重慶部分地區(qū)山羊場(chǎng)藍(lán)舌病流行情況調(diào)查

張邑帆，鄭 華，張素輝

（重慶市畜牧科學(xué)院，重慶市獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，國家動(dòng)物疫病重慶觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站，重慶 榮昌 402460）

羊藍(lán)舌病是一種病毒性疾病，是由藍(lán)舌病病毒（BTV）感染造成的，因患病羊的舌頭呈藍(lán)紫色而被命名為羊藍(lán)舌病?；疾?dòng)物的血液和精液中均含有大量病毒［1］，可以通過吸血昆蟲傳播病原［2］。由于精液中含有大量病毒，可以在公母羊交配時(shí)將疾病傳播給對(duì)方。對(duì)于妊娠期的母羊，該病極易造成流產(chǎn)與死胎。藍(lán)舌病毒的血清型有多種，疫苗免疫非常困難，免疫效果不理想，但是科學(xué)化飼養(yǎng)管理可以有效降低藍(lán)舌病的患病率。

國家動(dòng)物疫病重慶觀測(cè)實(shí)驗(yàn)站于2021 年3月～2023 年6 月對(duì)重慶市6 個(gè)區(qū)縣的35 個(gè)山羊場(chǎng)進(jìn)行全血樣品采集，應(yīng)用RT-nested PCR 方法進(jìn)行BTV檢測(cè)，分析各區(qū)縣羊群的BTV感染情況及流行特點(diǎn)，為防控該病提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品 1 771份山羊全血樣品分別于2021年3月～2023年6月采集自重慶榮昌、石柱、彭水、酉陽、長(zhǎng)壽和武隆共6個(gè)區(qū)縣的35個(gè)山羊場(chǎng)，每半年采集一次，故2023年下半年的樣品未采集。

1.2 主要試劑 病毒DNA/RNA 提取試劑盒，購自西安天隆科技有限公司；DL2000 DNA Marker，2×Taq PCR MasterMix，購自寶生物工程（大連）有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑：HiScript II One Step RT-PCR 試劑盒購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)GenBank 發(fā)表的BTV及相關(guān)病毒的基因序列，目的基因片段大小為100 bp，引物序列為：BTV-A：5′-GTTCTCTAGT TGGCAACCACC-3′；BTV-B：5′-AAGCCAGACTG TTTCCCGAT-3′；BTV-C：5′-GCAGCATTTTGAGA GAGGGA-3′；BTV-D：5′-CCCGATCATACATTGC TTCCT-3′。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.3.2 RNA 提取 本試驗(yàn)使用全自動(dòng)核酸提取儀進(jìn)行RNA 提取，按照試劑盒要求在試劑盒加樣孔內(nèi)加入200 μL羊血樣品、20 μL蛋白酶K，在磁珠孔插入攪拌套后放入全自動(dòng)核酸提取儀內(nèi)進(jìn)行RNA 提取。等操作完成后，用移液器移出50 μL RNA模板到1.5 mL離心管內(nèi)備用。

1.3.3 RT-PCR 擴(kuò)增 反應(yīng)體系（20 μL）：上述提取的RNA 模板5 μL，BTV-A、B 引物各0.5 μL，2×One Step Mix 10 μL，One Step Enzyme Mix 1μL，ddH2O 3μL。反應(yīng)條件：50 ℃反轉(zhuǎn)錄30 min；95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性30 s、55 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。

1.3.4 PCR擴(kuò)增 反應(yīng)體系（25 μL）：上述擴(kuò)增的RT-RCR產(chǎn)物模板1 μL，BTV-C、D引物各0.5 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s、51 ℃退火30 s、72 ℃延伸20 s，共30 次循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，電泳緩沖液為1×TAE，電泳條件為110 V 30 min，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存，陽性對(duì)照片段大小為100 bp。

2 結(jié)果

2.1 不同區(qū)縣BTV檢測(cè)結(jié)果 2021～2023年對(duì)重慶6個(gè)區(qū)縣35個(gè)山羊場(chǎng)的1 771份山羊全血樣品進(jìn)行BTV 檢測(cè)，結(jié)果得出：總樣品陽性率為6.2%（109/1 771），場(chǎng)陽性率為42.9%（15/35）；榮昌的樣品陽性率為9.6%（29/303），石柱的樣品陽性率為3.8%（13/344），彭水的樣品陽性率為2.9%（9/310），酉陽的樣品陽性率為11.1%（36/325），長(zhǎng)壽的樣品陽性率為6.5%（20/306），武隆的樣品陽性率為1.1%（2/183）。詳見表1。

表1 重慶部分區(qū)縣的BTV檢測(cè)結(jié)果

2.2 2021～2023年BTV檢測(cè)結(jié)果 由表2可知，2021年樣品陽性率為4.9%（31/631），2022年樣品陽性率為8.6%（66/766），2023 年樣品陽性率為3.2%（12/374）。

表2 2021～2023年BTV檢測(cè)結(jié)果

2.3 某山羊場(chǎng)BTV檢測(cè)電泳圖 由圖1可知，待檢測(cè)的22 個(gè)樣品中，有7 個(gè)樣品的BTV 為陽性（編號(hào)：2、3、4、12、14、15、17）。

圖1 某山羊場(chǎng)BTV檢測(cè)電泳圖

3 討論

羊藍(lán)舌病主要是BTV 引起的一種嚴(yán)重侵害反芻動(dòng)物的傳染病，主要由吸血昆蟲傳播。羊藍(lán)舌病會(huì)造成母羊流產(chǎn)，嚴(yán)重的會(huì)引起吞咽困難和呼吸困難，部分羊還會(huì)出現(xiàn)便秘或者腹瀉。

由于公羊的精液和妊娠母羊的胎盤都能造成垂直傳播，引起羔羊患病，因此，每一頭羊都要給予嚴(yán)格的檢查，對(duì)患病羊需要及時(shí)淘汰，嚴(yán)重者可及時(shí)撲殺，防止造成更多健康羊感染。在夏季，圈舍需要做滅蠅滅蟲處理。

重慶酉陽土家族苗族自治縣和榮昌區(qū)感染BTV 的陽性率最高，分別為11.1%和9.6%。榮昌和酉陽相比，榮昌的場(chǎng)陽性率為25%（2/8），酉陽的場(chǎng)陽性率為75%（3/4），榮昌有2個(gè)場(chǎng)的感染相當(dāng)嚴(yán)重。經(jīng)過調(diào)查，發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)區(qū)縣的幾個(gè)山羊場(chǎng)有兩個(gè)共同點(diǎn)：一是從其他地區(qū)引進(jìn)山羊進(jìn)行品種改良，可能將病毒不小心帶入健康羊舍；二是沒有對(duì)感染山羊進(jìn)行及時(shí)淘汰，只進(jìn)行了隔離，故陽性率偏高。BTV樣品陽性率最低的是武隆區(qū)，為1.1%（2/183），分析原因如下：一是科學(xué)的飼養(yǎng)管理，夏季圈舍的滅蠅滅蟲工作做得好；二是武隆區(qū)的樣品數(shù)偏低。

目前，對(duì)BTV流行情況的調(diào)查基本上只針對(duì)抗體，而沒有對(duì)抗原的調(diào)查。有文獻(xiàn)報(bào)道內(nèi)蒙古的BTV 陽性率為4.17%［3］，新疆的BTV 陽性率為6.79%［4］，廣西的BTV 陽性率為20.5%［5］。受時(shí)間和人力的限制，此次調(diào)查選擇的區(qū)縣較少，可能與全重慶市的實(shí)際情況存在一定差異。今后，我們會(huì)持續(xù)開展BTV感染情況調(diào)查，掌握BTV在重慶地區(qū)的流行趨勢(shì)，為重慶地區(qū)BTV的防控工作提供科學(xué)依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究調(diào)查了重慶市6 個(gè)區(qū)縣的35 個(gè)山羊場(chǎng)，共采集1 771 份山羊全血樣品，通過檢測(cè)，得出BTV樣品總陽性率為6.2%（109/1 771），總體水平偏低。