏秋間(P=0.000)均存在極顯著差異;氨氮濃度在春季較高,在夏季與秋季較低,且在春秋間存在顯著差異(P=0.021);總磷濃度同樣在春季較高,在夏季和秋季較低,且在春秋間存在顯著差異(P=0.020);就濁度而言,同樣在春季最高,在夏季與秋季最低,且在春夏間(P=0.018)、春秋間(P=0.018)均存在顯著差異(圖8)。

*表示P<0.05,***表示P<0.001。

2.4.2各季節(jié)可培養(yǎng)細菌群落分布對理化參數(shù)的響應(yīng)

使用物種-樣本數(shù)據(jù)進行去趨勢對應(yīng)分析(DCA),結(jié)果顯示前4軸最大值為3.9,因此單峰模型和線性模型均適用[19]。選擇單峰模型典范對應(yīng)分析(CCA)來探究水質(zhì)理化參數(shù)對不同季節(jié)細菌群落結(jié)構(gòu)的影響。

基于細菌豐度和理化參數(shù)的典范對應(yīng)分析結(jié)果見圖9。圖9剔除了對細菌群落分布影響不顯著的理化參數(shù)(電導(dǎo)率、鹽度及總氮濃度),保留了對細菌群落分布影響顯著的理化參數(shù)(總?cè)芙夤腆w量、總磷濃度、化學(xué)需氧量、溫度、濁度、氨氮濃度與pH值,P=0.038)。

圖9 不同季節(jié)細菌群落分布與環(huán)境因子的典范對應(yīng)分析Fig.9 Canonical correspondence analysis of bacterial community distribution and environmental factors in different seasons

對細菌群落分布影響最大的理化因子是總?cè)芙夤腆w量,其中化學(xué)需氧量與總?cè)芙夤腆w量具有協(xié)同作用,與春季、秋季細菌群落分布呈正相關(guān),與夏季細菌群落分布呈負相關(guān);氨氮濃度、總磷濃度、濁度與pH值表現(xiàn)出較為相似的分布特征,與春季細菌群落分布呈正相關(guān),與夏季和秋季細菌群落分布呈負相關(guān);溫度與夏季細菌群落分布呈正相關(guān),與春季和秋季細菌群落分布呈負相關(guān)。溫度與總?cè)芙夤腆w量、化學(xué)需氧量、濁度、總磷濃度、氨氮濃度及pH值呈負相關(guān),即水溫升高時,水體中有機質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)等含量均會下降。

2.4.3Mantel檢驗

采用Mantel檢驗分析水樣間細菌群落結(jié)構(gòu)差異與理化參數(shù)差異的相關(guān)性。通過Bray-curtis 距離確定細菌群落結(jié)構(gòu)的差異,通過歐氏距離確定理化參數(shù)的差異[18-19]。從表1可知,各季節(jié)間水溫、總?cè)芙夤腆w量、化學(xué)需氧量和濁度的差異與細菌群落結(jié)構(gòu)的差異呈極顯著相關(guān)(P<0.001);各季節(jié)間氨氮和總氮濃度的差異與細菌群落結(jié)構(gòu)的差異呈極顯著相關(guān)(P<0.01);而不同季節(jié)間pH值、電導(dǎo)率、鹽度及總磷濃度的差異與細菌群落結(jié)構(gòu)的差異間相關(guān)性未達顯著水平(P>0.05)。

表1 納木措細菌群落組成和環(huán)境變量的Mantel檢驗Table 1 Mantel test for bacterial community composition and environmental variables of Namco Lake

表2 水質(zhì)理化參數(shù)對細菌群落多樣性指數(shù)的逐步回歸分析Table 2 Stepwise regression analysis of water physicochemical parameters to bacterial community diversity index

2.4.4納木措水體可培養(yǎng)細菌群落多樣性指數(shù)與理化參數(shù)的多元逐步回歸分析

將物種數(shù)、屬數(shù)、總豐度、Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)及Pielou均勻度指數(shù)這6項群落多樣性指數(shù)作為因變量,將pH值、溫度、電導(dǎo)率、鹽度、總?cè)芙夤腆w量、化學(xué)需氧量、氨氮濃度、總氮濃度、總磷濃度及濁度這10項理化參數(shù)作為自變量,依據(jù)赤池信息量準則,使用多元逐步回歸分析建立各多樣性指數(shù)與理化參數(shù)間的最優(yōu)模型,得到多元回歸方程。將上述10項自變量依次引入不同因變量的模型中,進行逐步篩選,在顯著性水平為0.05時,有些自變量的回歸系數(shù)不顯著,故將其剔除后重新計算回歸結(jié)果。

結(jié)果顯示,就物種數(shù)(Y1)而言,引入回歸方程中的理化參數(shù)為溫度(X1)、化學(xué)需氧量(X2)和總磷濃度(X3),物種數(shù)與其最優(yōu)理化參數(shù)間的多元一次回歸方程為Y1=17.784-0.617X1+0.008X2+68.944X3;就屬數(shù)(Y2)而言,引入回歸方程中的理化參數(shù)有溫度(X1)、總?cè)芙夤腆w量(X4)、鹽度(X5)、化學(xué)需氧量(X2)和總磷濃度(X3),屬數(shù)與其最優(yōu)理化參數(shù)間的多元一次回歸方程為Y2=12.341-0.437X1-0.078X4+0.112X5+0.005X2+39.04X3;對于Shannon-Wiener多樣性指數(shù)(Y3),引入回歸方程中的理化參數(shù)有化學(xué)需氧量(X2)及總磷濃度(X3),回歸方程為Y3=2.098+0.000 4X2+3.802X3。上述3個線性回歸模型的統(tǒng)計檢驗P值均小于0.05,說明這3個回歸方程具有統(tǒng)計學(xué)意義,所得到的回歸模型成立且為最優(yōu)方程。

3 討論

3.1 納木措水體水質(zhì)分析

方差分析結(jié)果顯示,各項理化參數(shù)在各季節(jié)間存在不同程度差異,表明納木措水質(zhì)理化參數(shù)存在季節(jié)性變化?？傮w而言,總氮、總磷等營養(yǎng)鹽濃度相對較低,氨氮質(zhì)量濃度為 0.19 mg·L-1,總氮質(zhì)量濃度為0.43 mg·L-1,總磷質(zhì)量濃度為0.02 mg·L-1,根據(jù)GB 3838—2002《國家地表水環(huán)境質(zhì)量標準》,上述3項水體理化指標均符合國家地表水Ⅱ類水質(zhì)標準,說明納木措水質(zhì)營養(yǎng)水平較低,但化學(xué)需氧量高于限值。

究其原因,一方面可能由于采樣點位于沿岸區(qū)域,水位偏低,用水樣采集器取樣時不可避免地將底泥混入水樣中;另一方面可能是采樣點周圍為牧區(qū),有牦牛、羊等家畜在此排泄糞便。水質(zhì)季節(jié)變化一定程度上受到季節(jié)性徑流和溫度變化的影響[20],夏季為西藏地區(qū)的雨季,降雨量大且溫度較高,使得積雪和冰川融化,降雨徑流與冰川、積雪融水流經(jīng)山前地帶匯入納木措湖泊,使得水體理化指標有所變化。溫度是氣候變化的主要影響因素之一,不僅會直接影響水體微生物的代謝速率,而且還會通過改變水體中溶解氧量來改變水體微生物的新陳代謝過程,從而影響水質(zhì)變化[21]。該研究中,總氮、總磷與氨氮濃度均為春季高于夏季和秋季,這與王倩等[21]研究結(jié)果相似,這可能與湖泊水溫有關(guān),春季水樣的采集于5月進行,采樣時湖冰剛消融,水溫較低,低溫使得水體細菌的代謝活動減弱,細菌消耗水體中總氮、總磷等營養(yǎng)物質(zhì)的能力較弱,因此這些營養(yǎng)物質(zhì)在春季的濃度相較于夏季和秋季偏高。

3.2 納木措水體可培養(yǎng)細菌群落組成

該研究中分離到的所有菌株均隸屬于放線菌門、擬桿菌門、厚壁菌門及變形菌門,其中變形菌門為優(yōu)勢菌門,這與已有研究結(jié)果相似[22]。變形菌門是水環(huán)境中重要的原核生物,普遍存在于水環(huán)境中。有研究表明,其在濕地、養(yǎng)殖廢水和深海沉積物等環(huán)境中同樣以第一優(yōu)勢門存在[23-25]。放線菌門和擬桿菌門是水體重要的微生物,承擔(dān)著水體基本功能。擬桿菌門是腸道中數(shù)量最多的革蘭氏陰性菌,普遍存在于污水處理過程中,主要分解溶解性有機物[26],16S rRNA基因序列的差異能夠指示水體受糞源污染程度[27],而其中的鞘脂桿菌目(Sphingobacteriales)在海洋等高鹽濃度環(huán)境下的細菌物種組成中占有較大比例,可以降解纖維素[28]。該研究水樣中鞘脂桿菌目在夏季的出現(xiàn)頻率高于春季和秋季,而夏季氣溫、水分等條件適宜,納木措沿岸區(qū)域植被豐茂,有較多馬、牛、羊等家畜在湖岸活動及排便,因此鞘脂桿菌目在夏季出現(xiàn)頻率高可能與水體受動物糞源污染的程度有關(guān)。

3.3 納木措水體可培養(yǎng)細菌多樣性分析

方差分析結(jié)果顯示,各項群落多樣性指數(shù)在季節(jié)間存在不同程度差異。總豐度在夏季最高,秋季最低。夏季平均水溫較高,藻類、水生生物及微生物生長活躍,因此細菌總豐度達到最大值,這與王雪等[29]研究結(jié)果相似。究其原因,可能是夏季降雨量大且周圍有冰川與積雪融水匯入湖泊中,將周邊土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)帶入水中,從而改變了湖泊理化性質(zhì)[30],理化參數(shù)的變化使得細菌群落發(fā)生改變,從而對總豐度造成了影響[31]。秋季氣溫逐漸降低,水體中微生物數(shù)量也有所變化。Shannon-Wiener 多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)及Pielou均勻度指數(shù)在各季節(jié)間的變化趨勢一致,均為夏季<春季<秋季。有研究認為,夏季細菌物種多樣性最高[19,32],而筆者研究結(jié)果與其相反,即夏季細菌物種多樣性最低,一方面可能因為夏季為研究區(qū)雨季,降水量大,且夏季溫度較高會導(dǎo)致山上積雪融化,融水流入湖中會對湖水產(chǎn)生擾動,使得水體擴散能力增強,導(dǎo)致水體同質(zhì)化,進一步促進細菌群落結(jié)構(gòu)的同質(zhì)化;另一方面可能因為夏季為旅游旺季,該期間人為影響較大,可能會破壞湖水中細菌的正常群落結(jié)構(gòu)[33],進而影響水體細菌物種多樣性。由主坐標分析等結(jié)果可知,納木措水體春夏間細菌群落結(jié)構(gòu)相似度較高,而春秋間、夏秋間相似度較低。一方面可能是由于春季氣候開始轉(zhuǎn)暖,夏季氣溫較高,山上的積雪等融水在匯入湖泊時往往會帶入大量土壤、沙石等物質(zhì),使得湖水理化特征趨于同質(zhì)化,進一步改變其細菌群落組成;另一方面可能是由于春夏兩季湖泊沿岸區(qū)域植被茂盛,家畜放牧較多,且家畜會在岸邊飲水、排便等,這些活動在一定程度上也會對水體細菌的群落組成造成干擾。

3.4 納木措水體理化因子對細菌群落的影響

筆者研究中,溫度對細菌群落分布有著一定程度的影響。隨著溫度的升高,細菌細胞中生化反應(yīng)速率和生長速率均會加快,但溫度超過一定數(shù)值也會使細胞結(jié)構(gòu)和功能受到影響[34]。細菌生長同樣需要一個合適的酸堿環(huán)境,不同類別的細菌有其最適宜的pH范圍。LANGENHEDER等[35]研究發(fā)現(xiàn),細菌在酸性湖泊中生長會受到抑制,表明不同 pH值對細菌群落結(jié)構(gòu)有一定的選擇性。該研究中,采樣點均屬于弱堿性環(huán)境,適合大部分細菌生長,同時也存在一定的梯度,會對細菌群落分布有一定的選擇性。湖水營養(yǎng)鹽濃度對細菌群落結(jié)構(gòu)也有重要影響,研究表明若湖泊營養(yǎng)水平較低,營養(yǎng)鹽濃度可能會影響細菌生長[36],筆者研究結(jié)論與其一致。

4 結(jié)論

通過傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)從納木措3個季節(jié)水樣中分離到1 877株可培養(yǎng)細菌,隸屬于4門7綱15目26科34屬87種,可見納木措水體可培養(yǎng)細菌資源較豐富。對細菌群落多樣性季節(jié)差異及其理化影響因素的分析結(jié)果顯示,細菌總豐度在夏季最高、秋季最低,Shannon-Wiener多樣性指數(shù)、Simpson優(yōu)勢度指數(shù)及Pielou均勻度指數(shù)均在秋季最高、夏季最低,總?cè)芙夤腆w量是對各季節(jié)細菌群落分布影響最大的理化參數(shù),各季節(jié)間總?cè)芙夤腆w量、溫度、化學(xué)需氧量和濁度的差異與細菌群落結(jié)構(gòu)的差異呈極顯著相關(guān)。